檢測冬蟲夏草超微粉中添加蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉的引物對、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥藥材鑒別【技術領域】，具體涉及檢測冬蟲夏草超微粉中添加蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉的引物對、試劑盒及方法。本發(fā)明要解決的技術問題是提供特異性的檢測冬蟲夏草中摻入蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉偽品的方法。本發(fā)明的技術方案是檢測冬蟲夏草超微粉中添加蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉的引物對，包括用于擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對和擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的引物對。本發(fā)明還提供了檢測冬蟲夏草超微粉中添加蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉的試劑盒。本發(fā)明還提供了定量檢測冬蟲夏草超微粉及摻入蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉的方法。本發(fā)明可用于冬蟲夏草的質量檢測，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】檢測冬蟲夏草超微粉中添加蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉的引物對、試劑盒及方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于商品化中藥藥材保健品鑒別領域，具體涉及檢測冬蟲夏草超微粉中添加蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉的引物對、試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002]冬蟲夏草(Cordycepssinensis [Berk.] Sacc.)系子囊菌綱(Ascomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordycep)真菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆蟲幼蟲上所形成的子座及幼蟲尸體的復合體。冬蟲夏草主要分布在我國青海、西藏、云南、四川等地海拔3，000米以上的高寒草甸區(qū)，具有調節(jié)免疫系統(tǒng)，補肺益腎、止血化痰等功效，是我國珍稀的傳統(tǒng)名貴中藥材之一，市場價格昂貴。市場上出現了許多與冬蟲夏草相似的菌粉產品，部分產品在冬蟲夏草超微粉中摻入發(fā)酵粉或者直接使用發(fā)酵粉制成的產品。如何鑒定和區(qū)別并保證100%純正冬蟲夏草且無任何添加，讓消費者放心食用，切實保證消費者利益，是目前亟待解決的難題。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術問題是提供特異性的檢測冬蟲夏草中摻入蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉偽品比例的可靠方法。本發(fā)明的技術方案是檢測冬蟲夏草超微粉中添加蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉的引物對，包括用于擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對和擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的引物對；擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的引物對如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0004]用于擴增冬蟲夏草特異DNA片段的PCR引物對:
[0005]上游引物(SEQID N0.1):5’GCAGTGGCATCTCTCAGTCA3’ ；
[0006]下游引物(SEQID N0.2):5’GCGTTCAAAGATTCGATGGT3’。
[0007]用于擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉偽品特異DNA片段的PCR引物對:
[0008]上游引物(SEQID N0.3):5’ CCGGAGACCCCTAAACTCTG3’ ；
[0009]下游引物(SEQID N0.4):5’ CGATGCCAGAACCAAGA GAT3’。
[0010]本發(fā)明還提供了檢測冬蟲夏草超微粉中添加偽品的試劑盒，包括用于擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對和擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的引物對；擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的引物對如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0011]進一步的，所述試劑盒還包括含有冬蟲夏草特異DNA片段的標準品質粒DC，按如下濃度獨立包裝:DC-12.0X106 拷貝 / μ L, DC-24.0X IO5 拷貝 / μ L, DC-38.0 X IO4 拷貝 /μ L、DC-41.6 X IO4 拷貝 / μ L、DC-53.2 X IO3 拷貝 /μ L0
[0012]進一步的，所述試劑盒還包括蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的標準品質粒JS，按如下濃度獨立包裝JS-12.0X106拷貝/ μ L, JS-24.0X 105拷貝/ μ L, JS-38.0X 104拷貝 / μ L、JS-41.6 X IO4 拷貝 / μ L、JS-53.2 X IO3 拷貝 /yL。
[0013]本發(fā)明還提供了檢測冬蟲夏草超微粉中添加偽品的方法，該方法包括以下步驟:
[0014]a、繪制標準曲線:以含冬蟲夏草特異DNA片段的標準品質粒DC為模板，用擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對進行熒光定量PCR，得到冬蟲夏草標準品質粒標準曲線；以含蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的標準品質粒JS為模板，用擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對進行熒光定量PCR，得到蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉標準品質粒標準曲線；
[0015]b、提取樣品總DNA;
[0016]C、熒光定量PCR:以樣品總DNA為模板，以擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對和擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的引物對分別進行熒光定量PCR，依據標準曲線對樣品中冬蟲夏草和蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉擴增的熒光值進行計算，得出摻入比例。
[0017]本發(fā)明經過充分的前期實驗篩選和優(yōu)化，得到有效的且特異性強的PCR引物對。本發(fā)明引物對能夠有效地在熒光定量PCR儀上，分別特異地擴增冬蟲夏草超微粉、標準品質粒DC和蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉偽品、標準品質粒JS中的目標DNA片段；測定標準品在擴增過程中的熒光值，熒光定量PCR儀系統(tǒng)根據熒光值的變化規(guī)律生成標準曲線；依據標準曲線對樣品中冬蟲夏草和蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉偽品擴增的熒光值進行計算，得出摻入比例。在痕量檢測方面具有很好的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1、使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)擴增冬蟲夏草超微粉特異DNA片段和使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉(偽品)特異DNA片段的電泳圖。從左至右，第I泳道為Marker2000，第2、3泳道本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)擴增冬蟲夏草超微粉特異DNA片段，第4、5泳道為本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉(偽品)特異DNA片段。
[0019]圖2、使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)擴增冬蟲夏草標準品質粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5 的熒光定量 PCR 擴增曲線。
[0020]圖3、使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)擴增冬蟲夏草標準品質粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5 繪制的標準曲線。
[0021]圖4、使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)擴增冬蟲夏草標準品質粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5 繪制的溶解曲線。
[0022]圖5、使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉(偽品)標準品質粒JS-1、JS-2、JS-3、JS-4、JS-5的熒光定量PCR擴增曲線。
[0023]圖6、使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉(偽品)標準品質粒JS-1、JS-2、JS-3、JS-4、JS-5繪制的標準曲線。
[0024]圖7、使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.USEQ ID N0.2)擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉(偽品)標準品質粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5繪制的溶解曲線。
[0025]圖8、使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.USEQ ID N0.2)擴增樣品I (冬蟲夏草超微粉中摻入不同比例的蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉)的熒光定量PCR擴增曲線。
[0026]圖9、使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2)擴增1_7號樣品(冬蟲夏草超微粉中摻入不同比例的蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉)的熒光定量PCR擴增曲線。[0027]圖10、使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)擴增樣品I (冬蟲夏草超微粉中摻入不同比例的蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉)的熒光定量PCR擴增曲線。
[0028]圖11、使用本發(fā)明引物對(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)擴增1_7號樣品(冬蟲夏草超微粉中摻入不同比例的蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉)的熒光定量PCR擴增曲線。
[0029]在圖2~11中:Amplification Plot表不擴增曲線；Cycle表不循環(huán)數；StandardCurve表示標準曲線！Quantity表示總量；Melt Curve表示熔解曲線；Temperature表示溫度。
【具體實施方式】[0030]為了定量測定冬蟲夏草超微粉中摻入市售蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉(偽品)的比例，本項目使用真菌ITS區(qū)域特異性引物進行實時熒光PCR定量分析。發(fā)明試劑盒中制備了用于擴增冬蟲夏草特異DNA片段的PCR引物對、用于擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉(偽品)特異DNA片段的PCR引物對、含有冬蟲夏草特異DNA片段的標準品質粒DC、含有蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉(偽品)特異DNA片段的標準品質粒JS。將測試樣品和標準樣品通過兩種引物對的熒光PCR擴增后，由標準曲線求得樣品中蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉(偽品)的摻入比例。
[0031]以下結合附圖通過【具體實施方式】對本發(fā)明進行具體說明。
[0032]實施例1檢測用PCR弓丨物對的設計
[0033]根據GenBank上公開登錄的真菌的18s-1TSl_5.8s-1TS2_28s核糖體基因序列信息進行引物的設計。
[0034]冬蟲夏草的序列信息為GenBank:AB067721 (Cordyceps sinensisgenes for18S rRNA,ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA, partial and completesequences, isolate:GY0KU.TU, http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/AB067721, SEQ ID
N0.5)，下劃線所示為引物區(qū)域:
[0035]
【權利要求】
1.檢測冬蟲夏草超微粉中添加蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉的引物對，其特征在于:包括用于擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對和擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的引物對；擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的引物對如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
2.檢測冬蟲夏草超微粉中添加蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉的試劑盒，其特征在于:包括用于擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對和擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的引物對；擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的引物對如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于:還包括含有冬蟲夏草特異DNA片段的標準品質粒DC，按如下濃度獨立包裝:DC-12.0XlO6拷貝/ μ L、DC-24.0XlO5拷貝/ μ L、DC-38.0X IO4 拷貝 / μ L、DC-41.6 X IO4 拷貝 / μ L、DC-53.2 X IO3 拷貝 /μ L0
4.如權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于:還包括蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的標準品質粒JS，按如下濃度獨立包裝JS-12.0X IO6拷貝/ μ L、JS-24.0X IO5拷貝/yL、JS-38.0X 104 拷貝 / μ L、JS-41.6X IO4 拷貝 / μ L、JS-53.2 X IO3 拷貝 /yL。
5.檢測冬蟲夏草超微粉中添加蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: a、繪制標準曲線:以含冬蟲夏草特異DNA片段的標準品質粒DC為模板，用擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對進行熒光定量PCR，得到冬蟲夏草標準品質粒標準曲線；以含蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的標準品質粒JS為模板，用擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對進行熒光定量PCR，得到蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉標準品質粒標準曲線； b、提取樣品總DNA； C、熒光定量PCR:以樣品總DNA為模板，以擴增冬蟲夏草特異DNA片段的引物對和擴增蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉特異DNA片段的引物對分別進行熒光定量PCR，依據標準曲線對樣品中冬蟲夏草和蠟蚧輪枝菌發(fā)酵粉擴增的熒光值進行計算，得出摻入比例。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898236SQ201410168024
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權日:2014年4月24日
【發(fā)明者】徐麗, 張雪峰, 王曉平 申請人:青海春天藥用資源科技利用有限公司