源自棉鈴蟲的2-十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種源自棉鈴蟲細(xì)胞色素CYP6B2基因的2-十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子序列和5’非翻譯區(qū)，以及含有上述序列的真核細(xì)胞表達(dá)載體與細(xì)胞系。本發(fā)明的啟動子和5’非翻譯區(qū)，可用于真核基因的高效表達(dá)，用于獲得低豐度基因研究，對棉鈴蟲植物次生性物質(zhì)誘導(dǎo)型啟動子的研究為研究害蟲與植物次生物質(zhì)的互作以及開發(fā)新型抗蟲新品種奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】源自棉鈴蟲的2-十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物次生物質(zhì)誘導(dǎo)性啟動子領(lǐng)域，具體地說，涉及源自棉鈴蟲細(xì)胞色素CYP6B2基因的2-十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子。
【背景技術(shù)】
[0002]棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)是造成農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的重要害蟲,其危害范圍相當(dāng)廣泛，包括棉花、番茄、玉米、小麥、大豆、花生、水稻等60多種栽培作物和67種野生植物。
[0003]植食性昆蟲以各種取食策略從寄主植物獲取營養(yǎng)。但是植物并不是被動的受害者，會針對植食性昆蟲產(chǎn)生植物次生性物質(zhì)或防御蛋白，植物也會釋放揮發(fā)性物質(zhì)引誘捕食性天敵取食害蟲。2-十三烷酮是廣泛存在于茄科植物中的一種防御性植物次生物質(zhì)，以野生番茄中含量為最高。番茄作為棉鈴蟲的寄主植物，前期研究發(fā)現(xiàn)番茄中含有的植物次生物質(zhì)2-十三烷酮能夠誘導(dǎo)棉鈴蟲中的解毒酶基因CYP6B2的高表達(dá)，這可能是棉鈴蟲利用2-十三烷酮作為化學(xué)感應(yīng)信號來啟動其防御機(jī)制進(jìn)而應(yīng)對2-十三烷酮脅迫的重要生理機(jī)能。
[0004]基因表達(dá)的調(diào)控在幾個環(huán)節(jié)都有可能發(fā)生，涉及到DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平以及翻譯后水平的調(diào)控等，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是最普遍的調(diào)控方式。關(guān)于植物次生性物質(zhì)誘導(dǎo)昆蟲P450基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的研究主要集中在對其順式調(diào)控元件和反式作用因子方面的研究，啟動子上的順式調(diào)控元件被認(rèn)為在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)上發(fā)揮著重要作用，反式作用因子 與啟動子上的順式調(diào)控元件相互作用調(diào)控基因的表達(dá)。如在CYP6B家族基因啟動子的XRE-AhR (異類芳香烴受體化合物應(yīng)答元件)、AhR, XRE-Xan (花椒毒素應(yīng)答元件)順式調(diào)控元件具有較高的同源性，這類元件與有毒物質(zhì)及植物次生性物質(zhì)代謝相關(guān)，進(jìn)一步說明了 CYP6B家族基因的表達(dá)與植物次生性物質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)具有密切關(guān)系。在北美黑條黃鳳蝶中代謝呋喃香豆素的P450基因CYP6B4和CYP6B1中存在EcRE/ARE/XRE-xan元件，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在花椒毒素或苯并芘誘導(dǎo)下調(diào)控CYP6B4基因的過量表達(dá)(Mcdonne C.M., Browna B.R., Berenbauma M.R., Schuler Μ.A., 2004.Conservedregulatory elements in the promoters of two allelochemical-1nducible cytochromeP450genes differentially regulate transcription.1nsect Biochemistry andMolecular Biology, 34(10):1129-1139.)。
[0005]因此，目的基因過量表達(dá)受基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，其順式調(diào)控元件可能調(diào)控目的基因的表達(dá)，這也顯示出棉鈴蟲CYP6B2基因的啟動子極可能具有較高的2-十三烷酮誘導(dǎo)活性，這類誘導(dǎo)型啟動子在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激下，能夠快速有效地誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，來抵御脅迫的影響。目前，分離和鑒定的棉鈴蟲植物次生性物質(zhì)誘導(dǎo)型啟動子并不多。對于新的高活性的棉鈴蟲植物次生物質(zhì)相關(guān)啟動子的克隆及誘導(dǎo)活性的鑒定，對進(jìn)一步確定棉鈴蟲中與植物次生物質(zhì)2-十三烷酮有關(guān)的轉(zhuǎn)錄元件及轉(zhuǎn)錄因子的研究具有重要意義，由于植物次生性物質(zhì)是決定昆蟲能否取食某種植物的主要因子之一，因此對棉鈴蟲植物次生性物質(zhì)誘導(dǎo)型啟動子的研究為研究害蟲與植物次生物質(zhì)的互作以及開發(fā)新型抗蟲新品種奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種來源于棉鈴蟲細(xì)胞色素P450CYP6B2基因的植物次生物質(zhì)2-十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子序列，該啟動子序列能夠誘導(dǎo)目的基因聞水平表達(dá)。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種2-十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子，所述啟動子序列包含相對于SEQ ID N0.1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-1bp至_2179bp區(qū)的DNA核苷酸序列。
[0008]進(jìn)一步地，所述啟動子序列源自棉鈴蟲細(xì)胞色素CYP6B2基因。
[0009]本發(fā)明還提供一種棉鈴蟲細(xì)胞色素CYP6B2基因的5’非翻譯區(qū)，所述5’非翻譯區(qū)包含相對于SEQ ID N0.1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+Ibp至+41bp區(qū)的DNA核苷酸序列。[0010]本發(fā)明還提供含有前述啟動子序列和前述5’非翻譯區(qū)序列的真核細(xì)胞表達(dá)載體。
[0011]進(jìn)一步地，所述載體為用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的誘導(dǎo)型載體。
[0012]在本發(fā)明實(shí)施例中，本發(fā)明用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的誘導(dǎo)型載體為pGL4.1-proCYP6B2，所述棉鈴蟲CYP6B2的啟動子和5’非翻譯區(qū)在表達(dá)載體中位于載體上外源報告基因的前面。本發(fā)明提供通過插入本發(fā)明所述棉鈴蟲CYP6B2基因的啟動子和5’非翻譯區(qū)至含有Luciferase報告基因的載體(pGL4.lbasic)中而構(gòu)建的pGL4.l_proCYP6B2。但是,所述Luciferase報告基因是外源基因，并預(yù)期可以用任意其它有用的外源基因來代替。
[0013]本發(fā)明還提供含有前述載體的細(xì)胞系。
[0014]作為優(yōu)選，所述細(xì)胞系為植物次生物質(zhì)誘導(dǎo)型瞬時表達(dá)的棉鈴蟲脂肪體細(xì)胞系。也可以用其他類似昆蟲細(xì)胞系代替。
[0015]本發(fā)明還提供一種含有2-十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子的基因序列，所述基因序列如SEQ ID N0.1 所示。
[0016]本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增包含SEQ ID N0.1序列的DNA片段的PCR引物對，所述引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。
[0017]本發(fā)明還提供前述啟動子或前述基因序列在真核細(xì)胞中進(jìn)行2-十三烷酮誘導(dǎo)表達(dá)中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:
[0019]本發(fā)明所述啟動子序列可用于真核基因的高效表達(dá)，用于獲得低豐度基因研究，對棉鈴蟲植物次生性物質(zhì)誘導(dǎo)型啟動子的研究為研究害蟲與植物次生物質(zhì)的互作以及開發(fā)新型抗蟲新品種奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明所述的棉鈴蟲細(xì)胞色素CYP6B2基因的2_十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子和5’非翻譯區(qū)的DNA序列。
[0021]圖2為本發(fā)明CYP6B2_pro PCR電泳圖；
[0022]其中，M:DL15000+2000marker ；1~2:CYP6B2 基因的 5’ 側(cè)翼區(qū)序列。
[0023]圖3為本發(fā)明pGL4-CYP6B2_pro載體構(gòu)建示意圖。
[0024]圖4為本發(fā)明CYP6B2_pro連pGL4.1basic酶切鑒定電泳圖；[0025]其中，M:DL15000+2000marker ；1~2:pGL4.l-CYP6B2Pro 重組質(zhì)粒經(jīng) MluI 和 XhoI雙酶切電泳結(jié)果。
[0026]圖5為本發(fā)明添加2-十三烷酮后CYP6B2_pro啟動報告基因Luciferase活性的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0028]實(shí)施例1棉鈴蟲CYP6B2基因的2_十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子的克隆
[0029]棉鈴蟲CYP6B2的啟動子(啟動子序列包含相對于SEQ ID NO:1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-1bp至-2179bp區(qū)的DNA核苷酸序列)，在棉鈴蟲CYP6B2基因的5’側(cè)翼區(qū)序列中得到鑒定。
[0030]棉鈴蟲CYP6B2基因登錄在NCBI GenBank (登錄號:U18085.1)，序列表顯示本發(fā)明上述基因的植物次生性物質(zhì)2-十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子和5’非翻譯區(qū)的DNA序列。在本發(fā)明的啟動子序列表中(見圖1)，推測的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(http://www.fruitfly.0rg/seq_tools/promoter, html)堿基A用+1示出,ATG用雙下劃線標(biāo)出，TATA盒用波浪線標(biāo)出。并用啟動子分析網(wǎng)站(http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html#pmatch)分析了啟動子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中一些重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(Nrf2: MafK; Nrf2 )用下劃線標(biāo)出。以棉鈴蟲基因組DNA為模板，染色體步移法擴(kuò)增得到目的基因CYP6B2的5’側(cè)翼區(qū)序列，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出長度約為2500bp的條帶(圖2)，并進(jìn)行回收。回收片段與PMD18-T載體連接得到重組質(zhì)粒pMD18-T-CYP6B2Proh后進(jìn)行測序，測序結(jié)果與CYP6B2基因序列進(jìn)行比對，去除與CYP6B2基因序列重疊部分，得到CYP6B2基因5’側(cè)翼序列，運(yùn)用生物信息分析軟件分析得出CYP6B2基因5’側(cè)翼序列包含全長為2179bp的CYP6B2基因的啟動子序列以及41bp的CYP6B2基因的5’非翻譯區(qū)。圖1顯示棉鈴蟲細(xì)胞色素CYP6B2基因的2-十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子和5’非翻譯區(qū)的DNA序列，在圖1中，蛋白合成的起始密碼子‘ATG’用雙下劃線標(biāo)出，TATA盒用波浪線標(biāo)出，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基‘A’用‘+I’標(biāo)出，并加黑表示。
[0031]更具體地說，通過染色體步移法PCR擴(kuò)增克隆得到2179bp的棉鈴蟲CYP6B2基因的啟動子序列和41bp的5’非翻譯區(qū)序列，擴(kuò)增上述PCR產(chǎn)物所需引物詳細(xì)顯示在表1中。對于 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序:95V 3min ；95°C 30S,52°C 30S,72°C 2min，32 個循環(huán)；72°C IOmin0
[0032]表1:引物
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種2-十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子，其特征在于，所述啟動子序列包含相對于SEQ IDN0.1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-1bp至-2179bp區(qū)的DNA核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于，所述啟動子序列源自棉鈴蟲細(xì)胞色素CYP6B2 基因。
3.一種棉鈴蟲細(xì)胞色素CYP6B2基因的5’非翻譯區(qū)，其特征在于，所述5’非翻譯區(qū)包含相對于SEQ ID N0.1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+Ibp至+41bp區(qū)的DNA核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求1所述啟動子序列和權(quán)利要求3所述5’非翻譯區(qū)序列的真核細(xì)胞表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于，所述載體為用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的誘導(dǎo)型載體。
6.含有權(quán)利要求4或5所述載體的細(xì)胞系。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系為棉鈴蟲脂肪體細(xì)胞系。
8.一種含有2-十三烷酮誘導(dǎo)型啟動子的基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQID N0.1 所示。
9.用于擴(kuò)增包含SEQID N0.1序列的DNA片段的PCR引物對，其特征在于，所述引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。
10.權(quán)利要求1或2所述的啟動子或權(quán)利要求8所述的基因序列在真核細(xì)胞中進(jìn)行2-十三烷酮誘導(dǎo)表達(dá)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/10GK103952409SQ201410158435
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】高希武, 張雷, 路瑤, 趙倩, 劉曉嵐 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)