一種提高大腸桿菌對(duì)黃酮類(lèi)化合物耐受性的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提高大腸桿菌對(duì)黃酮類(lèi)化合物耐受性的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)FadL表達(dá)量的增加能夠緩解E.coli在黃酮類(lèi)化合物存在的不利環(huán)境中的生長(zhǎng)，也即是FadL蛋白可以提高E.coli對(duì)黃酮類(lèi)化合物的耐受性，然后通過(guò)基因工程技術(shù)，將來(lái)源于E.coli?BL21(DE3)的fadL基因過(guò)量表達(dá)于E.coli?BL21(DE3)中，獲得一株能耐受黃酮類(lèi)化合物的工程菌，外源添加黃酮類(lèi)化合物于E.coli生長(zhǎng)環(huán)境中，相較于原始菌，工程菌的最大比生長(zhǎng)速率相較于原始菌提高了2.53倍。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種提高大腸桿菌對(duì)黃酮類(lèi)化合物耐受性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高大腸桿菌對(duì)黃酮類(lèi)化合物耐受性的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]黃酮類(lèi)化合物(Flavonoids)是自然界種類(lèi)最多的多酚類(lèi)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物界中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的種類(lèi)已超過(guò)8000多種。黃酮類(lèi)化合物具有廣泛的藥學(xué)價(jià)值，具有較強(qiáng)的抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗病毒、降血糖、抗輻射和降血脂等多種生物學(xué)作用。隨著對(duì)黃酮類(lèi)化合物生物活性研究的逐步深入，對(duì)其的開(kāi)發(fā)利用也越來(lái)越多，對(duì)其的需求量也越來(lái)越大，近年來(lái)，黃酮類(lèi)化合物的市場(chǎng)每年增長(zhǎng)30%以上，在藥品和營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品領(lǐng)域上具有廣闊的應(yīng)用前景。但天然黃酮類(lèi)物質(zhì)的獲得受到時(shí)間和區(qū)域的限制，而且在植物中含量低，不利于迅速研究和臨床檢驗(yàn)，并且化學(xué)結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，用化學(xué)合成法很復(fù)雜，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)。因此用微生物生產(chǎn)黃酮類(lèi)化合物越來(lái)越受到人們的重視。
[0003]隨著黃酮類(lèi)化合物的應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，其需求量也在不斷的增大，從植物中提取有各種各樣的問(wèn)題，因此，通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類(lèi)化合物具有很大的應(yīng)用前景。目前，黃酮類(lèi)化合物生物合成的代謝途徑已經(jīng)非常清楚，黃酮類(lèi)化合物的基本骨架是由3個(gè)丙二酰輔酶A(malonylCoA)和I個(gè)香豆酰輔酶A (coumaroylCoA)在查爾酮合成酶(CHS)的催化下合成的，然后其他種類(lèi)的黃酮是在母核的基礎(chǔ)上通過(guò)羥基、甲氧基取代或烷基化等化學(xué)反應(yīng)生成的。
[0004]大腸桿菌遺傳背景清晰，分子操作技術(shù)完善，是生物技術(shù)生產(chǎn)平臺(tái)的首選，因此很早就有人通過(guò)改造E.coli相關(guān)代謝途徑生產(chǎn)黃酮類(lèi)化合物。目前很多研究成功通過(guò)基因工程等技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)了多種黃酮類(lèi)化合物在E.coli中的合成，如柚皮素、槲皮素、白藜蘆醇等。但是黃酮類(lèi)化合物本身對(duì)E.coli生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，主要是通過(guò)以下幾種機(jī)制:①破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性，改變細(xì)胞膜滲透性，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的功能，影響細(xì)菌的生長(zhǎng)；②抑制核酸的合成，槲皮素、芹黃素、五羥基黃酮等能夠抑制E.coli的DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性進(jìn)而抑制DNA的合成，蘆丁能夠促進(jìn)E.coli的DNA裂解，導(dǎo)致SOS反應(yīng)發(fā)生，從而抑制菌體的生長(zhǎng)抑制能量代謝，通過(guò)抑制ATP合酶的活力進(jìn)而抑制胞內(nèi)ATP的含量，影響菌體的生長(zhǎng)。因此利用E.coli生產(chǎn)黃酮類(lèi)化合物必須要考慮黃酮類(lèi)化合物對(duì)E.coli的毒性作用。
[0005]目前，F(xiàn)adL蛋白的功能主要是作為大腸桿菌長(zhǎng)鏈脂肪酸外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也參與轉(zhuǎn)運(yùn)一些小分子物質(zhì)，如:糖類(lèi)、有機(jī)酸和醇類(lèi)物質(zhì)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種提高微生物對(duì)黃酮類(lèi)化合物耐受性的方法，是在微生物中過(guò)量表達(dá)FadL蛋白。[0007]編碼所述FadL蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述黃酮類(lèi)化合物是蘆丁、柚皮素或白藜蘆醇。
[0009]所述FadL蛋白的獲得，是在E.Coli生長(zhǎng)穩(wěn)定期添加黃酮類(lèi)化合物刺激菌體，然后收集菌體細(xì)胞，提取膜蛋白，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)FadL蛋白的表達(dá)量有顯著提高，并通過(guò)過(guò)量表達(dá)FadL蛋白進(jìn)一步驗(yàn)證其功能。
[0010]所述FadL蛋白還可應(yīng)用于提高細(xì)胞產(chǎn)黃酮類(lèi)化合物的能力。
[0011]通過(guò)在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)所述FadL蛋白，大腸桿菌對(duì)黃酮類(lèi)化合物的耐受性得到提聞。
[0012]本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)黃酮類(lèi)化合物耐受性提高的基因工程菌。所述基因工程菌是重組大腸桿菌，是以pACYC-Duetl為表達(dá)載體，在E.coli中過(guò)量表達(dá)FadL蛋白得到。
[0013]所述E.Coli 是 E.coli BL21(DE3)。
[0014]本發(fā)明確認(rèn)了 FadL蛋白的新功能，在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)該蛋白，并測(cè)定菌體在含黃酮類(lèi)化合物的環(huán)境中的生長(zhǎng)曲線，證明該蛋白的過(guò)量表達(dá)提高了 E.coli對(duì)黃酮類(lèi)化合物的耐受能力。當(dāng)環(huán)境中存在lg/L蘆丁或柚皮素或白藜蘆醇時(shí)，相比未過(guò)量表達(dá)FadL蛋白的菌株，過(guò)量表達(dá)FadL蛋白的微生物的比生長(zhǎng)速率提高了兩倍多。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1FadL的發(fā)現(xiàn)
[0016]用接種針在E.coli BL21(DE3)平板上挑取單菌落接種于25mL LB培養(yǎng)基，活化12h。按照I %的接種量分別接種于4瓶25mL LB培養(yǎng)基，置于37°C搖床(200rpm)培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，其中三瓶分別添加25 μ L0.lg/L的蘆丁或柚皮素或白藜蘆醇(用DMSO溶解)，另外一瓶添加25 μ L DMSO作為對(duì)照，培養(yǎng)3h后8000rpm低溫離心收集菌體，用去離子水洗3次后按照FOOJS? GlobalFractionation說(shuō)明書(shū)提取膜蛋白，并用2_D Clean-Up試劑盒除去蛋白樣品中的離子，最后用非干擾性蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品中的濃度，最后按照450 μ L含有800ng的濃度水化上樣，使用24cm的pH4_7的膠條進(jìn)行IEF，然后平衡兩次后用13.5%的SDS-PAGE進(jìn)行第二向，結(jié)束后用R250進(jìn)行染色12h，脫色后用ImageScanner III儀器對(duì)膠進(jìn)行拍照，獲得清楚圖像后用TOQuest進(jìn)行圖譜分析。其中一個(gè)膠點(diǎn)在有蘆丁、柚皮素和白藜蘆醇的樣品中相較于對(duì)照組均有2倍以上的上調(diào)，將此點(diǎn)挖出進(jìn)行脫色，脫水，酶解等步驟，然后利用MALD1-T0F/MS質(zhì)譜對(duì)肽段樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，通過(guò)檢索MatrixScience數(shù)據(jù)庫(kù)得出此點(diǎn)是E.coli屬的FadL蛋白。
[0017]實(shí)施例2耐黃酮類(lèi)化合物工程菌的構(gòu)建
[0018]根據(jù)NCBI中fadL的基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，分別連接到克隆載體pMD19_T測(cè)序，獲得正確的轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行雙酶切連接到質(zhì)粒pACYC-Duetl上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pACYC-fadL，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.coli JM109，涂布到含有氯霉素的LB培養(yǎng)基上(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC110g/L，固體培養(yǎng)基加20g/L瓊脂，121°C滅菌15min)，挑取轉(zhuǎn)化后平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到正確的單菌落進(jìn)行發(fā)酵提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，涂布到含有氯霉素的LB培養(yǎng)基上，挑取轉(zhuǎn)化后平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到正確的單菌落即為重組菌株，也即獲得高耐受黃酮類(lèi)化合物的E.coliBL21(DE3)工程菌。
[0019]實(shí)施例3高耐受黃酮類(lèi)化合物E.coli BL21 (DE3)工程菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定
[0020]挑取工程菌和含有空質(zhì)粒pACYC-Duetl的E.coli BL21 (DE3)單菌落接種到含有氯霉素的M9培養(yǎng)基(13.3g/L M9CA Broth、0.2 %葡萄糖、ImM硫酸鎂、0.5 μ g/mLthiamine-HCl)中活化IOh后，按I %接種量接入含有I %氯霉素、lg/L黃酮類(lèi)化合物(蘆丁或柚皮素或白藜蘆醇)，以及不同濃度的IPTG(0，100, 200, 400 μ Μ)的Μ9培養(yǎng)基中，30°C 200rpm培養(yǎng)，每隔Ih測(cè)一次OD6tltl直至菌株生長(zhǎng)到穩(wěn)定期。根據(jù)公式μ = dx/x*dt算出菌株的比生長(zhǎng)速率圖，然后得出最大比生長(zhǎng)速率μ_，發(fā)現(xiàn)在有l(wèi)g/L蘆丁的環(huán)境中工程菌的^ max為0.486，而原始菌株的為0.24，生長(zhǎng)速率提升了 2.0倍；在lg/L的柚皮素環(huán)境中工程菌的μ max為0.48，而原始菌株的為0.21，生長(zhǎng)速率提升了 2.29倍；在lg/L的白藜蘆醇環(huán)境中工程菌的Umax為0.329，而原始菌株的為0.13，生長(zhǎng)速率提升了 2.53倍。
[0021]雖然本發(fā)明已以較佳 實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種提高微生物對(duì)黃酮類(lèi)化合物耐受性的方法，其特征在于，是在微生物中過(guò)量表達(dá)FadL蛋白。
2.一種提高大腸桿菌對(duì)黃酮類(lèi)化合物耐受性的方法，其特征在于，是在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)SEQ ID N0.1所示核苷酸序列編碼的FadL蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，以pACYC-Duetl為表達(dá)載體，在E.coliBL21(DE3)中過(guò)量表達(dá)FadL蛋白，提高E.coli BL21(DE3)對(duì)黃酮類(lèi)化合物的耐受性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述黃酮類(lèi)化合物是蘆丁、柚皮素或白藜蘆醇。
5.一種對(duì)黃酮類(lèi)化合物耐受性提高的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，過(guò)量表達(dá)了SEQ ID N0.1所示核苷酸序列編碼的FadL蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，是以pACYC-Duetl為表達(dá)載體，在E.coli BL21(DE3)中過(guò)量表達(dá)FadL蛋白。
7.權(quán)利要求5所述的大腸桿菌基因工程菌在黃酮類(lèi)化合物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P7/22GK103923863SQ201410169821
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 周景文, 王奎, 李江華, 堵國(guó)成 申請(qǐng)人:江南大學(xué)