一株好氧反硝化細菌菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株好氧反硝化細菌菌株，該細菌命名為克雷伯氏菌屬細菌(Klebsiella?sp.)HLNR05，并于2013年12月保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為：(GCMCC?No.8539)；菌株能在好氧條件下進行反硝化作用，對模擬富營養(yǎng)化廢水也有較強的脫氮效果，為治理污染的水體進行生物法脫氮治理提供一種良好的微生物材料。
【專利說明】一株好氧反硝化細菌菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域的細菌，尤其涉及一株好氧反硝化細菌菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]硝酸鹽是造成水體富營養(yǎng)化的主要污染物之一。硝酸鹽污染不但影響地表水，還對地下水造成污染，被硝酸鹽污染的飲用水還會直接危害人類健康。目前解決水體中氮素污染的方法有物理、化學(xué)和生物方法。隨著氮素污染的不斷加劇和人們對環(huán)境問題的日益重視，除氮技術(shù)，特別是生物脫氮技術(shù)已經(jīng)成為控制水體污染的重要方向和手段。人們目前普遍認(rèn)為，在生物脫氮過程中，硝酸鹽氮在缺氧條件下被反硝化細菌還原為氣態(tài)氮如N2等從水中逸出。事實上，厭氧條件下氧氣的不足大大限制了細菌的生長與代謝，造成傳統(tǒng)的反硝化效率不高。同時，由于硝化作用是在好氧條件下進行的，在同一反應(yīng)體系中硝化、反硝化作用嚴(yán)重不同步，影響了污水的徹底脫氮。
[0003]好氧反硝化是指在有氧條件下進行反硝化的過程。好氧反硝化細菌的發(fā)現(xiàn)，突破了傳統(tǒng)理論的認(rèn)識，為生物脫氮技術(shù)提供了一種嶄新的思路。然而，目前關(guān)于好氧反硝化菌發(fā)現(xiàn)的文章和專利報道不多，而且相關(guān)菌株的脫氮效果不高且應(yīng)用范圍有限。
[0004]本發(fā)明公布的好氧反硝化菌株能在好氧條件下進行反硝化作用，對模擬富營養(yǎng)化廢水也有較強的脫氮效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種好氧反硝化菌株。為治理污染的水體進行生物法脫氮治理提供一種良好的微生物材料。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，尋找分離出一種好氧反硝化菌株，該細菌命名為克雷伯氏菌屬細菌(Klebsiella sp.)HLNR05，并于2013年12月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為:(GCMCC N0.8539)。
[0007]該菌株的生物學(xué)特性為:革蘭氏染色反應(yīng)呈陰性，葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸、硝酸鹽還原、淀粉水解、產(chǎn)氨試驗呈陽性，甲基紅試驗(M.R.)呈陰性，石蕊牛奶試驗結(jié)果為產(chǎn)酸。在LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5d時的菌落直徑大約為4mm，圓形，邊緣整齊；菌落呈乳白色，質(zhì)地均勻，有光澤，表面濕潤光滑，凸起，正反面均勻一致。最適宜pH值為7.2，最適溫度28°C。
[0008]本發(fā)明所涉及的好氧反硝化細菌是通過以下方法分離篩選得到:
[0009](I)于江西省吉水縣新源污水廠氧化溝中采集的活性污泥樣品10g，樣品采集后加入到盛有玻璃珠的IOOmL無菌水中，充分混勻并靜置30min后，取ImL上清液轉(zhuǎn)移至IOOmL含硝酸鹽的富集培養(yǎng)基三角瓶中，將該培養(yǎng)基置入28°C溫度，振動頻率為200rpm /min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。4d后取ImL菌液于99mL滅菌的含硝酸鹽的富集培養(yǎng)基中，在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4d，接著按同樣的操作重復(fù)3次，進行4個周期的富集培養(yǎng)。
[0010](2)取步驟(1)中的第4周期獲得的菌液lmL，加到硝酸鹽濃度提高50%的馴化培養(yǎng)基中，進行4個周期的馴化培養(yǎng)，接種量和培養(yǎng)條件同富集培養(yǎng)。獲得馴化培養(yǎng)液。
[0011](3)從步驟⑵中獲得的馴化培養(yǎng)液中取菌液5份，每份為lmL，分別進行梯度稀釋，選用梯度為ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—7 ;從每份中分別取0.1mL所得的稀釋菌液分別涂布于含有含硝酸鹽的固體平板培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2d。
[0012](4)用已滅菌的移液槍頭從步驟(3)的平板培養(yǎng)基上挑取較大而且獨立的菌落，采用劃線法接種于LB固體培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)。通過3次劃線獲得單菌落。單菌落在新鮮LB培養(yǎng)基中再進行擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)后的菌種，部分置于_80°C冰箱內(nèi)保種，部分置于4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0013]本發(fā)明一種好氧反硝化菌株的有益效果在于:菌株對廢水中硝態(tài)氮和總氮有較強的降解能力，環(huán)境適應(yīng)能力較強，對模擬富營養(yǎng)化廢水具有強好的降氮效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為本發(fā)明一種好氧反硝化細菌菌株HLNR05的反硝化活性曲線圖；
圖2為本發(fā)明一種好 氧反硝化細菌菌株HLNR05同相近序列采用N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹圖；
圖3為本發(fā)明一種好氧反硝化細菌菌株HLNR05在模擬富營養(yǎng)化廢水中的解氮效果圖。
【具體實施方式】
[0014]實施例一
[0015]菌株(Klebsiellasp.)HLNRO5 的分離:
[0016](I)于江西省吉水縣新源污水廠氧化溝中采集的活性污泥樣品10g，樣品采集后加入到盛有玻璃珠的IOOmL無菌水中，充分混勻并靜置30min后，取ImL上清液轉(zhuǎn)移至IOOmL含硝酸鹽的富集培養(yǎng)基的三角瓶中，將該培養(yǎng)基置入28°C溫度，振動頻率為200rpm / min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。4d后取ImL菌液于99mL滅菌的含硝酸鹽(N濃度139mg / L)的富集培養(yǎng)基中，在上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)4d，接著按同樣的操作重復(fù)3次，進行4個周期的富集培養(yǎng)。
[0017](2)取步驟(1)中的第4周期獲得的菌液lmL，加到硝酸鹽濃度提高50%的馴化培養(yǎng)基中，進行4個周期的馴化培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同富集培養(yǎng)，獲得馴化培養(yǎng)液。
[0018](3)從步驟⑵中獲得的馴化培養(yǎng)液中取菌液5份，每份為lmL，分別進行梯度稀釋，選用梯度為ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—7 ;從每份中分別取0.1mL所得的稀釋菌液分別涂布于含有含硝酸鹽的固體平板培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2d。
[0019](4)用已滅菌的移液槍頭從步驟(3)的平板培養(yǎng)基上挑取一株較大而且獨立的菌落，采用劃線法接種于LB固體培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)。通過3次劃線獲得單菌落。單菌落在新鮮LB培養(yǎng)基中再進行擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)后的菌種，部分置于_80°C冰箱內(nèi)保種，部分置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020]上述富集培養(yǎng)基，是指以硝酸鹽(Ν03_-Ν)為氮源的富集培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含以下物質(zhì)組份和條件:葡萄糖 5g, KNO3Ig, K2HPO40.5g, KCI63mg、MgS0423mg、無水 CaCl223mg、NaHC0365mg、KH2P0423mg、微量元素溶液 2mL，蒸餾水 lOOOmL，pH7.2。
[0021]上述LB培養(yǎng)基:包含有蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg，pH7.2。[0022]上述固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂粉。
[0023]上述微量元素溶液，其配方(g.I/1)為:ZnS042.2，CaCl25.5，MnCl2.4Η205.06，F(xiàn)eSO4.7Η205.0, CuSO4.SH2Ol.57，COCl2.6Η201.61。
[0024]實施例二.[0025]菌株HLNR05的反硝化活性檢測:
[0026](I)從上述菌株(Klebsiella sp.)HLNR05的分離的第(4)步驟中獲得的菌株按I: 100的量分別接種于IOOmL新鮮的反硝化培養(yǎng)基中，于28°C、200rpm / min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1山且按時檢測培養(yǎng)基中硝酸鹽氮(NO3-N)以及總N濃度；以此同時設(shè)置空白對照組。其中，Ν03_-Ν采用鹽酸-萘乙二胺分光光度法；TN采用過硫酸鉀-紫外分光光度法。
[0027]上述硝酸鹽(Ν03_-Ν)為氮源的硝化培養(yǎng)基:葡萄糖169mg，KN0337.71mg，KCI63mg、MgS0423mg、無水 CaCl223mg、NaHC0365mg、KH2P0423mg、微量元素溶液 2mL (配方同上)，蒸餾水1000mL,ρΗ7.2。
[0028](2)檢測結(jié)果:株菌HLNR05在以葡萄糖為碳源，硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)液中培養(yǎng)生長時，具有明顯的反硝化作用(見附圖1)。24小時內(nèi)，硝態(tài)氮和總氮的去除率分別達96.6%和92.1%。其中用于微生物同化作用的氮占總?cè)コ实?3.4%，其余大部分以氮氣的形式散失。菌株HLNR05的反硝化活性檢測結(jié)果見附圖1。
[0029]
[0030]
[0031]實施例三
[0032]HLNR05菌株的分子鑒定:
[0033](I)將HLNR0516S rDNA PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳分離并用瓊脂糖凝膠分離純化試劑盒進行純化。通過TA克隆技術(shù)將純化后的16S rDNA片段轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a中，氨芐青霉素及藍白斑篩選挑取陽性克隆子送上海生工進行序列測定。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進行比對分析，獲得最相近菌株的16S rDNA序列。通過MEGA5.0軟件，用Neighbor-joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。
[0034](2)1^^聚類分析表明菌株見殿05屬于β變形桿菌亞門(β-proteobacteria)克雷伯氏菌屬細菌(Klebsiella sp.),相似性為99%。菌株命名為Klebsiella sp.HLNRO5 (見附圖2)。
[0035]
[0036]
[0037]買施例四
[0038]應(yīng)用HLNR05菌株在模擬富營養(yǎng)化廢水中去除硝態(tài)氮和總氮的試驗:
[0039](I)實驗材料
[0040]供試廢水:模擬富營養(yǎng)化廢水:葡萄糖169mg，蛋白胨88.88mg，KCI63mg，無水CaCl223mg, KH2P0423mg, MgS0423mg, NaHC0365mg, KN0S37.71mg,微量元素 2mL，該微元素配方(g.L-1)為:ZnS042.2，CaCl25.5，MnCl2.4Η205.06，F(xiàn)eSO4.7Η205.0, CuSO4.5Η201.57，COCl2.6Η201.61，蒸餾水 IL0
[0041](2)實驗方法
[0042] 取ImL菌液，用無菌水清洗3次后接種于IOOmL新鮮的模擬富營養(yǎng)化廢水中，28°C、200r / min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ld，且按時檢測培養(yǎng)基中N03__N以及TN濃度。其中，Ν03_-Ν采用鹽酸-萘乙二胺分光光度法；TN采用過硫酸鉀-紫外分光光度法。
[0043](3)試驗結(jié)果
[0044]HLNR05對模擬富營養(yǎng)化廢水中Ν03__Ν和TN均有很好的降解效果。24小時內(nèi)Ν03__Ν的去除率達91.4%，TN的去除率達88.2%。HLNR0524小時內(nèi)的脫氮貢獻率占溶液中氮去除率的87.8%， 說明HLNR05菌具有將模擬廢水中的Ν03__Ν降解的能力(見附圖3)。
【權(quán)利要求】
1.一株好氧反硝化細菌菌株，該細菌命名為克雷伯氏菌屬細菌(Klebsiellasp.HLNR05，并于2013年12月保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為:GCMCC N0.8539。
【文檔編號】C12R1/22GK104004674SQ201410160285
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】賀根和, 張宇燕, 梁亮亮, 李一弘 申請人:井岡山大學(xué)