一種熱激轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種熱激轉(zhuǎn)錄因子、編碼所述熱激轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列以及它們在提高植物耐熱性中的應(yīng)用。所述熱激轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)可以明顯地提高轉(zhuǎn)基因植物的耐熱性，而不會給植物帶來生長延遲和矮化的不良影響，因此，它在提高植物耐熱性的應(yīng)用上具有獨(dú)特的優(yōu)勢。
【專利說明】一種熱激轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及植物熱激轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]通過高溫預(yù)處理，植物可以獲得一定的耐熱性。作為一類重要的分子伴侶，熱激蛋白(heat shock proteins,Hsps)的積累在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。熱激蛋白編碼基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平受熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factors, Hsfs)調(diào)控，后者通過結(jié)合在熱激蛋白基因啟動子區(qū)域內(nèi)特異的熱激原件(heat shock element, HSE)上，進(jìn)一步激活其表達(dá)(Vierling等，1991 ;Sun等,2002)。
[0003]Hsf基因首先從酵母中克隆，之后在果蠅、哺乳動物中也相繼得以克隆(Wul995;Morimotol998 ;Sch6ffl等，1998 ;Nover等，2001)。熱激轉(zhuǎn)錄因子主要包括以下幾個重要的結(jié)構(gòu)域:DNA 結(jié)合域(DNA binding domain, DBD)、寡聚域(oligomerization domain, 0D)、核定位信號(nuclea r localization signal,NLS)和轉(zhuǎn)錄激活域(activator domain, AD)(Damberger 等，1994 ;Harrison 等，1994 ;Vuister 等，1994 ;Wul995 ;Nover 等，1996 ;Schultheiss 等，1996)。
[0004]與酵母、果蠅、哺乳動物只有I個Hsf不同，植物擁有多個，且根據(jù)上述重要的結(jié)構(gòu)元件，將其分為A，B, C三類(請參見圖1)。大量研究表明，只有A類Hsf自身擁有轉(zhuǎn)錄激活功能，可以獨(dú)立地完成基因表達(dá)的調(diào)控。而大量的B類和C類成員，本身沒有轉(zhuǎn)錄激活功能。番茄中的HsfBl是一類共激活子，與A類Hsf協(xié)同作用(Bharti等，2004)。擬南芥BI是 A 類成員的抑制子(Czarnecka-Verner 等，2000 ；Czarnecka-Verner 等，2004)。
[0005]番茄中，HsfAla是誘導(dǎo)耐熱性的主要調(diào)節(jié)者(Mishra等，2002)，而HsfA2是I個嚴(yán)格受熱激誘導(dǎo)的Hsf，而且它在熱脅迫和恢復(fù)循環(huán)中具有較高的激活潛力，并且能連續(xù)積累，因此，HsfA2被認(rèn)為是耐熱性細(xì)胞中的I個統(tǒng)治性的Hsf，它不但能激活Hsp的轉(zhuǎn)錄，還可以激活抗壞血酸過氧化物酶Apx基因(Apx2)的表達(dá)(Scharf等，1998a, b ;Morimoto2002 ;Busch等，2005)。過表達(dá)LpHsfAla的番爺表現(xiàn)出較好的熱耐受性Mishra等,2002);過表達(dá)AtHsfA2不僅可以提聞轉(zhuǎn)基因擬南介耐熱和鹽脅迫的能力，還可以促進(jìn)根系愈傷的形成(Nishizawa et al，2006)。過量表達(dá)0sHsfA2e可以明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對熱和過氫化氫的耐受性(Yokotani等，2008)。過量表達(dá)HsfA類基因，如AtHsfA2和0sHsfA2e，均可以提高轉(zhuǎn)基因植物在逆境下的耐受性，然而伴隨著耐熱和耐鹽性的提高，植株表現(xiàn)出了生長延遲、矮化的現(xiàn)象。
[0006]因此，在轉(zhuǎn)基因植物的抗性研究尤其是抗熱性和耐鹽性研究中非常需要獲得在保證耐熱性的同時能夠防止生長延遲、矮化等現(xiàn)象發(fā)生的熱激轉(zhuǎn)錄因子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種在保證耐熱性的同時還能夠防止生長延遲、矮化等現(xiàn)象發(fā)生的熱激轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。[0008]1、一種熱激轉(zhuǎn)錄因子，其中，所述熱激轉(zhuǎn)錄因子與SEQ N0.2具有至少50%，例如60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
[0009]2、一種熱激轉(zhuǎn)錄因子，其中，所述熱激轉(zhuǎn)錄因子由與SEQ N0.1具有至少50%例如60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性的核苷酸序列編碼。
[0010]3、一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ N0.1具有至少50%，例如60%、70%、80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
[0011]4、用于克隆如技術(shù)方案I或2所述的轉(zhuǎn)錄因子或技術(shù)方案3所述的核苷酸序列的引物，所述引物選自由SEQ N0.3至SEQ N0.11組成的組。
[0012]5、由技術(shù)方案4所述的引物克隆得到的產(chǎn)物，優(yōu)選的是，所述產(chǎn)物從百合植物中克隆得到。
[0013]6、一種載體,所述載體包含如技術(shù)方案3所述的核苷酸序列。
[0014]7、如技術(shù)方案6所述的載體,其中,所述載體為質(zhì)粒載體或者表達(dá)載體。
[0015]8、一種 宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含如技術(shù)方案3所述的核苷酸序列。
[0016]9、一種克隆如技術(shù)方案I或2所述的熱激轉(zhuǎn)錄因子或技術(shù)方案3所述的核苷酸序列的方法，所述方法采用如技術(shù)方案4所述的引物進(jìn)行克隆。
[0017]10、如技術(shù)方案I或2所述的熱激轉(zhuǎn)錄因子或者如技術(shù)方案3所述的核苷酸序列在提高植物耐熱性的同時防止植株矮化或生產(chǎn)延遲中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明所提供的熱激轉(zhuǎn)錄因子的過量表達(dá)明顯提高擬南芥耐熱性狀，沒有提高其耐鹽性。更重要的是，過量表達(dá)不會造成轉(zhuǎn)基因植株生長的延遲和矮化，這將使百合熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsf)編碼基因LlHsfA2在改善植物耐熱性狀的應(yīng)用上具有獨(dú)特的優(yōu)勢。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1顯示了熱激轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)與分類。從N端到C端分別是DBD:DNA結(jié)合域；0D:寡聚域；NLS:核定位信號；AD:轉(zhuǎn)錄激活域和NES:核輸出信號。
[0020]圖2顯示了 LlHsfA2氨基酸多序列比對、DNA結(jié)合域三維結(jié)構(gòu)和分子進(jìn)化分析。其中，A:LlHsfA2 (百合)，AtHsfA2 (擬南芥)，LpHsfA2 (蕃茄)和0sHsfA2 (水稻)的多序列比對，DBD: DNA結(jié)合域；OD:寡聚域；NLS:核定位信號；NES:核輸出信號。陰影背景下劃實(shí)線序列:AD-1 (轉(zhuǎn)錄激活域-1);陰影背景下劃虛線序列:AD-2(轉(zhuǎn)錄激活域
的DNA結(jié)合域三維結(jié)構(gòu)圖，α代表α螺旋；β代表β折疊；Τ代表轉(zhuǎn)角。C:LlHsfA2和已知的HsfA2的DNA結(jié)合域序列的進(jìn)化樹分析。黑點(diǎn)標(biāo)注為LlHsfA2。
[0021]圖3顯示了 LlHsfA2的表達(dá)模式。其中，A:LlHsfA2在熱(37°C )，ImM過氧化氫(H2O2)和IOOmM氯化鈉(NaCl)處理下的表達(dá)情況；B:37°C下，LlHsfA2在根(R)，莖(B)和Rf (L)中的表達(dá)情況。C(Control);對照；H:37°C熱激處理I小時；C:37°C下，LlHsfA2在百合‘白天堂’和‘元帥’中的表達(dá)情況。
[0022]圖4顯不了綠色滅光蛋白亞細(xì)胞定位(A:綠色滅光蛋白對照；B:綠色滅光蛋白融合 LlHsfA2)。
[0023]圖5顯示了轉(zhuǎn)LlHsfA2擬南芥生長情況。A:幼苗期野生型和3個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系(2-5、4-7和7-6) ；B:生育期野生型和3個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。[0024]圖6顯示了轉(zhuǎn)LlHsf A2擬南芥分子和生理水平檢測。野生型和3個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系(2-5、4-7 和 7-6)。其中，A:百合 LlHsfA2，和擬南芥 AtHsplOl，AtHsp25 及 AtApx2 的表達(dá)情況；B:擬南芥Apx酶活性；C:擬南芥AsA含量。
[0025]圖7顯示了轉(zhuǎn)LlHsfA2的3個株系(2_5、4_7和7_6)和野生型擬南芥耐熱性測定。其中，A:未高溫處理的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗；B:經(jīng)45°C高溫處理Ih的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明在第一方面提供了一種熱激轉(zhuǎn)錄因子，其中，所述熱激轉(zhuǎn)錄因子與SEQN0.2 具有至少 50 %，例如 60 %、70%、80 %、90 %、91 %、92 %、95 %、97%、98 %、99% 或100%的同一性。在一些實(shí)施方式中，所述熱激轉(zhuǎn)錄因子可以由與SEQ N0.1具有至少50%例如 60%,70%,80%,90%, 91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100%的同一性的核苷酸
序列編碼。
[0027]本發(fā)明在第二方面提供了一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ N0.1具有至少50%，例如 60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100%的同一性。
[0028]本發(fā)明在第三方面提供了用于克隆上述熱激轉(zhuǎn)錄因子或上述核苷酸序列的引物，所述引物選自由SEQ N0.3至SEQ N0.11組成的組。所述引物對可以用于克隆如上所述的熱激轉(zhuǎn)錄因子或者其核苷酸序列，或者可以用于對所述熱激轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行檢測。
[0029]本發(fā)明在第四方面提供如上所述的引物對克隆得到的產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，所述產(chǎn)物從百合植物中克隆得到。所述產(chǎn)物可以是所述引物對直接克隆得到的產(chǎn)物，例如單鏈或者雙鏈的DNA，或者可以是間接產(chǎn)物，例如由所述直接產(chǎn)物翻譯得到的氨基酸序列。
[0030]本發(fā)明在第五方面提供了一種載體，所述載體如上所述的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述載體可以為質(zhì)粒載體。在另外一些實(shí)施方式中，所述載體可以為表達(dá)載體。
[0031]本發(fā)明在第六方面提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含如上所述的核苷酸序列，所述宿主可以例如為大腸桿菌等。
[0032]本發(fā)明在第七方面提供了一種克隆如上所述的熱激轉(zhuǎn)錄因子的方法，所述方法采用如上所述的引物進(jìn)行克隆。
[0033]本發(fā)明在第八方面提供了如上所述的熱激轉(zhuǎn)錄因子或者如上所述的核苷酸序列在改變植物耐熱性上的應(yīng)用。所述應(yīng)用根據(jù)應(yīng)用目的，例如可以通過將上述熱激轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物以使該熱激轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)，或者根據(jù)需要使目標(biāo)植物內(nèi)的所述轉(zhuǎn)錄因子基因沉默。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述改變植物耐熱性是提高植物耐熱性。
[0034]下文將通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施例僅僅出于說明目的，不應(yīng)被理解為是對本發(fā)明請求保護(hù)的范圍的限制。
[0035]實(shí)施例
[0036]實(shí)驗材料將從鐵炮百合‘白天堂’(Liliumlongiflorum Thunb.var.scabrumMasamune, ‘White heaven’)小鱗莖上分化的小苗在MS培養(yǎng)基上生長30天，將其置于37°C處理I小時，取其葉片，用于RNA的提取。
[0037]基因克隆
[0038]米用Invitrogen Trizol reagent (貨號:15596-026)進(jìn)行總 RNA 提取，具體操作如下:
[0039]具體步驟
[0040]I)取新鮮葉片0.1g(克)放入1.5ml (毫升)離心管中，加入少量液氮。
[0041]2)待液氮即將揮發(fā)完時，用研杵快速將材料研成粉末，加入1mlTrizol，充分混勻。
[0042]3)室溫放置3min (分鐘)，加入200 μ I氯仿，劇烈震蕩30s (秒)，室溫放置5min。
[0043]4) 4°C，12，OOOg離心15min，將上清小心移入I個新的離心管中。
[0044]5)加入400 μ I異丙醇，室溫放置IOmin, 12, 000離心10min0
[0045]6)棄上清，加入lml75%乙醇漂洗一次，放入超凈臺中吹干lOmin。
[0046]7)每個樣品加入20 μ I DEPC(焦碳酸二乙酯)處理過的ddH20(雙蒸水)，65°C助溶lOmin，之后可用于下步實(shí)驗或保存于-20°C備用。
[0047]用Invitrogen Super Script II (貨號:18064-014)對 I μ g RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作如下:
[0048]I)在200 μ I離心管中加入I μ 120 μ M引物，I μ IlOmM dNTP Mix (寶生物工程公司)，8 μ I 總 RNA。
[0049]2) 65°C保溫5min，迅速轉(zhuǎn)移止冰上2min。
[0050]3)依次加入下列成份，輕柔混勻。
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種熱激轉(zhuǎn)錄因子，其中，所述熱激轉(zhuǎn)錄因子與SEQ N0.2具有至少50%，例如60%、70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
2.一種熱激轉(zhuǎn)錄因子，其中，所述熱激轉(zhuǎn)錄因子由與SEQ N0.1具有至少50%例如60%,70%,80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性的核苷酸序列編碼。
3.一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ N0.1具有至少50%，例如60 %、70 %、80%,90%,91%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性。
4.用于克隆如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)錄因子或權(quán)利要求3所述的核苷酸序列的引物，所述引物選自由SEQ N0.3至SEQ N0.11組成的組。
5.由權(quán)利要求4所述的引物克隆得到的產(chǎn)物，優(yōu)選的是，所述產(chǎn)物從百合植物中克隆得到。
6.一種載體,所述載體包含如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的載體，其中，所述載體為質(zhì)粒載體或者表達(dá)載體。
8.—種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列。
9.一種克隆如權(quán)利要求1或2所述的熱激轉(zhuǎn)錄因子或權(quán)利要求3所述的核苷酸序列的方法，所述方法采用如權(quán)利要求4所述的引物進(jìn)行克隆。
10.如權(quán)利要求1或2所述的熱激轉(zhuǎn)錄因子或者如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列在提高植物耐熱性的同時防 止植株矮化或生產(chǎn)延遲中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK103923198SQ201410168600
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】辛海波, 張華 , 張華麗, 連青龍, 鐘雄輝, 王濤, 宋利娜, 趙正楠, 董愛香, 義鳴放, 叢日晨 申請人:北京市園林科學(xué)研究院