一種降低木質素含量的代謝途徑改造方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領域，具體而言是一種通過在植物中構建2-苯乙醇合成通路以降低木質素合成，進而提高纖維生物質轉化效率的方法與應用。2-苯乙醇合成通路來自酵母，包含三個關鍵基因，分別是氨基酸轉氨酶基因AR09，丙酮酸脫羧酶基因他餌卩乙醇脫氫酶基因ADH2。本發(fā)明在擬南芥中構建一條2-苯乙醇合成的途徑，通過2-苯乙醇的合成與木質素合成競爭起始底物苯丙氨酸，引起碳代謝的分流，實現(xiàn)轉基因植物中木質素合成減少。本發(fā)明主要的目的是通過降低植物中木質素合成，從而降低纖維生物質預處理的難度。目前，在擬南芥中本方法已表現(xiàn)出降低木質素合成，同時提高莖稈細胞壁提取物酶解釋放葡萄糖效率的特性。
【專利說明】一種降低木質素含量的代謝途徑改造方法及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域，具體而言是一種通過在轉基因植物中構建2-苯乙醇 合成通路以降低木質素合成的方法和應用。

【背景技術】
[0002] 木質纖維生物質（biomass)是地球上最豐富的可再生資源。其轉化產(chǎn)品豐富，可 轉化為生物燃料及生物基化學品等多種產(chǎn)品。隨著礦物資源的日益短缺，以及使用石油等 礦物資源所帶來的環(huán)境污染和氣候惡化，纖維生物質資源的開發(fā)利用已在世界范圍內引起 了廣泛的關注。木質素是木質纖維生物質的主要成分之一，其存在一直是限制纖維生物質 高效轉化利用的主要屏障。以前的研究結果證明，通過基因工程技術改變能源植物木質素 的含量和成分能夠顯著降低原材料預處理強度，同時提高纖維素的降解效率和生物乙醇的 發(fā)酵產(chǎn)量。因此，開發(fā)高效轉化利用的新型纖維生物質能源植物是解決生物質利用困難的 關鍵瓶頸之一，具有重要的應用價值。
[0003] 木質素（lignin)是高等植物細胞壁的重要組分，是一類組成和結構十分復雜的 芳香類聚合物,主要有H-木質素、S-木質素和G-木質素3種主要的木質素類型。木質素的 合成代謝途徑在雙子葉植物中被廣泛深入地研究。其生物合成以苯丙氨酸為起始底物，進 入苯丙酸途徑，經(jīng)過一系列反應合成羥基肉桂酸類化合物，最終生成3種主要木質素單體。 目前，國內外關于木質素合成途徑和遺傳調控的研究，主要集中于雙子葉植物。木質素單 體合成途徑的 10 個酶基因（PAL、C4H、HCT、C3H、CES、4CL、CCoAOMT、CCR、F5H、COMT 和 CAD) 的功能在擬南芥中已經(jīng)基本研究清楚，其中許多關鍵基因已應用于植物木質素生物合成調 控。
[0004] 目前的植物木質素基因工程的研究策略主要是通過調控木質素合成關鍵基因的 表達來實現(xiàn)木質素含量的降低或組成結構的改變，從而使木質素更易于去除，進而利于纖 維生物質的轉化利用。為了給木質素分子改良提供更多選擇和策略，本發(fā)明以木質素合成 的起始底物苯丙氨酸為切入點，在擬南芥中構建一條2-苯乙醇合成的途徑，希望通過2-苯 乙醇的合成與木質素合成競爭起始底物苯丙氨酸，引起碳代謝的分流，實現(xiàn)轉基因植物中 木質素合成的減少。
[0005] 2-苯乙醇是一種具有玫瑰花香的芳香醇，作為香料廣泛應用于日化、輕工和食品 等領域。其合成途徑在釀酒酵母都得到了較深入的研究，植物中2-苯乙醇合成研究相對較 少，在植物中存在三條不同途徑。與木質素合成相似，酵母中2-苯乙醇的合成都是以苯丙 氨酸作為起始底物。目前在擬南芥中，尚未有2-苯乙醇合成的報道。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種通過在植物中構建一條2-苯乙醇合成通路，與木質素合成 競爭底物苯丙氨酸，從而降低植物木質素含量的代謝途徑改造方法及應用。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術方案為： 一種2-苯乙醇合成通路，其特征在于：所述合成通路來自酵母，包含三個關鍵基因， 分別是氨基酸轉氨酶基因沒（GenBank序列號：NM_001179267)，丙酮酸脫羧酶基因 必(NM_001180688)和乙醇脫氫酶基因也說？(匪_001182812)。
[0008] -種2-苯乙醇合成通路應用，其特征在于：所述2-苯乙醇合成通路在降低植物莖 桿木質素含量以提高纖維生物質轉化效率的應用。
[0009] -種2-苯乙醇合成通路的植物表達載體，其特征在于：所述合成通路的植物表達 載體包含兩個，一個包含WP你和兩個基因，另一個包含也說？基因，二者分別具有組 成型啟動子。
[0010] 所述兩個載體的T-DNA區(qū)中還分別包含不同的用于篩選轉基因植物的標記基因。
[0011] 所述組成型啟動子分別為CaMV35S啟動子和pROLD啟動子。
[0012] 所述2-苯乙醇合成通路分別為必微、和也說？基因。
[0013] 所述植物為纖維類能源植物。
[0014] 所述植物表達載體在降低植物莖桿木質素含量以提高纖維生物質轉化效率的應 用。
[0015] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點： 本發(fā)明構建了 2-苯乙醇合成通路的植物表達載體，包含用所述載體轉化的擬南芥，以 及在擬南芥中降低木質素合成的方法。而利用本發(fā)明描述的方法對擬南芥木質素合成進行 系統(tǒng)的代謝工程改造，使得植物木質素含量下降約11%，莖桿細胞壁提取物酶解釋放葡萄糖 效率顯著提高，同時對轉基因植株的正常生長沒有影響，其具有較大的研究價值和應用潛 力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明實施例提供的2-苯乙醇合成通路的植物表達載體的構建示意圖。
[0017] 圖2為本發(fā)明實施例提供的轉化2-苯乙醇合成通路的擬南芥轉基因植株。其中， 對照（Control)為轉入空載體的轉基因擬南芥。
[0018] 圖3為本發(fā)明實施例提供的RT-PCR分析AWUTtWO和如/--基因在轉基因擬南 芥中的表達水平示意圖。其中，對照（Control)為轉入空載體的轉基因擬南芥；1，2,3,4和 5代表為轉基因擬南芥株系。擬南芥基因用作內參。
[0019] 圖4為本發(fā)明實施例提供的轉化2-苯乙醇合成通路的擬南芥轉基因植株莖橫 切面的木質素間苯三酚染色分析。其中，對照（Control)為轉入空載體的轉基因擬南芥； 4?投為AWUTtWO和也說？基因過表達株系。Bar = 200 Mm。
[0020] 圖5為本發(fā)明實施例提供的轉化2-苯乙醇合成通路的擬南芥轉基因植株莖木質 素含量測定。其中，對照（Control)為轉入空載體的轉基因擬南芥4--制你為 AWUTtWP和也說？基因過表達株系。*表示差異顯著（P〈 0.05)。
[0021] 圖6為本發(fā)明實施例提供的纖維素酶水解擬南芥莖細胞壁提取物的效率分析。其 中，對照（Control)為轉入空載體的轉基因擬南芥;^放投為和 也說？基因過表達株系。

【具體實施方式】
[0022] 本實驗所涉及的藥品均購自Sigma公司、Fermentas公司、Thermo Fisher公司、上 海生工公司。具體實驗操作依據(jù)《分子克隆》。
[0023] 實施例1 2-苯乙醇合成通路的植物表達載體的構建： 1.酵母2-苯乙醇合成通路基因d放沒、必和也說？基因的克隆 為了在植物中構建2-苯乙醇合成通路，根據(jù)釀酒酵母中2-苯乙醇合成通路的報道，選 擇沒(NM_001179267)、^tWi?(NM_001180688)和也說？(匪_001182812)構建 2-苯乙醇合 成通路。取釀酒酵母cererisiae )提取其基因組DNA，搜索GenBank獲得 二者的全長cDNA序列，分別設計基因特異引物，利用PCR技術擴增三者的基因全長cDNA; 最后將二者連入PMD19-T中測序。擴增條件為：95°C 5 min預變性；94 30 s，55 °C 40s， 72 °C I min，35個循環(huán)；72 °C 8 min片段延伸。擴增引物為： AR09cDNAF: 5, -ATGACTGCTGGTTCTGCCCCCCCT- 3,； AR09cDNAR: 5' -TCAACTTTTATAGTTGTCAAAAAAT-3' ； AROlOcDNAF: 5' -ATGGCACCTGTTACAATTGAAAAG- 3' ； AROlOcDNAR: 5' -CTATTTTTTATTTCTTTTAAGTGCCG-3' ； ADH2cDNAF: 5' -ATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAG- 3' ； ADH2cDNAR: 5' -TTATTTAGAAGTGTCAACAACGTAT-3'。
[0024] 2. 2-苯乙醇合成通路的植物表達載體的構建 先將狀和也說？基因全長cDNA分別連接到入門克隆pEN-L4-2-L3、pGWC-T和 pGWC-T載體中，測序正確后，利用Gateway技術（Invitrogen公司說明書)，通過基因重組將 必微和必WO插入到pK7m34GW2-8m21GW3載體中，將燦/--基因插入到PH2GW7載體中，從 而得到含有4?沒和必基因共同過表達，及也說？過表達的植物表達載體(參見圖1); 實施例2構建2-苯乙醇合成通路降低植物木質素含量的應用： 1.農(nóng)桿菌介導轉化擬南芥 將WP你和共同過表達的植物表達載體轉化農(nóng)桿菌，挑取鑒定陽性的克隆，過夜 培養(yǎng)，至〇D=2.0。將過夜培養(yǎng)的300ml菌液室溫離心收菌，并用150ml轉化Buffer重懸(轉 化Buffer :含0. 5%蔗糖溶液和0. 02% SiIwet)。將擬南芥花序倒置浸入菌液中，盡量使全 部的花序都浸入菌液中，反復浸入5-6次，然后將擬南芥倒放于接水盤中，用保鮮膜覆蓋， 于培養(yǎng)間（22°C)過夜，然后正常培養(yǎng)。轉化一周以后，可以再重新轉化一次，常規(guī)管理至種 子成熟。種子收獲后，自然晾干，經(jīng)表面消毒，鋪于含有25Pg/ml的卡那霉素的1/2MS平板 上，篩選陽性植株。篩選獲得WP你和共同過表達的陽性植株后，經(jīng)過篩選得到T2代 植株后，再轉化也說？過表達的植物表達載體，種子收獲后，于含有25Pg/ml的卡那霉素和 25Pg/ml的潮霉素的1/2MS平板上，篩選得到?jīng)]、及也說？共同過表達的轉基因植 株(參見圖2)。
[0025] 2.轉基因植株分子鑒定 取生長4周的候選轉基因擬南芥葉片，利用CTAB法提取其總RNA，用DNAase I (Sigma 公司）去除可能污染的基因組DNA，然后利用反轉錄試劑盒（Fermentas公司）反轉錄成第一 鏈 cDNA。以 AR09cDNAF/R、AR010cDNAF/R 和 ADH2cDNAF/R 為引物，利用 RT-PCR 法檢測其 相對于對照植株(轉化pK7m34GW2-8m21GW3空載體)的表達水平。擴增條件為：95 °C 5 min 預變性；94 30 s, 55 °C 40s, 72 °C I min, 28個循環(huán)；72 °C 8 min片段延伸。擬南芥 基因用作內參。結果如圖3所示，5個代表性轉基因植株中AWUTtWP及基 因的表達量比對照植株明顯要高，表明這兩個基因已經(jīng)整合到轉基因植株中，初步實現(xiàn)了 2-苯乙醇合成通路構建。
[0026] 3.利用乙酰溴法測定轉基因植株莖桿木質素的含量。具體步驟為： (1) 材料的選取及細胞壁成分提?。菏占?-8周左右的對照及轉基因植株的基部莖 (地上部分約5cm)，將材料凍干后研磨成細粉，使用70%的乙醇抽提3次，沉淀再用氯仿-甲 醇抽提1次，沉淀使用丙酮懸浮后吹干，稱重，最后再碾磨成細粉； (2) 取約2mg細胞壁提取物，加入乙酰溴溶液，50°C反應3h，冷卻至室溫，再 加入氫氧化鈉和新配置的鹽酸羥胺溶液，用冰醋酸調整體積至2ml，取20〇μ1測定 280nm的吸光度，使用下列公式計算木質素含量：木質素含量（%) =ABSL*2ml*100%/ Coeff*0. 539cm*weight(mg) ;ABSL :吸光度，Coeff=15. 69。
[0027] 4.利用石蠟切片觀察轉基因擬南芥莖木質素含量變化。具體步驟為： (1) 材料的選取及固定：利用鋒利刀片取6個月植株莖基部0.5 cm，置于4%多聚甲 醛固定液中真空抽氣2 h,直到材料沉于管底，4°C過夜； (2) 脫水及透明：將上述過夜處理的植株莖基部用1倍PBS清洗一次，乙醇梯度脫水 [乙醇梯度比例為10%、30%、50%、80%、90%乙醇(體積百分比)]后，利用無水乙醇（A)和二甲 苯⑶按比例進行浸透，其體積比例分別為A/B=3/l，A/B=l/1，A/B=l/3和B，每步滲透約 Ih; (3) 浸蠟及包埋：滲透處理后利用二甲苯（B)和石蠟（C)按比例進行蠟浸，其體積比例 分別為B/C=3/l，B/C=l/1，B/C=l/3和C，每步浸蠟約3 h，而后62°C烘箱中進行； (4) 切片、展片及烘片：利用LeicaRM2235切片機（Leica公司）將材料切成8 μ m的 薄片，置于42°C水浴鍋中展片1-2 min，使之吸附于世泰REF188105粘附載玻片（世泰公 司）上，37°C烘片2天； (5) 脫蠟、二甲苯及染色：將附著有材料的載玻片置于二甲苯中脫蠟5min，脫蠟后， 利用無水乙醇（A)和二甲苯（B)按比例進行梯度洗脫脫水，梯度比例為：A(無水乙醇）/ B(二甲苯）=1/1, A, 95 %A, 85 % A, 75 % A, 50 % A, 30 % A(體積百分比），最后在0.5 % TBO染液中染色15 s ; (6)脫水及封片：將清水洗過的玻片依次在30 % A，50 % A，75 % A，85 % A，95 % A，A及B中脫水至二甲苯中，每步30 s，隨后利用加拿大樹膠將其封存； (7)切片的觀察：利用OLYMPUS DX51光學顯微鏡（Olympus公司）進行觀察，拍照(參 見圖4)。
[0028] 實施例3構建2-苯乙醇合成通路提高植物細胞壁酶解糖化效率的應用 利用纖維素酶水解擬南芥莖細胞壁提取物的效率分析。具體步驟為： (1)將細胞壁提取物分為兩個處理組，第一組直接使用纖維素酶（Cellulose)和葡萄 糖苷酶（β -glucosidase)處理，分別取對照和轉基因植株細胞壁提取物lOOmg，在50 C、 PH4. 8條件下處理24小時，分別于1，3, 6, 24小時取酶解產(chǎn)物50〇μ1，測定水解產(chǎn)物中葡萄 糖含量。
[0029] (2)第二組取細胞壁提取物首先使用熱水（12ΓΟ處理1小時，然后使用纖維素 酶和葡萄糖苷酶處理分別于1，3, 6, 24小時取樣測定酶解產(chǎn)物中葡萄糖含量。按照葡萄糖 測定試劑盒（氧化酶法）說明書操作，計算發(fā)酵樣品中葡萄糖含量。
【權利要求】
1. 一種2-苯乙醇合成通路，其特征在于：所述合成通路來自酵母，包含三個關鍵基因， 分別是氨基酸轉氨酶基因你，丙酮酸脫羧酶基因川和乙醇脫氫酶基因也說?。
2. -種權利要求1所述的2-苯乙醇合成通路的應用，其特征在于：所述2合成通路在 降低植物莖桿木質素含量以提高纖維生物質轉化效率的應用。
3. -種2-苯乙醇合成通路的植物表達載體，其特征在于：所述合成通路的植物表達載 體包含兩個，一個包含AR09和AROlO兩個基因，另一個包含ADH2基因，二者分別具有組成 型啟動子。
4. 按權利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表達載體，其特征在于：所述兩個載 體還分別包含不同的用于篩選轉基因植株的標記基因。
5. 按權利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表達載體，其特征在于：所述組成型 啟動子分別為CaMV35S啟動子和pROLD啟動子。
6. 按權利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表達載體，其特征在于：所述合成通 路關鍵基因分別為AR09、AR010和ADH2基因。
7. -種權利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表達載體的應用，其特征在于：所 述植物為纖維類能源植物。
8. -種權利要求3所述的2-苯乙醇合成通路的植物表達載體的應用，其特征在于：所 述植物表達載體在降低植物莖桿木質素含量中的應用。
【文檔編號】C12N1/19GK104212731SQ201410170692
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年4月26日 優(yōu)先權日:2014年4月26日
【發(fā)明者】周功克, 祁廣, 柴國華, 孔英珍, 王殿, 唐賢豐, 胡瑞波 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所