EVs-TRPC5在檢測乳腺癌耐藥程度中的應用的制作方法
【專利摘要】EVs-TRPC5在檢測乳腺癌耐藥程度中的應用，具體檢測方法為：（1）收集患有乳腺癌的病人或動物的血液樣本，分別通過離心去除樣本中的完整細胞、血小板及細胞碎片，最后離心收集樣本中的EVs；（2）可用RT-PCR法或者Elisa法檢測收集到的EVs中TRPC5的表達情況，若TRPC5表達陽性，為出現(xiàn)耐藥性的可疑病人或動物。本發(fā)明根據(jù)血液EVs中TRPC5的表達的高低，可顯示出乳腺癌腫瘤細胞耐藥轉變的情況，具有檢測方法簡單、速度快、靈敏度高、成本低的優(yōu)點。
【專利說明】EVs-TRPC5在檢測乳腺癌耐藥程度中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及TRPC5的一種新用途，尤其是涉及細胞外囊泡(EVs)的瞬時受體電位通道(TRPC5)在檢測乳腺癌耐藥程度中的應用。
【背景技術】
[0002]乳腺癌是女性常見的癌癥，嚴重威脅女性身心健康。中國抗癌協(xié)會公布的最
新統(tǒng)計數(shù)字顯示，從20世紀90年代以來，乳腺癌發(fā)病率和死亡率均持續(xù)穩(wěn)定上升，發(fā)病率以每年4.476%的速度增長，死亡率以每年3%的速度增長?；瘜W藥物治療是乳腺癌的主要治療手段之一，目前臨床常用藥物有:(i )蒽環(huán)類，紫杉類，抗代謝類，抗微管類，烷化齊U，雜類等；(ii)抗雌激素，芳香化酶抑制劑等；(iii)曲妥珠單抗(抗Her-2)、貝伐單抗(抗VEGF)ο
[0003]但是，據(jù)美國癌癥協(xié)會報道，90%以上腫瘤患者死于不同程度的化療耐藥。對化療藥物產(chǎn)生耐藥已經(jīng)成為腫瘤治療的一大難題。經(jīng)過近幾十年的研究，目前發(fā)現(xiàn)的耐藥機制有(I)細胞膜ABC藥物轉運蛋白表達增強，減少藥物攝入及增加藥物排出，P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)是目前研究最多也是最為重要的ABC藥物轉運蛋白，由多藥耐藥基因mdrl編碼；(2)通過使藥物發(fā)生異化降低藥物活性，常見的酶有GST、CYP450等；(3)藥物作用靶點突變或表達水平變化等；(4)腫瘤異質性；(5)腫瘤干細胞耐藥等。
[0004]目前，早期診斷腫瘤的最新、最有效的方法是通過驗血尋找腫瘤標記物。腫瘤標志物指的是在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中，能反應細胞癌變的一些細胞內物質。臨床上通過對各種腫瘤標志物的檢測，可以對相應腫瘤做早期診斷、檢測療效和腫瘤復發(fā)狀況。因此，在深入研究耐藥機制的基礎上，開發(fā)乳腺癌耐藥分子診斷指標、方法，實現(xiàn)試劑化，達到耐藥早期、動態(tài)監(jiān)測，在現(xiàn)階段對于乳腺癌耐藥的診療至關重要，也為優(yōu)化藥物結構設計、研發(fā)耐藥逆轉藥物提供有益借鑒，因而具有重大而現(xiàn)實的社會價值。
[0005]MUCl是一種粘蛋白，在正常細胞表達時是一種跨膜糖蛋白，正常情況下，在乳腺、胃腸道及泌尿生殖道的上皮細胞頂端表達，糖基化完全。MUCl度正常上皮起潤滑和保護作用、介導信號轉導和細胞黏附。
[0006]在乳腺癌細胞株MCF-7中通過磷酸化，MUCl能結合Rrb/SOS，參與受體酪氨酸激酶介導的信號轉導，而酪氨酸磷酸化是膜受體參與信號轉導的一個關鍵步驟。乳腺癌MUCl的表達特點包括:高表達、異常表達低；糖基化、高唾液酸化；頂端定為不清，極性混亂；細胞漿和細胞表面都有過度表達，并且這些分子會從乳腺癌細胞進入血清。有研究者檢測基底樣乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)高表達MUC1，大約有92%的患者能檢測出過表達的MUC1。
[0007]TRPC5 是瞬時受體電位通道(transient receptor potential channels, TRP 通道)家族的一個亞型，它是細胞膜上能通透鈣離子的非選擇性通道，主要分布于腦、肺、睪丸和胎盤，并主要參與生長錐的形成和腦的發(fā)育。本研究室研究發(fā)現(xiàn)，瞬時受體電位通道TRPC5與腫瘤多藥耐藥密切相關，TRPC5在耐阿霉素的乳腺癌細胞(MCF-7/ADM)中發(fā)生明顯上調，并能間接介導腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥的P-gp蛋白在多藥耐藥腫瘤細胞(如MCF-7/ADM)中的表達水平。本 申請人:針對該性質申請了相關專利，專利名稱為《TRPC5作為藥物靶點在逆轉腫瘤多藥耐藥中的應用》(專利號:201210318389.5)。
[0008]細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是指細胞外環(huán)境含有大量可移動的細胞膜來源的囊泡。這些EVs主要包括外來體exosomes、微泡microvesicles以及凋亡小體apoptotic bodies,這些動態(tài)的EVs在細胞間交流和免疫調節(jié)過程中起著至關重要的作用。脂後標記蛋白flotillin-2在EVs上特異表達,可作為特異性標志物應用于研究過程中。腫瘤細胞也產(chǎn)生EVs，研究者在惡性膠質瘤、胰腺癌、胃癌和急性白血病病人的血液中發(fā)現(xiàn)都有大量的EVs存在。這些EVs中包含有細胞表面蛋白、RNA及DNA，通過EVs將囊泡內容物由供體細胞向受體細胞轉運，從而介導細胞間交流，進而引發(fā)腫瘤的遷移和侵襲，然而這些EVs結構的形成原因及其與乳腺癌化療耐藥的相關性還有待進一步研究。

【發(fā)明內容】

[0009]針對現(xiàn)有技術存在的上述問題，本 申請人:提供了一種EVS-TRPC5在檢測乳腺癌耐藥程度中的應用。本發(fā)明根據(jù)血液EVs中TRPC5的表達的高低，可顯示出乳腺癌腫瘤細胞耐藥轉變的情況，具有檢測方法簡單、速度快、靈敏度高、成本低的優(yōu)點。
[0010]本發(fā)明的技術方案如下:
EVS-TRPC5在檢測乳腺癌耐藥程度中的應用，具體檢測方法為:
(O收集患有乳腺癌的病人或動物的血液樣本，分別通過離心去除樣本中的完整細胞、血小板及細胞碎片，最后離心收集樣本中的EVs ；
(2)可用RT-PCR、Elisa等方法檢測收集到的EVs中TRPC5的表達情況，若TRPC5表達陽性，為出現(xiàn)耐藥性的可疑病人或動物。
[0011]本發(fā)明有益的技術效果在于:
1、本發(fā)明通過檢測血液EVs中TRPC5的表達水平，作為一個中間結果，可初步得到乳腺腫瘤的耐藥情況。TRPC5的表達水平越高，則提供血液樣本者發(fā)生耐藥的可能性也就越高。
[0012]2、本發(fā)明采用的檢測方法簡單快速，只需抽取血液樣本便可檢測，極大程度地減輕了腫瘤病人的痛苦；
3、通過本發(fā)明可以初步檢測出病人在該階段的耐藥情況，同時聯(lián)合其它已有的乳腺癌耐藥診斷技術，可有利于指導醫(yī)生提出更加準確的治療方案，以獲得最佳療效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為實施例1的TRPC5在耐藥乳腺癌細胞EVs上的表達情況檢測示意圖；
圖2為實施例2的TRPC5在耐藥乳腺癌的異種移植瘤裸鼠血液和經(jīng)化療的乳腺腫瘤病人的血液EVs中的表達情況檢測示意圖。
【具體實施方式】
[0014]實施例中所使用的材料來源或制備方法如下:
1、細胞
(I)野生型人乳腺癌細胞MCF-7/WT購自美國模式培養(yǎng)物寄存庫(ATCC)。
[0015](2)耐阿霉素人乳腺癌細胞MCF-7/ADM由江南大學藥物設計與分子藥理學研究室制備并保存，其制備方法如下:
將新復蘇的野生型人乳腺癌細胞MCF-7/WT細胞(購自ATCC)于細胞培養(yǎng)常規(guī)條件下培養(yǎng)2代代，使細胞生長穩(wěn)定，待細胞匯合時用胰酶進行消化并傳代，第二天更新培養(yǎng)基，同時以MCF-7/WT IC50的1/10為起始濃度加入阿霉素，加藥第二天后再次換液，并維持阿霉素的濃度進行常規(guī)傳代培養(yǎng)，待細胞穩(wěn)定生長后提高藥物濃度繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞可在阿霉素濃度為5 μ g/ml的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長，即得，整個制備過程歷時8個月。
[0016]2、抗體及 siRNA
TRPC5 antibody (ab63151)購自美國 Abcam 公司；goat polyclonal to rabbit IgG15 nm Gold (ab27236)購自美國 Abeam 公司；TRPC5_siRNA 購自美國 Invitrogen 公司。
[0017]3、病人
血液樣本采自29位乳腺癌患者，其中17位患者接受過蒽環(huán)類/紫杉烷類藥物化療，12位患者未接受過任何化療藥物治療。
[0018]4、實驗儀器
透射電鏡購自日本Hitachi公司；激光共聚焦顯微鏡購自德國Zeiss公司；PCR儀購自美國Bio-Rad公司；C02恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；核酸電泳儀系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。
[0019]實施例1:TRPC5在耐藥乳腺癌細胞的EVs上表達，且參與EVs的形成。
[0020]方法:收集體外培養(yǎng)的MCF-7/ADM和MCF-7/WT細胞，制備成透射電鏡樣本，在透射電鏡下觀察兩種細胞的結構差異，并拍照記錄。結果如圖1A所示。
[0021]MCF-7/ADM細胞的透射電鏡樣本經(jīng)過BSA封閉、TRPC5 一抗、免疫金標記二抗孵育后，在透射電鏡下觀察TRPC5的分布情況，并拍照記錄。結果如圖1B所示。
[0022]將MCF-7/ADM細胞以3000個/孔接種于共聚焦小皿中，待細胞貼壁后進行免疫染色，樣本經(jīng)BSA封閉、TRPC5 一抗、綠色熒光二抗孵育后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察TRPC5的表達及分布情況，并拍照記錄。結果如圖1B所示。
[0023]體外培養(yǎng)的MCF-7/ADM細胞先經(jīng)Scrambled siRNA和TrpC5 siRNA處理，然后同樣制備成透射電鏡樣本，在透射電鏡下觀察MCF-7/ADM細胞經(jīng)TrpC5 siRNA干擾前后的結構差異，并拍照記錄。結果如圖1C所示。
[0024]結果:
如圖1A所示，透射電鏡結果顯示，與MCF-7/WT細胞相比，MCF-7/ADM細胞膜表面產(chǎn)生了大量的EV結構。如圖1B所示，免疫熒光染色和免疫透射電鏡結果均顯示，TrpC5在EVs上高量表達。如圖1C所示，當MCF-7/ADM細胞分別經(jīng)Scrambled siRNA和TRPC5 siRNA處理后，透射電鏡結果顯示TRPC5被抑制后，MCF-7/ADM細胞膜表面的EVs明顯減少。這些結果表明，與野生型MCF-7細胞相比，耐阿霉素的MCF-7細胞表面產(chǎn)生大量的EVs結構，TRPC5蛋白在該結構上大量表達，并參與EVs的形成。因為在耐藥細胞的EVs中才能檢測到TRPC5，說明TRPC5和耐藥是相對應的。
[0025]實施例2 =RT-PCR法檢測血液樣本EVs中TRPC5的表達情況。
[0026]方法:在雌性裸鼠的側腹分別注射MCF-7/WT和MCF-7/ADM細胞(5 X IO6個細胞/裸鼠),養(yǎng)殖4?8周，當腫瘤長至約200mm3時，在耐藥荷瘤小鼠腫瘤部位每三天注射一次ADM (3mg/kg),同時在所有荷瘤小鼠腫瘤部位每三天注射一次TRPC5-siRNA或對照siRNA(40pmol),30天后通過心臟穿刺技術收集血液保存在肝素鈉溶液中，并收集EVs。
[0027]收集血液樣本中的EVs:血漿樣本收集在含EDTA的聚丙烯離心管中，首先以300 X g離心10分鐘去除完整細胞，以2500 X g離心20分鐘去除血小板和細胞碎片，重復操作2次，然后在4度條件下以16000 Xg離心I小時、100000 Xg離心I小時，沉淀為EVs，用PBS洗滌后，重懸在PBS溶液中備用。
[0028]RT-PCR:運用反轉錄試劑盒 Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) Kit(TaKaRa)將EVs的基因組反轉錄成cDNAs，然后用常規(guī)的RT-PCR方法進行檢測。用于檢測裸鼠血液樣本的引物包括:
TrpC5: forward, 5' -GACCTGATAA CCACTGAGAACCTGCTGAGC-3'; reverse, 5' -GACAACCTCT TGCCAAATGGGTCTTGATGC-3'; flotillin2: forward, 5' -CCAGAGACACTGTCCTTCCC-3'; reverse, 5' -CATTGGAGCAAGGAGACAGAG-3';
MUCl: forward, 5' -TTCTTCCTGCTGCTGCTCCTCAC-3'; reverse, 5' -GCACATCACT CACGCTGACGTCTG-3'; mdrl: forward, 5' -CTTTCGAACTGCAAATATGCCTCC-3'; reverse, 5' -GAGTTAGGAATGTAGCCCAGG-3';
GAPDH: forward, 5' -CAACGTGTCAGTGGTGGACC-3'; reverse,5' -AGCAGTGAGGGTCTCTCTCTTC-3'.用于檢測病人血液樣本的引物包括:
TrpC5: forward, 5' -AGACTTGCCATGGGCCACCTCTCATCAGAACC-3'; reverse, 5-GAGGCGAGTTGTAACTTGTTCTTCCTGTCCATC-3'; flotillin2: forward, 5' -AGATCCGGCAGGAAGAGATT-3'; reverse, 5' -GCTTCTGCCTTGAGCTTCAT-3';
MUCl: forward, 5; -CGACTACTACCA AGAGCTGCAGAGAGACAT-3'; reverse, 5' -TGTAAGAGAGGCTGCTGCCA CCATTACCTG-3'; mdrl: forward, 5' -CTGTTTGACTGCAGCATTGCTGAG AACAT-3'; reverse, 5' -CTGGCGCTTTGTTCCAGCCTGGACACTGAC-3';
GAPDH: forward, 5' -GGACTCATGACCACAGTCCATGCCATCACT-3'; reverse, 5' -CTTGGAGGCCATGTGGGCCATGAGGTCCAC-3'.結果:RT-PCR檢測裸鼠血液樣本EVs中各蛋白的mRNA水平，7只耐藥荷瘤小鼠中，TrpC5、flotillin2、mdrl和MUCl的mRNA水平均顯示陽性表達，表明耐藥荷瘤小鼠腫瘤分泌的表達有TrpC5的EVs被釋放到了裸鼠的外周血中，如圖2A所示。當耐藥腫瘤經(jīng)TRPC5 - siRNA處理后，與對照組相比TRPC5、flotillin2和mdrl的轉錄水平明顯下降，統(tǒng)計結果見圖2A，該結果進一步提示TRPC5與EVs的形成和轉運密切相關。
[0029]RT-PCR檢測病人血液樣本EVs中各蛋白的mRNA水平，17位經(jīng)化療的病人中，TRPC5、flotillin2、mdrl和MUCl的mRNA水平均顯示高表達，且TRPC5表達為強陽性，而12位未經(jīng)化療的病人中，這些蛋白的mRNA水平均較低，如圖2B所示。該結果進一步表明了攜帶有TRPC5的EVs與腫瘤耐藥有密切的聯(lián)系，提示乳腺癌病人血液EVs中TRPC5的表達可作為檢測指標應用于耐藥乳腺癌的診斷治療中。[0030]實施例3 =Elisa法檢測血液樣本EVs中TRPC5的表達情況。
[0031]采用雙抗體夾心法(Elisa法)定量測定血樣本EVs中TRPC5的含量。運用商業(yè)化的或手動包被的用于檢測人源性TRPC5蛋白的Elisa檢測試劑盒，檢測樣本為用蛋白裂解液裂解好的血液EVs樣本，根據(jù)常規(guī)的Elisa檢測方法測定樣本中TRPC5的含量，用相應檢測儀器檢測信號強度。樣本中的TRPC5越多，相對檢測值就越高，TRPC5就表達為陽性，那么提供血液樣本者發(fā)生耐藥的可能性也就越高。
【權利要求】
1.EVS-TRPC5在檢測乳腺癌耐藥程度中的應用，其特征在于具體檢測方法為: (O收集患有乳腺癌的病人或動物的血液樣本，分別通過離心去除樣本中的完整細胞、血小板及細胞碎片，最后離心收集樣本中的EVs ； (2)可用RT-PCR法或者Elisa法檢測收集到的EVs中TRPC5的表達情況，若TRPC5表達陽性，為出現(xiàn)耐藥性的可疑病人或動物。
【文檔編號】C12Q1/68GK103954770SQ201410170932
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月25日 優(yōu)先權日:2014年4月25日
【發(fā)明者】馬鑫, 金堅, 汪淋軍, 陳震, 陳蘊, 蔡燕飛 申請人:江南大學