具有增加的穩(wěn)定性的重組因子viii的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有增加的穩(wěn)定性的重組因子VIII。本發(fā)明涉及重組因子VIII，所述重組因子VIII包括導(dǎo)致因子VIII和因子VIIIa兩者的穩(wěn)定性增強(qiáng)的一種或多種突變。還公開了制備和使用所述重組因子VIII的方法和含有所述重組因子的藥物組合物。本發(fā)明還涉及編碼所述重組因子VIII的分離的核酸分子以及含有所述分離的核酸分子的DNA表達(dá)系統(tǒng)和宿主細(xì)胞。
【專利說明】具有增加的穩(wěn)定性的重組因子VI I I
[0001] 本申請是國際申請日為2008年7月25日的國際申請PCT/US2008/071170進(jìn)入中 國、申請?zhí)枮?00880123751. 5的題為"具有增加的穩(wěn)定性的重組因子VIII"的發(fā)明專利申 請的分案申請。
[0002] 本申請要求2007年11月1日提交的美國臨時(shí)專利申請序列第60/984, 518號和 2007年11月30日提交的美國臨時(shí)專利申請系列第60/991，304號的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，通過引用 將他們每一個(gè)整體并入本文。
[0003] 本發(fā)明是根據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院授予的HL76213和HL38199號基金在政府的支 持下進(jìn)行的。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。

【技術(shù)領(lǐng)域】 [0004] 和【背景技術(shù)】
[0005] 最常見的重度遺傳性出血疾患血友病A是由血漿蛋白因子VIII的缺乏或缺陷引 起的。還沒有血友病A的治愈方法并且治療由使用（純化的）血漿制劑或重組蛋白制劑的 替代治療組成。
[0006] 因子VIII以非共價(jià)的金屬離子依賴性的異源二聚體參與循環(huán)。這種前體輔因 子（procofactor)形式的蛋白含有包括Al(al)A2(a2)B結(jié)構(gòu)域的重鏈（HC)和包括（a3) A3C1C2結(jié)構(gòu)域的輕鏈（LC)，小寫的a表示富含酸性殘基的短的（約30至40個(gè)殘基）區(qū) 段（參見 Fay，"Activation of Factor VIII and Mechanisms of Cofactor Action (因 子VIII的激活和輔因子的作用機(jī)制），"Blood Rev. 18 :1-15 (2004))。因子VIII在A1A2、 A2B和A3A3接合處被凝血酶或因子Xa催化的蛋白裂解激活。該反應(yīng)的產(chǎn)物因子Villa是 包括稱為Al、A2和A3C1C2的亞基的異源三聚體，它在酶原因子X向絲氨酸蛋白酶因子Xa 的膜依賴性的轉(zhuǎn)化中作為絲氨酸蛋白酶因子IXa的輔因子起作用（參見Fay/'Activation of Factor VIII and Mechanisms of Cofactor Action (因子 VIII 的激活和輔因子的作 用機(jī)制），" Blood Rev. 18 :1-15 (2004)) ·
[0007] 重構(gòu)研究已顯示因子VIII異源二聚體結(jié)構(gòu)是由靜電相互作用和疏水相互作用二 者支撐的（Fay/'Reconstitution of Human Factor VIII from Isolated Subunits (由 分離的亞基重構(gòu)人因子 VIII)，"Arch Biochem Biophys. 262 :525-531 (1988) ;Ansong 等 人，"Factor VIII AlDomain Residues97-105Represent a Light Chain-interactive Site(因子VIII A1結(jié)構(gòu)域殘基97-105代表輕鏈相互作用位點(diǎn)）/'Biochemistry. 45 : 13140-13149(2006))，并且鏈間親和力被因子VIII與馮維勒布蘭德（von Willebrand) 因子的結(jié)合進(jìn)一步加強(qiáng)（Fay，"Reconstitution of Human Factor VIII from Isolated Subunits(由分離的亞基重構(gòu)人因子VIII)，"Arch Biochem Biophys. 262 :525-531 (1988); Kaufman 等人/'Regulation of Factor VIII Expression and Activity by von Willebrand Factor (馮維勒布蘭德因子對因子VIII表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)，" Thromb Haemost. 82 :201-208(1999))。金屬離子也促進(jìn)鏈間親和力和活性參數(shù)（Wakabayashi等 人，"Metal Ion-independent Association of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity (金 屬離子非依賴性的因子VIII亞基締合和鈣離子和銅離子對輔因子活性和亞基間親和力 的作用），"Biochemistry40 :10293-10300(2001))。需要鈣來產(chǎn)生活性的因子VIII構(gòu) 象。誘變研究將鈣結(jié)合位點(diǎn)定位在A1結(jié)構(gòu)域內(nèi)富含酸性殘基的區(qū)段（殘基110-126)并 且鑒定了此區(qū)域中離子配位的主要的特定殘基（Wakabayashi等人，"Residues 110_126in the AlDomain of Factor VIII Contain a Ca2+Binding Site Required for Cofactor Activity (因子VIII的A1結(jié)構(gòu)域中的殘基110-126含有輔因子活性所需的Ca2+結(jié)合位 點(diǎn)），"JBiol Chem.279:12677-12684(2004))。近期的中間分辨率的X射線結(jié)構(gòu)（Shen 等人，''The Tertiary Structure and Domain Organization of Coagulation Factor VIII (凝血因子VIII的三級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域組織），"Bloodlll :1240-1247(2008))證實(shí)了 這種鈣結(jié)合位點(diǎn)并提出了在A2結(jié)構(gòu)域中的第二個(gè)可能位點(diǎn)。這個(gè)結(jié)構(gòu)還顯示A1和A3 結(jié)構(gòu)域中占有兩個(gè)1型銅離子位點(diǎn)。較早的功能研究已顯示銅離子促進(jìn)重鏈和輕鏈締 合形成異源二聚體，這在生理pH值下將鏈間親和力增加幾倍（Fay等人,"Human Factor Villa Subunit Structure ：Reconstruction of Factor Villa from the Isolated Al/ A3-Cl-C2Dimer and A2Subunit(人因子 ￥1113亞基結(jié)構(gòu)：由分離的八1/^3-(：1-02二聚 體和 A2 亞基重構(gòu)因子 Villa), "J Biol Chem. 266 :8957-8962(1991) ;Wakabayashi 等 人，"pH-dependent Association of Factor VIII Chains ：Enhancement of Affinity at Physiological pH by Cu2+(pH依賴性的因子VIII鏈的締合：Cu2+在生理pH下增 強(qiáng)親和力），"Biochim BiophysActa. 1764 :1094-1101(2006) ;Ansong 等人，"Factor VIII A3Domain Residuesi954-1961Represent an AlDomain-Interactive Site (因 子VIII A3結(jié)構(gòu)域殘基1954-1961代表Al結(jié)構(gòu)域相互作用位點(diǎn)），"Biochemistry44 : 8850-8857(2005))。
[0008] 因子Villa的不穩(wěn)定性是由A2亞基和A1/A3C1C2二聚體之間的弱靜電相互作 用引起的（Fay等人，" Human Factor Villa Subunit Structure Reconstruction of Factor Villa from the Isolated Al/A3-Cl_C2Dimer and A2Subunit(人因子 Villa 亞 基結(jié)構(gòu)：由分離的A1/A3-C1-C2二聚體和A2亞基重構(gòu)因子VIIIa)，"J Biol Chem. 266: 8957-8962(1991) ;Lollar 等人，"pH_dependent Denaturation of Thrombin-activated Porcine Factor VIII (凝血酶激活的豬因子VIII的pH依賴性的變性，"J Biol Chem. 265: 1688-1692(1990))并且會導(dǎo)致因子Xase 的活性減弱（Lollar 等人，"Coagulant Properties of Hybrid Human/Porcine Factor VIII Molecules (雜合的人 / 豬因子 VIII 分子 的促凝血特性），"J Biol Chem. 267 :23652-23657 (1992) ;Fay 等人，"Model for the Factor Villa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase ：Role of Subunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis(因子 Villa 依賴性的內(nèi)在因 子Xase衰退（decay)的模型：亞基解離和因子IXa催化的蛋白水解的作用），"JBiol Chem. 271 :6027-6032(1996))。關(guān)于因子Villa中的A2亞基的締合的可用信息是有限的， A1和A3結(jié)構(gòu)域中的殘基似乎都促進(jìn)這種亞基的保留。已經(jīng)顯示幾種因子VIII點(diǎn)突變相 對于野生型有利于A2的解離，并且這些殘基定位在A1-A2結(jié)構(gòu)域界面（Pipe等人，"Mild Hemophilia A Caused by Increased Rate of Factor VIII A2Subunit Dissociation ： Evidence for Nonproteolytic Inactivation of Factor Villa in vivo(因子 VIII A2亞基解離的速率增加引起的輕度血友病A :體內(nèi)因子VIII非蛋白水解滅活的證 據(jù)），，'Blood93 :176-183(1999) ;Pipe 等人，"Hemophilia A Mutations Associated with1-stage/2-stage Activity Discrepancy Disrupt Protein-protein Interactions within the Triplicated A Domains of Thrombin-activated Factor VIIIa(l 期/2期活 性差異相關(guān)的血友病A突變破壞凝血酶激活的因子Villa的三個(gè)A結(jié)構(gòu)域中的蛋白-蛋白 相互作用），"Blood97 :685-691 (2001))或 A2-A3 結(jié)構(gòu)域界面（Hakeos 等人，"Hemophilia A Mutations within the Factor VIII A2_A3Subunit Interface Destabilize Factor Villa and Cause One-stage/Two-stage Activity Discrepancy (因子 VIII A2-A3 亞 基界面內(nèi)的血友病A突變使因子Villa不穩(wěn)定并且引起1期/2期活性差異），"ThiOmb Haemost. 88 :781-787(2002))。這些因子VIII變體表現(xiàn)出特征性的1期/2期測定差異 (Duncan 等人，"Familial Discrepancy Between the One-stage and Two-stage Factor VIII Methods in a Subgroup of Patients with Haemophilia A(患血友病A的患者亞群 中1期和2期因子VIII方法之間的家族差異），'^^JHaematol. 87 :846-848 (1994) ;Rudzki 等人，" Mutations in a Subgroup of Patients with Mild Haemophilia A and a Familial Discrepancy Between the One-stage and Two-stage Factor VIII ：C Methods (患輕 度血友病A的患者亞群中的突變和1期與2期因子VIII :C方法之間的家族差異），"BrJ Haematol. 94 :400-406 (1996))，其中由于A2亞基解離的速率增加致使后一種測定所測得 的活性值顯著降低。
[0009] 因子VIII的A結(jié)構(gòu)域的基于血漿銅藍(lán)蛋白的同源性模型的檢測（Pemberton等 人,"A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin (基于人血楽銅藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)的 人因子VIII的三個(gè)A結(jié)構(gòu)域的分子模型），"Blood89 :2413-2421(1997))表明A2結(jié)構(gòu)域 與A1和A3結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)之間的的延伸界面，其中多個(gè)可能的接觸點(diǎn)有利于結(jié)合相互作 用。
[0010] 在穩(wěn)定因子Villa方面存在著明顯的興趣，因?yàn)楦€(wěn)定形式的蛋白代表了血 友病A的優(yōu)良治療劑，可能需要較少的材料來治療患者（Fay等人，"Mutating Factor VIII :Lessons from Structure to Function(對因子VIII進(jìn)行突變：由結(jié)構(gòu)到功能的 教導(dǎo)），"Blood ReViewsl9:15-27(2005))。為了這個(gè)目的，描述了因子VIII的制備， 其中通過在A2和其他的因子VIII結(jié)構(gòu)域之間引入新共價(jià)鍵在重組蛋白中制備了突變 以防止 A2 亞基解離（Pipe 等人，"Characterization of a Genetically Engineered Inactivation-resistant Coagulation Factor Villa(遺傳工程化的抗失活的凝血因 子 Villa 的表征），"Proc Natl Acad Sci USA94:11851-11856(1997);Gale 等人，"An Engineered Interdomain Disulfide Bond Stabilizes Human Blood Coagulation Factor Villa (工程化的結(jié)構(gòu)域間二硫鍵穩(wěn)定人血凝血因子Villa)，" J. Thromb. Haemostasisl : 1966-1971 (2003))。然而，從此有建議認(rèn)為這些類型的突變可能在治療性因子VIII中是不 希望的，因?yàn)樗麄兓旧吓懦讼抡{(diào)的方法。這種情況會產(chǎn)生可能引起損傷的血栓前病癥。 因此，可能希望增強(qiáng)因子VIII和因子Villa兩者的穩(wěn)定性，但是以促進(jìn)前血栓病癥的可能 性最小的方式進(jìn)行。
[0011] 本發(fā)明針對于克服本領(lǐng)域內(nèi)的這些和其他缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的第一方面涉及重組因子VIII，所述重組因子VIII包括導(dǎo)致因子VIII和 因子Villa兩者的穩(wěn)定性增強(qiáng)的一種或多種突變。
[0013] 優(yōu)選地，所述一種或多種突變構(gòu)成了疏水性氨基酸殘基對A1A2或A2A3結(jié)構(gòu)域界 面的任一界面或兩個(gè)界面的一個(gè)或多個(gè)帶電荷氨基酸殘基的取代。本發(fā)明的特別優(yōu)選的重 組因子VIII包括野生型因子VIII的Glu287殘基的取代、野生型因子VIII的Asp302殘基 的取代、野生型因子VIII的Asp519殘基的取代、野生型因子VIII的Glu665殘基的取代、 野生型因子VIII的Glul984殘基的取代或它們的組合。
[0014] 本發(fā)明的第二方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明的第一方面的重組因子VIII的藥物組合 物。
[0015] 本發(fā)明的第三方面涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的第一方面的重組因子VIII的分離的核 酸分子。本發(fā)明的這個(gè)方面還包括含有編碼本發(fā)明的重組因子VIII的DNA分子的重組DNA 表達(dá)系統(tǒng)、和含有所述DNA分子和/或重組表達(dá)系統(tǒng)的重組宿主細(xì)胞。
[0016] 本發(fā)明的第四方面涉及制備重組因子VIII的方法，該方法包括：將根據(jù)本發(fā)明的 第三方面的宿主細(xì)胞在使得所述宿主細(xì)胞表達(dá)重組因子VIII的條件下培養(yǎng)；和分離所述 重組因子VIII。
[0017] 本發(fā)明的第五方面涉及治療動物血友病A的方法。該治療方法包括：給表現(xiàn)血友 病A的動物施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的第一方面的重組因子VIII，從而使動物在血管損傷 后表現(xiàn)出有效的血液凝集。
[0018] 本發(fā)明證明在A1A2和A2A3結(jié)構(gòu)域界面的大量帶電荷的殘基不參與氫鍵鍵合，但 是可能使因子VIII結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和/或在因子VIII前體輔因子激活后促進(jìn)A2亞基解離。在 所附的實(shí)施例中顯示用疏水性殘基取代這些帶電荷的殘基-目的是增加隱藏的疏水區(qū)域 并誘導(dǎo)隱藏的親水區(qū)域-增強(qiáng)結(jié)構(gòu)域間的結(jié)合親和力。在評估了因子VIII變體在較高的 溫度下的活性和A2亞基解離所導(dǎo)致的因子VIII活性衰退的時(shí)程之后評估了穩(wěn)定性參數(shù)。 這些研究的結(jié)果證明大量突變產(chǎn)生增加的穩(wěn)定性參數(shù)，這與可能由于A2結(jié)構(gòu)域界面處隱 藏的電荷所導(dǎo)致的去穩(wěn)定力的消除是一致的。因子VIII和激活的輔因子Villa的這些穩(wěn) 定化的變體應(yīng)該提供治療血友病A的改良治療劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為圖解如通過一期凝集測定（黑色柱）和二期發(fā)色因子Xa生成測定（灰色 柱）所測量的因子VIII突變體相對于野生型因子VIII的活性的圖。野生型和突變體因子 VIII形式的活性如實(shí)施例中所描述地測量。誤差線顯示由三次獨(dú)立的測定進(jìn)行平均的標(biāo)準(zhǔn) 偏差的值。
[0020] 圖2A-B分別圖解野生型和突變體因子VIII和因子Villa的活性衰退。在圖2A 中，在55°C下孵育因子VIII (4nM)并在所指示的時(shí)間取出等分試樣并通過如實(shí)施例中所描 述的因子Xa生成測定來測定活性。顯示了野生型（虛線，空心圓）、R282A(空心三角形）、 S524A (空心正方形）、N684A (空心菱形）、R531A (實(shí)心圓）、S650A (實(shí)心三角形）、E287A (實(shí) 心正方形）和D302A(實(shí)心菱形）的結(jié)果。在圖2B中，在40nM因子IXa存在的條件下在 23°C下孵育凝血酶激活的因子VIIIa(4nM)并在所指示的時(shí)間點(diǎn)取出等分試樣并通過如實(shí) 施例中所描述的因子Xa生成測定來測量活性。顯示了野生型（虛線，空心圓）、R282A(空 心三角形）、S524A(空心正方形）、Y1792F(空心菱形）、N684A(實(shí)心圓）、Y1786F(實(shí)心三 角形）、R531A(實(shí)心正方形）、E287A(實(shí)心菱形）和D302A(灰色圓）的結(jié)果。所選的快速 衰退的變體的結(jié)果在圖2B的插圖中以放大的比例顯示。
[0021] 圖3A-B圖解因子VIII突變體和野生型因子VIII的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印 跡分析。圖3A顯示在8 %的聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE后通過GelCode顯現(xiàn)的 純化的野生型和突變體因子VIII蛋白（0.77μ8)。圖3B顯示在8 %的聚丙烯酰胺 凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并通過生物素化的R8B12抗體探測的純化的野生型和 突變體因子VIII蛋白（0.34yg)。條帶通過如所附的實(shí)施例中所描述的化學(xué)熒光顯 現(xiàn)。野生型（泳道 1)、Glu272Ala (泳道 2)、Glu272Val (泳道 3)、Asp519Ala (泳道 4)、 Asp519Val (泳道 5)、Glu665Ala(泳道 6)、Glu665Val (泳道 7)、Glul984Ala(泳道 8)和 Glul984Val (泳道9)。MW，分子量標(biāo)志物：sFVIII，單鏈形式的因子VIII :HC，重鏈：IX， 輕鏈。單鏈形式與野生型和突變體因子VIII的異源二聚體形式的表觀化學(xué)計(jì)量比為 〇· 96(野生型）、0· 64(Glu272Ala)、0· 92(Glu272Val)、0· 74(Asp519Ala)、0· 8(Asp519Val)、 0·64 (Glu665Ala)、0· 63 (Glu665Val)、0· 91(Glul984Ala)和 0·5 (Glul984Val)。
[0022] 圖4A-D圖解因子VIII突變體相對于野生型因子VIII的比活和凝血酶生成測 定。圖4A顯示使用如所附的實(shí)施例中所描述的一期凝集測定（灰色柱）和二期發(fā)色因 子Xa生成測定（實(shí)心柱）所測定的活性值。圖4B-C圖解因子VIII蛋白的凝血酶生成圖 (thrombogram)。野生型（虛線）、Glu272Ala (空心正方形）、Glu272Val (實(shí)心正方形）、 Asp519Ala(空心圓）、Asp519Val (實(shí)心圓）、Glu665Ala (空心三角形）、Glu665Val (實(shí)心三 角形）、Glul984Ala (空心菱形）和Glul984Val (實(shí)心菱形）。圖4D圖解由凝血酶生成測定 所獲得的參數(shù)值。凝血酶生成測定如所附的實(shí)施例中所描述地進(jìn)行。凝血酶生成圖顯示三 次重復(fù)樣品的平均值。參數(shù)值表達(dá)為相對于野生型的值（％)。野生型的實(shí)際值為7. 5±0. 5 分鐘（滯后時(shí)間）、13·7±0·3 分鐘（峰時(shí)間）、157·3±14·7ηΜ(峰值）、979·8±37·9ηΜ/ 分鐘（ΕΤΡ)。顯示了滯后時(shí)間（空心柱）、峰時(shí)間（灰色柱）、峰值（實(shí)心柱）和ΕΤΡ (線紋 柱）。誤差線顯示由三次獨(dú)立的測定進(jìn)行平均的標(biāo)準(zhǔn)偏差的值。
[0023] 圖5Α-Β圖解野生型和突變體因子VIII的活性衰退。在不同的溫度（52_60°C )下 孵育因子VIII (4nM)并在所指示的時(shí)間取出等分試樣并通過如所附的實(shí)施例中所描述的 因子Xa生成測定來測定活性。通過非線性最小二乘回歸擬合數(shù)據(jù)，獲得衰退速率。每個(gè)點(diǎn) 代表由三次獨(dú)立的測定平均的值。顯示了野生型（虛線，交叉符號）、Glu272Ala(空心正方 形）、Glu272Val (實(shí)心正方形）、Asp519Ala(空心圓）、Asp519Val (實(shí)心圓）、Glu665Ala (空 心三角形）、Glu665Val (實(shí)心三角形）、Glul984Ala (空心菱形）、Glul984Val (實(shí)心菱形） 和全長的Kogenate因子VIII (灰色圓）的結(jié)果。圖5A圖解在55°C孵育后代表性的因子 VIII衰退曲線。圖5B圖解在不同溫度下的因子VIII衰退速率的曲線。圖5B中的插圖為 在52-55 °C的溫度范圍內(nèi)的衰退結(jié)果的放大。
[0024] 圖6為圖解在37°C下血漿中的因子VIII的活性衰退的圖。在缺乏因子VIII的 血漿中在37°C下孵育因子VIII (ΙηΜ)并在所指示的時(shí)間取出等分試樣并進(jìn)行如所附的實(shí) 施例中所描述的一期凝集測定。顯示了野生型（虛線，交叉符號）、Asp519Ala(空心圓）、 Asp519Val (實(shí)心圓）、Glu665Ala (空心三角形）、Glu665Val (實(shí)心三角形）、Glul984Ala (空 心菱形）和Glul984Val (實(shí)心菱形）的結(jié)果。通過非線性最小二乘回歸擬合數(shù)據(jù)，并且每 個(gè)點(diǎn)代表由三次獨(dú)立的測定平均的值。
[0025] 圖7A-B為圖解在不存在或存在因子IXa的條件下野生型和突變體因子Villa的 活性衰退的圖。圖7A顯示在23°C下孵育的凝血酶激活的因子VIIIa(4nM)。在所指示的 時(shí)間點(diǎn)取出等分試樣并通過如所附的實(shí)施例中所描述的因子Xa生成測定來測量活性。圖 7B顯示在存在IXa的條件下野生型和突變體因子Villa的活性衰退。在存在40nM因子 IXa的條件下用凝血酶激活因子VIII (4nM)。在所指示的時(shí)間點(diǎn)取出等分試樣并通過如所 附的實(shí)施例中所描述的因子Xa生成測定來測量活性。顯示了野生型（虛線，交叉符號）、 Glu272Ala (空心正方形）、Glu272Val (實(shí)心正方形）、Asp519Ala(空心圓）、Asp519Val (實(shí) 心圓）、Glu665Ala (空心三角形）、Glu665Val (實(shí)心三角形）、Glul984Ala (空心菱形）和 Glul984Val (實(shí)心菱形）的結(jié)果。通過非線性最小二乘回歸擬合數(shù)據(jù)，并且每個(gè)點(diǎn)代表由三 次獨(dú)立的測定平均的值。
[0026] 圖8為圖解將Asp519、Glu665和/或Glul984殘基變?yōu)锳la或Val的因子VIII 雙組合突變體或三組合突變體的比活的圖。使用如實(shí)施例中所描述的一期凝集測定（灰色 柱）和二期發(fā)色因子Xa生成測定（黑色柱）測定活性值。誤差線顯示由三次獨(dú)立的測定 進(jìn)行平均的標(biāo)準(zhǔn)偏差值。
[0027] 圖9為圖解野生型因子VIII和將Asp519、Glu665和/或Glul984殘基變?yōu)锳la 或Val的因子VIII雙組合突變體或三組合突變體的因子VIII活性衰退速率的圖。如實(shí)施 例中所描述的，進(jìn)行因子VIII活性衰退實(shí)驗(yàn)并通過非線性最小二乘回歸評估衰退速率?；?色柱顯示相對于最佳單突變體的速率（參見實(shí)施例5,圖5A)并其通過除以最佳（最低）的 速率值計(jì)算。例如，最佳單突變體D519AE665A對的速率相對值等于D519AE665A的衰退速 率除以D519A的衰退速率。黑色柱顯示表示為10倍的實(shí)際衰退速率參數(shù)值。
[0028] 圖10為圖解野生型因子VIII和將Asp519、Glu665和/或Glul984殘基變?yōu)锳la 或Val的因子VIII雙組合突變體或三組合突變體的因子Villa活性衰退速率的圖。如實(shí) 施例中所描述的，在不存在因子IXa的條件下孵育1. 5nM因子Villa后進(jìn)行因子Villa活 性衰退測量并且通過非線性最小二乘回歸評估了衰退速率?；疑@示相對于最佳單突變 體的速率（參見實(shí)施例7,圖7A)，并且其如圖9的說明中所描述的計(jì)算。黑色柱顯示表示 為10倍的實(shí)際衰退速率參數(shù)值。
[0029] 圖11A-B圖解使用組合突變體的凝血酶生成測定的結(jié)果。圖11A顯示因子VIII蛋 白的凝血酶生成圖。凝血酶生成測定如實(shí)施例中所描述的進(jìn)行。試劑的終濃度為0. 2nM(因 子VIII)、(λ5pM(rTF)、4μM(PSPCPE囊泡）、433uM(熒光底物）、13·3mMCalCl 2和105nM(凝 血酶校準(zhǔn)物）。顯示了野生型（虛線）、D519AE665V(空心圓）、D519VE665V(實(shí)心圓）、 D519VE1984A(空心三角形）和D519VE665VE1984A(實(shí)心三角形）的結(jié)果。圖11B顯示由凝 血酶生成測定所獲得的參數(shù)值。凝血酶生成圖顯示三次重復(fù)樣品的平均值。參數(shù)值表達(dá)為 相對于野生型的值（％ )。野生型的實(shí)際值為8. 5±0. 4分鐘（滯后時(shí)間）、21. 3±0. 6分鐘 (峰時(shí)間）、58· 5±15· 6nM(峰值）、883· 6±199· 8nM/分鐘（ETP)。滯后時(shí)間（空心柱）、峰 時(shí)間（灰色柱）、峰值（實(shí)心柱）和ETP(線紋柱）。誤差線顯示由三次獨(dú)立的測定進(jìn)行平 均的標(biāo)準(zhǔn)偏差值。
[0030] 圖12A-C圖解與Glull3Ala突變的組合的在殘基Asp519、Glu665和/或Glul984 處的Ala或Val突變體的因子VIII和因子Villa的相對于野生型的比活和活性衰退速率。 圖12A顯示使用如實(shí)施例中所描述的一期凝集測定（灰色柱）和二期發(fā)色因子Xa生成測 定（黑色柱）所測定的組合突變體相對于野生型的比活。誤差線顯示由三次獨(dú)立的測定進(jìn) 行平均的標(biāo)準(zhǔn)偏差值。圖12B顯示在55°C下的因子VIII活性衰退測定的結(jié)果，衰退速率通 過如實(shí)施例中所描述的非線性最小二乘回歸評估。圖12C顯示在不存在因子IXa的條件下 孵育1. 5nM因子Villa后進(jìn)行的因子Villa活性衰退測量的結(jié)果，并且衰退速率通過如實(shí) 施例中所描述的非線性最小二乘回歸評估。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明涉及重組因子VIII，所述重組因子VIII具有導(dǎo)致因子VIII和因子Villa 兩者的穩(wěn)定性增強(qiáng)的一種或多種突變。
[0032] 本發(fā)明的重組因子VIII可以通過修飾野生型因子VIII或突變體因子VIII的氨 基酸序列來制備，所述突變體因子VIII已被另外修飾以影響因子VIII的其他特性，如抗原 性、循環(huán)半衰期、蛋白分泌、對因子IXa和/或因子X的親和力、改變的因子VIII滅活裂解 位點(diǎn)、免疫原性、架存期等。
[0033] 可以根據(jù)本發(fā)明被修飾的合適的野生型因子VIII可以來自多種動物，包括但不 限于：哺乳動物，如人（參見，例如GenBank登錄號AAA52484(氨基酸）和K01740(核苷 酸）；和GenBank登錄號CAD97566 (氨基酸）和ΑΧ746360 (核苷酸），通過引用將它們整體 并入本文）、大鼠（參見，例如，GenBank登錄號AAQ21580(氨基酸）和AY362193(核苷酸）， 通過引用將它們整體并入本文）、小鼠（參見，例如，GenBank登錄號AAA37385(氨基酸）和 L05573(核苷酸），通過引用將它們整體并入本文）、豚鼠、狗（參見，例如，GenBank登錄號 AAB87412(氨基酸）和AF016234(核苷酸）；以及GenBank登錄號AAC05384(氨基酸）和 AF049489 (核苷酸），通過引用將它們整體并入本文）、貓、猴、黑猩猩（參見，例如GenBank 登錄號XP_529212 (氨基酸和XM_529212 (核苷酸），通過引用將它們整體并入本文）、猩猩、 牛、馬、綿羊、豬（參見，例如GenBank登錄號NP_999332(氨基酸）和NM_214167(核苷酸）， 通過引用將它們整體并入本文）、山羊、兔和雞。這些和其他序列還可以經(jīng)由血友病A突變、 結(jié)構(gòu)、測試和資源網(wǎng)站（或HAMSTeRS)以電子方式獲得，該網(wǎng)站還提供人、豬、鼠和犬的因子 VIII蛋白的比對。因此，哺乳動物因子VIII蛋白的保守性和同源性是熟知的。
[0034] 舉例來說，人因子VIII cDNA核苷酸和預(yù)測的氨基酸序列分別以SEQ ID N0 :1和2 顯示在下面。人因子VIII是作為約300kDa的單鏈蛋白合成的，它具有定義"結(jié)構(gòu)域"序列 NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H的內(nèi)在序列同源性。在因子VIII分子中，如本文所用的"結(jié)構(gòu) 域"為通過內(nèi)在氨基酸序列同一性和凝血酶的蛋白裂解位點(diǎn)定義的連續(xù)的氨基酸序列。除 非另外指明，否則在與人氨基酸序列（SEQ ID NO :2)比對時(shí)，因子VIII結(jié)構(gòu)域包含下列氨 基酸殘基：
[0035] A1，殘基 Ala「Arg372 ;
[0036] A2,殘基 Ser373-Arg74(l ;
[0037] B，殘基 Ser741_Arg1648 ;
[0038] A3,殘基 Ser翻_Ile2032 ;
[0039] Cl，殘基 Arg2(l33_Asn2172 ;以及
[0040] C2,殘基 Ser2173-Tyr2332。
[0041] A3-C1-C2序列包含殘基Ser169(l-Tyr2332。剩余的序列殘基Glu 1649-Arg1689通常被稱 為因子VIII輕鏈激活肽。因子VIII被凝血酶或因子Xa激活，凝血酶或因子Xa將它從馮 維勒布蘭德因子解離形成因子Villa，因子Villa具有促凝血功能。因子Villa的生物學(xué) 功能是通過幾級放大來增加因子IXa對因子X激活的催化效力。凝血酶激活的因子Villa 為160kDa的A1/A2/A3-C1-C2異源三聚體，它與因子IXa和因子X在血小板或單核細(xì)胞的 表面上形成復(fù)合體。如本文所用的"部分結(jié)構(gòu)域"是形成結(jié)構(gòu)域的部分的連續(xù)氨基酸序列。
[0042] 編碼野生型人因子VIII的基因具有如下的SEQ ID N0 :1的核苷酸序列：
[0043] gccaccagaagatactacctgggtgcagtggaactgtcatgggactatatgcaaagtgatctcggtgag ctgcctgtggacgcaagatttcctcctagagtgccaaaatcttttccattcaacacctcagtcgtgtacaaaaagac tctgtttgtagaattcacggatcaccttttcaacatcgctaagccaaggccaccctggatgggtctgctaggtccta ccatccaggctgaggtttatgatacagtggtcattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgct gttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatga taaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccac tgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctacta gtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttga tgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggc ctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctat tggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaa ccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagt ttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagag gaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgt ggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttggg tacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaa agtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatga aacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagaca cactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcct ttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaata taaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcg ttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaaga ggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcac agagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatca 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gatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagt gacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaa gaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaat ggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatggg cagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatgg cactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaa tgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccct gggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctgg ccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttg gcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttat catcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttg gcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcaccca 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[0044] 由SEQ ID NO :1編碼的野生型人因子VIII具有如下的SEQ ID NO :2的氨基酸序 列：
[0045] ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRP PWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQV LKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETK NSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASL 1 ISPITFLTAQTLLM1 LGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDD NSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTRE AIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTV E5GPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRF LPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVY I DTLTL FPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTCDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSR HPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGA IDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNT SSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRA HGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKN ATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSL GPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENV VLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYEGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQ IVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKG AITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKK NNLSLAILTLEMTCDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGH LDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKK KDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVE MKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLY RGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAP TKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAP CNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYP GVFlTVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSG SINAffSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSG IKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLH LQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQD SFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
[0046] 在上面的序列中，通過粗體和下劃線標(biāo)記了幾個(gè)帶電荷的殘基，包括Glu287、 Asp302、Asp519、Glu665 和 Glul984。
[0047] 本發(fā)明的重組因子VIII由在A1A2或A2A3結(jié)構(gòu)域界面的任一個(gè)或兩個(gè)的一個(gè)或 多個(gè)帶電荷氨基酸殘基被疏水性氨基酸殘基取代來表征。優(yōu)選地，被取代的帶電荷的殘基 為不參與A1A2結(jié)構(gòu)域之間或A2A3結(jié)構(gòu)域之間的氫鍵鍵合的Glu或Asp殘基。取代帶電 荷的殘基的疏水性氨基酸殘基可以為Ala、Val、lie、Leu、Met、Phe或Trp的任一種。本發(fā) 明的特別優(yōu)選的重組因子VIII包括野生型因子VIII的Glu287殘基的取代、野生型因子 VIII的Asp302殘基的取代、野生型因子VIII的Asp519殘基的取代、野生型因子VIII的 Glu665殘基的取代、野生型因子VIII的Glul984殘基的取代或它們的組合。D302A、E287A、 E665A、E665V、D519A、D519V、E1984A和 E1984V取代對于實(shí)現(xiàn)因子 VIII 和因子 Villa 二者的 穩(wěn)定性增強(qiáng)的重組因子VIII是優(yōu)選的。這些取代的優(yōu)選組合包括但不限于：D519AE665V、 D519VE665V 和 D519VE1984A 雙突變體、以及 D519AE665VE1984A 和 D519VE665VE1984A 三突 變體。認(rèn)為這些突變體的增強(qiáng)的穩(wěn)定性是通過與野生型因子Villa相比穩(wěn)定因子VIII中 的結(jié)構(gòu)域間界面以及降低A2亞基從A1/A3C1C2解離來達(dá)成的。
[0048] 可以根據(jù)本發(fā)明被修飾的合適的突變體因子VIII序列還可以包括任何先前已知 的或隨后被鑒定的突變體因子VIII序列，所述突變體因子VIII序列具有關(guān)于多種屬性的 被修飾的特性，包括但不限于：抗原性、循環(huán)半衰期、蛋白分泌、對因子IXa和/或因子X的 親和力、改變的因子VIII滅活裂解位點(diǎn)、因子Villa的增強(qiáng)的比活、免疫原性和架存期。
[0049] 可以根據(jù)本發(fā)明被修飾的合適的突變體因子VIII的一個(gè)實(shí)例為具有修飾的鈣結(jié) 合位點(diǎn)，優(yōu)選在SEQ ID N0 :2的殘基113處的因子VIII。這提供具有增強(qiáng)的比活的因子 Villa。這種類型的示例性突變體描述在授予Fay等人的美國專利申請公布第10/581，471 號中，通過引用將其整體并入本文。優(yōu)選地，還根據(jù)一種或多種上文所描述的突變（例如， 在位置287、302、519、665和/或1984)修飾殘基113突變體以提供高穩(wěn)定性/高比活的 因子VIII蛋白。示例性的高穩(wěn)定性/高比活的因子VIII蛋白包括但不限于：具有組合的 E113AD519A、E113AD519V、E113AE665A、E113AE665V或E113AE1984V取代的那些。
[0050] 可以根據(jù)本發(fā)明被修飾的合適的突變體因子VIII的第二個(gè)實(shí)例為含有SEQ ID NO :2的氨基酸殘基1-740和1690-2332的無 B結(jié)構(gòu)域的因子VIII (參見，例如授予Lollar 的美國專利第6, 458, 563號，通過引用將其整體并入本文）。
[0051] 在本發(fā)明的無 B結(jié)構(gòu)域的重組因子VIII的一個(gè)實(shí)施方式中，B-結(jié)構(gòu)域被DNA接 頭區(qū)段取代，并且至少一個(gè)密碼子被編碼與豬的因子VIII的相應(yīng)殘基具有相同電荷的氨 基酸殘基的密碼子取代（參見，例如授予Hauser等人的美國專利申請公布第2004/0197875 號，通過引用將其整體并入本文）。
[0052] 在本發(fā)明的無 B結(jié)構(gòu)域重組因子VIII的另一實(shí)施方式中，修飾的突變體因子VIII 被具有插入一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的截短的因子IX內(nèi)含子1的核苷酸序列編碼（參見，例如授予 Negrier的美國專利第6, 800, 461號和授予Negrier的美國專利第6, 780, 614號，通過引用 將他們每一個(gè)整體并入本文）。這種重組因子VIII可用于體外產(chǎn)生較高產(chǎn)率的重組因子 VIII和用于基因治療的轉(zhuǎn)移載體中（參見，例如授予Negrier的美國專利第6, 800, 461號， 通過引用將其整體并入）。在此實(shí)施方式的具體實(shí)例中，重組因子VIII可以被具有插入兩 個(gè)位點(diǎn)的截?cái)嗟囊蜃覫X內(nèi)含子1并且具有適于在造血細(xì)胞系、并且尤其是在血小板中驅(qū)動 表達(dá)的啟動子的核苷酸序列編碼（參見，例如授予Negrier的美國專利第6, 780, 614號，通 過引用將其整體并入本文）。
[0053] 無論實(shí)施方式如何，無 B結(jié)構(gòu)域的因子VIII優(yōu)選含有一種或多種上文所述的突變 (例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。根據(jù)本文的實(shí)施例所制備的重組因子VIII 蛋白為無 B結(jié)構(gòu)域的。
[0054] 可以根據(jù)本發(fā)明被修飾的合適的突變體因子VIII的第三個(gè)實(shí)例為含有一個(gè)或多 個(gè)動物氨基酸殘基作為負(fù)責(zé)人因子VIII的抗原性的人氨基酸殘基的取代的嵌合的人/動 物因子VIII。具體地，動物（例如，豬）殘基取代可以包括但不限于下列的一種或多種： R484A、R488G、P485A、L486S、Y487L、Y487A、S488A、S488L、R489A、R489S、R490G、L491S、 P492L、P492A、K493A、G494S、V495A、K496M、H497L、L498S、K499M、D500A、F501A、P502L、 I503M、L504M、P505A、G506A、E507G、I508M、I508A、M2199I、F2200L、L2252F、V2223A、 K2227E和/或L2251 (授予Lollar的美國專利第5, 859, 204號、授予Lollar的美國專利 第6, 770, 744號和授予Lollar的美國專利申請公布第2003/0166536號，通過引用將它們 每一個(gè)整體并入本文）。優(yōu)選地,重組嵌合因子VIII含有一種或多種上文所述的突變（例 如，在位置 287、302、519、665 和 / 或 1984)。
[0055] 可以根據(jù)本發(fā)明被修飾的合適的突變體因子VIII的第四個(gè)實(shí)例為以下的增 強(qiáng)的親和力的因子VIII:因子IXa(參見，例如Fay等人，"Factor Villa A2Subunit Residues558_565Represent a Factor IXa Interactive Site (因子 Villa A2 亞基殘基 558-565 代表因子 IXa 的相互作用位點(diǎn)），" J. Biol. Chem. 269 (32) :20522-7 (1994) ;Bajaj 等人，"Factor IXa ：Factor Villa Interaction. Helix33〇-338of Factor IXa Interacts with Residues558_565and Spatially Adjacent Regions of the A2Subunit of Factor Villa(因子IXa :因子Villa相互作用。因子IXa的螺旋330-338與因子Villa的A2亞 基的殘基 558-565 和空間鄰近區(qū)相互作用），" J. Biol. Chem. 276 (19) : 16302-9 (2001); 和 Lenting 等人"The Sequence Glul811-Lysl818of Human Blood Coagulation Factor VIII Comprises a Binding Site for Activated Factor IX(人血凝血因子 VIII 的 序列Glul811-Lysl818包含激活的因子IX的結(jié)合位點(diǎn)），" J. Biol. Chem. 271 (4): 1935-40(1996)，通過引用將它們每一個(gè)整體并入本文）和/或因子X(參見，例如Lapan 等人，"Localization of a Factor X Interactive Site in the A1 Subunit of Factor Villa(因子Villa的A1亞基中的因子X相互作用位點(diǎn)的定位Chem. 272 : 2082-88 (1997)，通過引用將其整體并入本文）。優(yōu)選地，親和力增強(qiáng)的因子VIII含有一種 或多種上文所述的突變（例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。
[0056] 可以根據(jù)本發(fā)明被修飾的合適的突變體因子VIII的第五個(gè)實(shí)例為被修飾以增強(qiáng) 因子VIII的分泌的因子VIII (參見，例如Swaroop等人，"Mutagenesis of a Potential Immunoglobulin-Binding Protein-Binding Site Enhances Secretion of Coagulation Factor VIII (可能的免疫球蛋白-結(jié)合蛋白-結(jié)合位點(diǎn)的誘變增強(qiáng)凝血因子VIII的分 泌），" J. Biol. Chem. 272 (39) :24121-4 (1997)，通過引用將其整體并入本文）。優(yōu)選地，分 泌增強(qiáng)的突變體因子VIII含有一種或多種上文所鑒定的突變（例如，在位置287、302、519、 665 和 / 或 1984)。
[0057] 可以根據(jù)本發(fā)明被修飾的合適的突變體因子VIII的第六個(gè)實(shí)例為具有增加 的循環(huán)半衰期的因子VIII。這種修飾可以使用多種方法制備，包括但不限于：通過降 低與下列物質(zhì)的相互作用：硫酸乙酰肝素（Sarafanov等人，"Cell Surface Heparan Sulfate Proteoglycans Participate in Factor VIII Catabolism Mediated by Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein(細(xì)胞表面硫酸乙醜肝素蛋白聚糖參 與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白介導(dǎo)的因子VIII的分解代謝），"J. Biol. Chem. 276(15): 11970-9(2001)，通過引用將其整體并入本文）和/或低密度脂蛋白受體相關(guān)的蛋白 ("LRP"）（Saenko 等人，"Role of the Low Density Lipoprotein-Related Protein Receptor in Mediation of Factor VIII Catabolism(低密度脂蛋白相關(guān)蛋白的受體在介 導(dǎo)因子 VIII 分解代謝中的作用），"J. Biol. Chem. 274 (53) :37685-92(1999);以及 Lenting 等人，"The Light Chain of Factor VIII Comprises a Binding Site for Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein(因子VIII的輕鏈包含低密度脂蛋白受體相關(guān) 蛋白的結(jié)合位點(diǎn)），"J. Biol. Chem. 274(34) :23734-9(1999)，通過引用將他們每一個(gè)整體 并入本文）。優(yōu)選地，半衰期增強(qiáng)的突變體因子VIII含有一種或多種上文所述的突變（例 力口，在位置 287、3〇2、519、 665 和 / 或 1洲4)。
[0058] 可以根據(jù)本發(fā)明被修飾的合適的突變體因子VIII的第七個(gè)實(shí)例為由以下核苷 酸序列編碼的修飾的因子VIII，該核苷酸序列經(jīng)過修飾編碼在已知的現(xiàn)有的表位中的氨 基酸以在天冬酰胺殘基處產(chǎn)生糖基化的識別序列（參見，例如授予Lollar的美國專利第 6, 759, 216號，通過引用將其整體并入本文）。此實(shí)例的突變體因子VIII可用于提供逃離 存在的抑制抗體檢測（低抗原性因子VIII)和降低發(fā)展抑制抗體的可能（低免疫原性因子 VIII)的修飾的因子VIII。在這個(gè)實(shí)例的一個(gè)具體的實(shí)施方式中，修飾的因子VIII被突變 為具有N-連接的糖基化的共有氨基酸序列。這種共有序列的實(shí)例為N-X-S/T，其中N為天 冬酰胺，X為任一氨基酸，并且S/T代表絲氨酸或蘇氨酸（參見授予Lollar的美國專利第 6, 759, 216號，通過引用將其整體并入本文）。優(yōu)選地，糖基化位點(diǎn)被修飾的因子VIII含有 一種或多種上文所鑒定的突變（例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。
[0059] 可以根據(jù)本發(fā)明被修飾的合適的突變體因子VIII的第八個(gè)實(shí)例為修飾的因 子VIII，該修飾的因子VIII為具有多種突變的促凝血活性的因子VIII (參見，例如授予 Kaufman等人的美國專利申請公布第2004/0092442號，通過引用將其整體并入本文）。這 種實(shí)施方式的一個(gè)實(shí)例涉及被進(jìn)行如下修飾的修飾的因子VIII :(i)缺失馮維勒布蘭德因 子結(jié)合位點(diǎn)；（ii)在Arg740處添加突變；和（iii)在A2和A3結(jié)構(gòu)域之間添加氨基酸序列 間隔區(qū)，其中所述氨基酸間隔區(qū)具有足以在激活后使促凝血活性因子VIII蛋白變?yōu)楫愒?二聚體的長度（參見授予Kaufman等人的美國專利中請公部第2004/0092442號，通過引用 將其整體并入本文）。優(yōu)選地，促凝血活性的因子VIII還被修飾以含有一種或多種上文所 述的突變（例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。
[0060] 此外，突變體因子VIII可以被修飾以具有通常關(guān)于重組凝血因子的多種優(yōu)勢（參 見，例如 Saenko 等人，"The Future of Recombinant Coagulation Factors (重組凝血因 子的前景），"J. Thrombosis and Haemostasisl :922_930(2003)，通過引用將其整體并入本 文）。
[0061] 本發(fā)明的重組因子VIII可以在使A1A2或A2A3結(jié)構(gòu)域界面不穩(wěn)定的任何帶電荷 的殘基（包括位置87、302、519、665或1984)處被修飾；以及被修飾為無8結(jié)構(gòu)域、嵌合的、 具有增強(qiáng)因子Villa活性的修飾的鈣結(jié)合位點(diǎn)（例如，在位置113處）、具有改變的滅活裂 解位點(diǎn)、具有增強(qiáng)的因子IXa和/或因子X親和力、具有增強(qiáng)的分泌、具有增加的循環(huán)半衰 期、或具有突變體糖基化位點(diǎn)；或除對帶電荷的殘基的一個(gè)或多個(gè)修飾外再進(jìn)行任何一種 或多種此類修飾，包括改善重組因子VIII的活性的修飾的|丐結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)施例中描述了許 多示例性的無 B結(jié)構(gòu)域、比活增強(qiáng)、高穩(wěn)定性的重組因子VIII蛋白。
[0062] 重組因子VIII優(yōu)選以基本上純的形式制備。在具體的實(shí)施方式中，基本上純的重 組因子VIII為至少約80%純的，更優(yōu)選至少90%純的，最優(yōu)選至少95%純的?；旧霞兊?重組因子VIII可以通過本領(lǐng)域內(nèi)熟知的常規(guī)技術(shù)獲得。通常，基本上純的重組因子VIII 是被分泌到重組宿主細(xì)胞的生長培養(yǎng)基中的?？蛇x擇地，制備了基本上純的重組因子VIII， 但是其并不分泌到生長培養(yǎng)基中。在這種情況下，為了分離基本上純的重組因子VIII，繁殖 攜帶重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，通過超聲、加熱或化學(xué)處理將其裂解，并將勻漿物離心以去除細(xì) 胞碎片。然后對上清液進(jìn)行硫酸銨分級沉淀。將含有基本上純的重組因子VIII的級分在 合適尺寸的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中進(jìn)行凝膠過濾以分離重組因子VIII。如果需要，蛋白 級分（含有基本上純的重組因子VIII)可以進(jìn)一步通過高效液相色譜（"HPLC"）來純化。
[0063] 本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的重組因子VIII的分離的核酸分子。編碼重 組因子VIII的分離的核酸分子可以為RNA或DNA。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼增強(qiáng)因子VIII的比活的位置 113處的突變，同時(shí)還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種（例如，在SEQ ID N0 :2的位 置287、302、519、665、1984和/或332-340)修飾的核苷酸序列。
[0065] 在另一實(shí)施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼上文所述類型的無 B結(jié)構(gòu)域因 子VIII，同時(shí)還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種（例如，在SEQ ID N0 :2的位置287、 302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。
[0066] 在另一實(shí)施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼上文所述類型的嵌合的人/豬 因子VIII，同時(shí)還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種（例如，在SEQ ID N0:2的位置 287、302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。
[0067] 在另一實(shí)施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼滅活位點(diǎn)被如上文所述修飾的 因子VIII，同時(shí)還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種（例如，在SEQ ID N0 :2的位置 287、302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。
[0068] 在又一實(shí)施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼對因子IXa和/或因子X的親 和力增強(qiáng)了的因子VIII，同時(shí)還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種（例如，在SEQ ID NO :2的位置287、302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。
[0069] 在再一實(shí)施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼對多種血清結(jié)合蛋白的親和力 被改變以增加其循環(huán)半衰期的因子VIII，同時(shí)還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種 (例如，在SEQ ID N0 :2的位置287、302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。
[0070] 在另一實(shí)施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼在培養(yǎng)物中分泌增加的因子 VIII，同時(shí)還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種（例如，在SEQ ID N0 :2的位置287、 302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。
[0071] 在另一實(shí)施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼具有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的 糖基化位點(diǎn)的因子VIII，同時(shí)還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種（例如在SEQ ID NO :2的位置287、302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。
[0072] 在又一實(shí)施方式中，分離的核酸分子編碼在任何一個(gè)或多個(gè)如上文所描述的帶電 荷的殘基處被修飾并且還被修飾以具有下列的任何兩個(gè)或更多個(gè)的分離的核酸分子：被修 飾為無 B結(jié)構(gòu)域、被修飾為嵌合的、被修飾為具有改變的滅活裂解位點(diǎn)、被修飾為具有增強(qiáng) 的因子IXa和/或因子X親和力、被修飾為具有增強(qiáng)的分泌、被修飾為具有增加的循環(huán)半衰 期、被修飾為具有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)、以及在鈣結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)（例如，在位 置113)被修飾以便改善重組因子VIII的比活。
[0073] 本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明的分離的DNA分子的重組DNA表達(dá)系統(tǒng)，該表 達(dá)系統(tǒng)編碼重組因子VIII。在一個(gè)實(shí)施方式中，DNA分子相對于啟動子在有義方向上。
[0074] 本發(fā)明的另一方面涉及包含編碼本發(fā)明的重組因子VIII的分離的核酸分子的宿 主細(xì)胞。在具體的實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可以含有DNA分子形式的分離的核酸分子，所述 DNA分子形式為穩(wěn)定的質(zhì)?；蛟谒拗骷?xì)胞基因組中的穩(wěn)定的插入序列或整合序列。在另一 實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可以含有在表達(dá)系統(tǒng)中的DNA分子。合適的宿主細(xì)胞可以為但不限 于：動物細(xì)胞（例如，幼倉鼠腎（"BHK"）細(xì)胞）、細(xì)菌細(xì)胞（例如，大腸桿菌（E. coli))、昆 蟲細(xì)胞（例如，Sf9細(xì)胞）、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞（例如，酵母菌（Saccharomyces)或裂殖酵母 屬（Schizosaccharomyces))、植物細(xì)胞（例如，擬南芥（Arabidopsis)細(xì)胞或煙草細(xì)胞）、 或藻類細(xì)胞。
[0075] 重組DNA表達(dá)系統(tǒng)和宿主細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的多種重組技術(shù)來制備，如 下文所進(jìn)一步討論的。
[0076] 可以使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)將編碼本發(fā)明的重組因子VIII的DNA分子整合到 細(xì)胞中。一般地，這包括將DNA分子插入到該DNA分子為異源（即，不是正常存在的）的表 達(dá)系統(tǒng)中。異源DNA分子以有義方向和正確的閱讀框插入表達(dá)系統(tǒng)或載體中。載體含有 用于插入的編碼蛋白的序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供 含有本發(fā)明的分離的核酸的DNA構(gòu)建體，所述分離的核酸與5'啟動子和3'調(diào)節(jié)區(qū)（即，轉(zhuǎn) 錄終止子）兩者可操作連接，所述5'啟動子和3'調(diào)節(jié)區(qū)能夠使本發(fā)明的編碼的重組因子 VIII在宿主細(xì)胞或宿主生物體中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
[0077] 關(guān)于本發(fā)明的重組表達(dá)系統(tǒng)，含有編碼本發(fā)明的重組因子VIII的DNA分子的表達(dá) 載體可以使用本領(lǐng)域內(nèi)的常見技術(shù)制備?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)所熟知的試劑將本發(fā)明的核酸 分子插入到許多可用的表達(dá)載體的任一種中。在制備用于表達(dá)的DNA載體中，可以將DNA序 列正常地插入到或取代到細(xì)菌質(zhì)粒中?？梢圆捎萌魏畏奖愕馁|(zhì)粒，它們的特征為具有細(xì)菌 復(fù)制系統(tǒng)、容許在細(xì)菌中進(jìn)行選擇的標(biāo)志物和方便定位的一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的限制位點(diǎn)。載 體的選擇取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和用于轉(zhuǎn)化的靶宿主。
[0078] 可以采用多種宿主-載體系統(tǒng)來表達(dá)編碼重組因子VIII的序列。主要地，載體 系統(tǒng)必須與所用的宿主細(xì)胞相容。宿主-載體系統(tǒng)包括但不限于下列：用噬菌體DNA、質(zhì)粒 DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；微生物，如含酵母載體的酵母；用病毒（例加，痘苗病毒、腺病 毒、腺伴隨病毒等）感染的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒（例如，桿狀病毒）感染的昆蟲細(xì)胞 系統(tǒng)；和用細(xì)菌（例如，土壤桿菌屬（Agrobacterium))感染的植物細(xì)胞。這些載體的表達(dá) 元件在它們的強(qiáng)度和特異性方面不同。依據(jù)所采用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用大量合適 的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件的任一種。
[0079] 當(dāng)以重組方式制備時(shí)，在重組的宿主細(xì)胞中表達(dá)因子VIII蛋白或多肽（或它們的 片段或變體），所述重組的宿主細(xì)胞通常但不排他地為真核細(xì)胞。
[0080] 用于實(shí)施本發(fā)明的合適的載體包括但不限于：下列病毒載體，如λ載體系統(tǒng) gtll、gtWES. tB、Charon4 ;和質(zhì)粒載體，如 pCMV、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、 pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKClOl、SV40、pBluescript II SK+/-或 pBluescript II KS+/_(參見 "Stratagene Cloning Systems (Stratagene 克隆系統(tǒng)），' 目錄（1993))、pQE、pIH821、pGEX、pET 系列（Studier 等人，"Use of T7RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes(使用T7RNA聚合酶來指導(dǎo)克隆的基因的表 達(dá)），'Methods in Enzymologyl85 :60-89 (1990)，通過引用將其整體并入本文）；以及它們 的任何衍生物。現(xiàn)在已知的或今后描述的用于遺傳轉(zhuǎn)化的任何合適的載體適用于本發(fā)明。
[0081] 可以經(jīng)由轉(zhuǎn)化，尤其是轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、動員或電穿孔將重組分子引入細(xì)胞。使用本 領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法將DNA序列克隆到載體中，如Maniatis等人在下面文獻(xiàn)中所描述 的，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊），Cold Springs Harbor，Ν· Y. :Cold Springs Laboratory，（1982)，通過引用將其整體并入本文。
[0082] 通過引用整體并入本文的授予Cohen和Boyer的美國專利第4, 237, 224號描述了 使用限制酶裂解和用DNA連接酶連接制備重組質(zhì)粒形式的表達(dá)載體。然后通過轉(zhuǎn)化方法引 入這些重組質(zhì)粒并在單細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制，所述單細(xì)胞培養(yǎng)物包括原核生物體和以組織培 養(yǎng)物生長的真核細(xì)胞。
[0083] 不同的遺傳信號和加工事件控制著許多水平的基因表達(dá)（例如，DNA轉(zhuǎn)錄和信使 RNA (mRNA)翻譯）。
[0084] DNA轉(zhuǎn)錄依賴于啟動子的存在，所述啟動子為指導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合并從而促進(jìn) mRNA合成的DNA序列。真核啟動子的DNA序列與原核啟動子的DNA序列不同。此外，真核 啟動子和伴隨的遺傳信號在原核系統(tǒng)中可能不被識別或可能不起作用；并且，另外，原核啟 動子在真核細(xì)胞中不被識別并且不起作用。
[0085] 類似地，原核細(xì)胞中的mRNA翻譯依賴于適當(dāng)?shù)脑诵盘柕拇嬖?，該原核?號與真核細(xì)胞的信號不同。mRNA在原核細(xì)胞中的有效翻譯需要在mRNA上的稱為 Shine-Dalgamo("SD"）序列的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)序列為位于起始密碼子前的短的mRNA 核苷酸序列，所述起始密碼子通常為AUG，它編碼蛋白氨基末端的蛋氨酸。SD序列與16S rRNA(核糖體RNA)的3'末端互補(bǔ)并且可能通過與rRNA形成雙鏈體來促進(jìn)mRNA與核糖體 的結(jié)合從而容許核糖體正確定位。對于使基因表達(dá)最大化的綜述，參見Roberts和Lauer， Methods in Enzymology68 :473 (1979)，通過引用將其整體并入本文。
[0086]啟動子在它們的"強(qiáng)度"（即，它們促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力）方面不同。為了表達(dá)克隆 的基因的目的，通常希望使用強(qiáng)啟動子以獲得高水平的轉(zhuǎn)錄和因此的高水平基因表達(dá)。依 據(jù)所采用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可以使用大量合適的啟動子的任一種。例如，當(dāng)在大腸桿菌 (Escherichia coli)中克隆時(shí)，它的噬菌體或質(zhì)粒啟動子，如T7噬菌體啟動子、lac啟動 子、trp啟動子、recA啟動子、核糖體RNA啟動子、大腸桿菌噬菌體λ的Ρ κ啟動子和啟 動子以及包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等的其他啟動子可用于指導(dǎo)鄰近的DNA區(qū) 段的高水平轉(zhuǎn)錄。此外，雜合的trp-lacUV5(tac)啟動子或由重組DNA或其他合成DNA技 術(shù)所制備的其他大腸桿菌啟動子可用于提供插入的基因的轉(zhuǎn)錄。
[0087] 可以選擇在不特異性誘導(dǎo)的時(shí)候抑制啟動子作用的細(xì)菌宿主細(xì)胞株系和表達(dá)載 體。在某些操作中，特異性誘導(dǎo)物的添加是插入的DNA有效轉(zhuǎn)錄所必需的。例如，lac操縱 子通過添加乳糖或IPTG(異丙基硫代-β -D-半乳糖苷）誘導(dǎo)。諸如trp、pro等的許多其 他操縱子處于不同的控制下。
[0088] 特異性起始信號也是原核細(xì)胞中有效的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的。如分別由合成的 基因特異性信使RNA和蛋白的量所測量的，這些轉(zhuǎn)錄和翻譯起始信號強(qiáng)度可以不同。含有 啟動子的DNA表達(dá)載體還可以含有多種"強(qiáng)"轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始信號的任何組合。例如， 大腸桿菌中的有效翻譯需要距起始密碼子（"ATG"）的5'端約7-9個(gè)堿基的SD序列以提 供核糖體結(jié)合位點(diǎn)。因此，可以采用宿主細(xì)胞核糖體可以利用的任何SD-ATG組合。這種組 合包括但不限于：來自大腸桿菌噬菌體λ的 cro基因或N基因或來自大腸桿菌色氨酸E、 D、C、B或A基因的SD-ATG組合。此外，可以使用通過重組DNA或包括整合合成的核苷酸的 其他技術(shù)制備的任何SD-ATG組合。
[0089] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子以有義方向整合到合適的載體中以便使開 放閱讀框正確地確定方向以便編碼的蛋白在所選擇的啟動子的控制下表達(dá)。這包括將合適 的調(diào)節(jié)元件引入DNA-載體構(gòu)建體。這些包括載體的非翻譯區(qū)、有用的啟動子和5'和3'的 非翻譯區(qū)，它們與宿主細(xì)胞蛋白相互作用以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些元件在它們的強(qiáng)度和特 異性方面可以不同。依據(jù)所利用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)目的合適的轉(zhuǎn)錄和翻 譯元件,包括組成型的和誘導(dǎo)型的啟動子。
[0090] 組成型的啟動子為在生物體的整個(gè)發(fā)育和生命中指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動子。
[0091] 誘導(dǎo)型啟動子為能夠響應(yīng)于誘導(dǎo)物直接或間接激活一種或多種DNA序列或基因 的轉(zhuǎn)錄的啟動子。在不存在誘導(dǎo)物的條件下，DNA序列或基因?qū)⒉槐晦D(zhuǎn)錄。
[0092] 本發(fā)明的DNA構(gòu)建體還可以包括可操作地連接至編碼所選擇的蛋白的DNA分子的 3'調(diào)節(jié)區(qū)，該3'調(diào)節(jié)區(qū)選自能夠提供在所選的宿主細(xì)胞中表達(dá)的正確的轉(zhuǎn)錄終止和mRNA 多聚腺苷酸化的那些。
[0093] 可以使用如下列文獻(xiàn)中所描述的熟知的分子克隆技術(shù)將所選擇的載體、啟動子 和合適的3'調(diào)節(jié)區(qū)連接在一起以制備本發(fā)明的DNA構(gòu)建體：Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊），第二版，Cold Spring Harbor Press，NY(1989);和 Ausubel，F(xiàn).M.等人 Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn) 代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)），New York，N. Y John Wiley&Sons(1989)，通過引用將它們每一個(gè) 整體并入本文。
[0094] 如所注意到的，使用原核宿主細(xì)胞的一個(gè)替代方案為使用真核宿主細(xì)胞，如哺 乳動物細(xì)胞，真核宿主細(xì)胞也可用于重組制備本發(fā)明的重組因子VIII。適于實(shí)施本發(fā) 明的哺乳動物細(xì)胞包括，但不限于：C0S (例如，ATCCNo. CRL1650或1651)、BHK (例如， ATCC No. CRL6281)、CH0(例如，ATCC No. CCL61)、HeLa(例如，ATCC No. CCL2)、293(ATCC No. 1573)、CHOP、和 NS-1 細(xì)胞。
[0095] 用于在哺乳動物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的合適的表達(dá)載體通常包括啟動子以及本領(lǐng)域 內(nèi)已知的其他轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。常見的啟動子包括SV40、MMTV、金屬硫蛋白-1、腺病毒 Ela、CMV、極早期（immediate early)、免疫球蛋白重鏈啟動子和增強(qiáng)子和RSV-LTR。
[0096] -旦制備了本發(fā)明的DNA構(gòu)建體，其便可容易地被整合到宿主細(xì)胞中。因此，本發(fā) 明的另一方面涉及制備重組細(xì)胞的方法?；镜兀朔椒ㄍㄟ^在有效地在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生 DNA分子轉(zhuǎn)錄的條件下用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來進(jìn)行?？梢越?jīng)由轉(zhuǎn)化，尤其是 轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、動員或電穿孔將重組分子引入細(xì)胞。
[0097] 根據(jù)本文所討論的重組技術(shù)，本發(fā)明的另一方面涉及制備本發(fā)明的重組因子VIII 的方法。此方法包括將本發(fā)明的宿主細(xì)胞在使宿主細(xì)胞表達(dá)重組因子VIII的條件下培養(yǎng)。 然后分離重組因子VIII。在一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中體外生長。在具體 的實(shí)施方式中，合適的生長培養(yǎng)基可以包括但不限于含有馮維勒布蘭德因子（在本文中稱 為"VWF"）的生長培養(yǎng)基。在這個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可以含有編碼VWF的轉(zhuǎn)基因或VWF 可以作為補(bǔ)充物被引入生長培養(yǎng)基。生長培養(yǎng)基中的VWF將容許重組因子VIII的較高表 達(dá)水平。一旦重組因子VIII被分泌到生長培養(yǎng)基中，隨后便可以使用相關(guān)的重組DNA和蛋 白領(lǐng)域內(nèi)的那些普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)（包括本文所描述的那些技術(shù)）將其從生長培 養(yǎng)基中分離。在另一實(shí)施方式中，制備本發(fā)明的重組因子VIII的方法還包括在分離重組因 子VIII之前破壞宿主細(xì)胞。在這個(gè)實(shí)施方式中，重組因子VIII是從細(xì)胞碎片中分離的。
[0098] 位置287、302、519、665和/或1984處的修飾是尤其優(yōu)選的，因?yàn)樗麄儗?dǎo)致因子 VIII和因子Villa兩者的穩(wěn)定性增強(qiáng)。這種增加的穩(wěn)定性對于因子VIII的循環(huán)半衰期和 血液凝集期間因子Villa的活性是很重要的。此外，這種特性在用于治療用途的蛋白的純 化和制備期間增強(qiáng)可用因子VIII的回收方面很重要。
[0099] 當(dāng)表達(dá)載體用于體內(nèi)轉(zhuǎn)化以誘導(dǎo)靶細(xì)胞中的因子VIII表達(dá)的目的時(shí)，可以依據(jù) 所需的增強(qiáng)程度采用不同強(qiáng)度的啟動子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)哺乳動物啟動子作為 啟動子的強(qiáng)度而容易地選擇合適的哺乳動物啟動子?？蛇x擇地，可以為了在需要表達(dá)或抑 制因子VIII時(shí)進(jìn)行控制的目的而采用誘導(dǎo)型啟動子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以從本領(lǐng)域內(nèi) 已知的那些誘導(dǎo)型哺乳動物啟動子中選擇合適的啟動子。最后，可以選擇組織特異性哺乳 動物啟動子以將任何基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的效力限制在特定的組織中。組織特異性啟動子是本領(lǐng) 域內(nèi)已知的并且可以根據(jù)要治療的組織或細(xì)胞類型選擇。
[0100] 本發(fā)明的另一方面涉及治療動物的諸如血友病尤其是血友病A的血液疾患的方 法。這種方法包括給表現(xiàn)血友病A的動物施用有效量的本發(fā)明的重組因子VIII，從而使動 物在血管損傷后表現(xiàn)出有效的血液凝集。合適的有效量的重組因子VIII可以包括但不限 于約10至約50單位/千克動物體重之間。所述動物可以為任何動物，但是優(yōu)選為人、大鼠、 小鼠、豚鼠、狗、貓、猴、黑猩猩、猩猩、牛、馬、綿羊、豬、山羊或兔。
[0101] 本發(fā)明的重組因子VIII可用于在具有和不具有抑制抗體的血友病患者中和由于 抑制抗體的顯現(xiàn)所引起的獲得性因子VIII缺乏的患者中治療由因子VIII缺乏所致的不受 控的出血（例如，關(guān)節(jié)內(nèi)、顱內(nèi)或胃腸出血）。在具體的實(shí)施方式中，根據(jù)與用于人或動物 因子VIII相同的方法將單獨(dú)的重組因子VIII或藥物組合物形式（即，與穩(wěn)定劑、遞送溶媒 (delivery vehicles)和/或載體組合）的重組因子VIII靜脈內(nèi)輸注給患者。
[0102] 可選擇地，或除此之外，可以如下來施用重組因子VIII :通過施用如腺伴隨病毒 的病毒載體（Gnatenko 等人，"Human Factor VIII Can Be Packaged and Functionally Expressed in an Adeno-associated Virus Background Applicability to Hemophilia A Gene Therapy (人因子VIII可以在腺伴隨病毒背景中被包裝并功能性表達(dá)：血友病A基 因治療的適用性"Br.J. Haematol. 104 :27-36(1999)，通過引用將其整體并入本文）； 或通過移植遺傳工程化以制備重組因子VIII的細(xì)胞，通常經(jīng)由含這種細(xì)胞的裝置進(jìn)行移 植。這種移植通常包括使用重組皮膚成纖維細(xì)胞，一種非病毒方法（Roth等人，"Nonviral Transfer of the Gene Encoding Coagulation Factor VIII in Patients with Sever Hemophilia(在患重度血友病的患者中編碼凝血因子VIII的基因的非病毒轉(zhuǎn)移）."New Engl. J. Med. 344 :1735-1742 (2001)，通過引用將其整體并入本文）。
[0103] 應(yīng)施用給需要這種治療的患者的重組因子VIII的治療劑量依據(jù)因子VIII缺乏的 嚴(yán)重程度而不同。一般地，在頻率、持續(xù)時(shí)間和單位方面調(diào)節(jié)劑量水平以與各患者的出血發(fā) 作的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間一致。因此，如標(biāo)準(zhǔn)的凝集測定所測量的，重組因子VIII以足以 遞送給患者治療有效量的蛋白以停止出血的量包含在藥物上可接受的載體、遞送溶媒或穩(wěn) 定劑內(nèi)。
[0104] 因子VIII經(jīng)典地被定義為存在于正常血漿中糾正由患血友病A的個(gè)體所獲得 的血漿中的凝集缺陷的物質(zhì)。純化的和部分純化的形式的因子VIII的體外促凝血活性 被用于計(jì)算輸注到人患者中的重組因子VIII的劑量并且是從患者血漿中恢復(fù)活性和體 內(nèi)出血缺陷糾正的可靠指不物。根據(jù)Lusher等人，〃Recombinant Factor VIII for the Treatment of Previously Untreated Patients with Hemophilia A-Safety， Efficacy， and Development of Inhibitors (用于治療之前未被治療的患血友病A的患者的重 組因子VIII-抑制劑的安全性、效力和開發(fā)）" New Engl. J. Med 328 :453-459 (1993); Pittman 等人，"A2Domain of Human Recombinant-derived Factor VIII is Required for Procoagulant Activity but not for Thrombin Cleavage (人重組衍生的因子 VIII 的A2結(jié)構(gòu)域是促凝血活性所需的但不是凝血酶裂解所需的）." Bl〇〇d79 :389-397 (1992); 和 Brinkhous 等人，"Purified Human Factor VIII Procoagulant Protein ：Comparative Hemostatic Response After Infusions into Hemophilic and von ffillebrand Disease Dogs (純化的人因子VIII促凝血蛋白：輸注到患血友病的狗和患馮維勒布蘭德疾病的狗中 之后的比較性止血反應(yīng)），" Proc. Natl. Acad. Sci. 82 :8752-8755 (1985)，通過引用將它們 整體并入本文，在新的因子VIII分子的體外標(biāo)準(zhǔn)測定和他們在狗輸注模型或人患者中的 行為之間沒有報(bào)道差異。
[0105] 通常，通過施用重組因子VIII在患者中實(shí)現(xiàn)的期望的血漿因子VIII活性水平在 正常的30-100%的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療性重組因子VIII的施用以靜脈內(nèi)給 予，優(yōu)選的劑量在約5至50單位/kg體重的范圍內(nèi)，具體在10-50單位/kg體重的范圍內(nèi)， 更具體為20-40單位/kg體重的劑量；頻率間隔為約8至24小時(shí)（重度感染的血友病患 者）的范圍內(nèi)；治療持續(xù)時(shí)間天數(shù)在1至10天的范圍內(nèi)或直至出血發(fā)作消退。參見，例如， Roberts 和 Jones, "Hemophilia and Related Conditions-Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II，F(xiàn)actor V，and Factors VII to XII)(血友病和相關(guān)病癥-凝血 酶原（因子Π 、因子V和因子VII至XII)先天性的缺乏），"Ch. 153,1453-1474,1460, in Hematology (血液學(xué)），Williams，W J.等人，編輯（1990)，通過引用將其整體并入本文。具 有抑制劑的患者可能需要與它們先前的因子VIII形式不同的重組因子量。例如，患者可能 需要較少的重組因子VIII，因?yàn)樵撝亟M因子VIII比野生型VIII具有更高的比活和降低的 抗體反應(yīng)性。對于使用人或血漿來源的因子VIII的治療，輸注的治療性重組因子VIII的 量通過一期因子VIII凝血測定來界定，并且在選擇的情況下，通過測量在輸注后患者血漿 中的因子VIII來測定體內(nèi)恢復(fù)。應(yīng)了解對于任何具體的受試者，應(yīng)根據(jù)個(gè)體的需要和施用 或監(jiān)督組合物施用的人員的專業(yè)判斷隨時(shí)間調(diào)整特定的劑量方案，并且本文所列出的濃度 僅為示例性的，不旨在限制所要求保護(hù)的重組因子VIII的范圍或?qū)嵤?br> [0106] 根據(jù)需要，治療形式可以為重組因子VIII的單次靜脈內(nèi)施用或在長期的時(shí)間階 段內(nèi)的定期施用或連續(xù)施用?？蛇x擇地，治療性重組因子VIII可以與脂質(zhì)體一起以不同時(shí) 間間隔內(nèi)的一個(gè)或幾個(gè)劑量皮下或口服施用。
[0107] 重組因子VIII還可以用于治療在顯示出人因子VIII抗體的血友病患者中由于因 子VIII缺乏所致的不受控的出血。
[0108] 本文證明了本發(fā)明的重組因子VIII的比活可以與野生型因子VIII不同。具有比 野生型因子VIII高的促凝血活性的因子VIII可用于治療血友病，因?yàn)閷⑿枰^低的劑量 來糾正患者的因子VIII缺乏。這不僅降低了患者和保險(xiǎn)公司的醫(yī)療費(fèi)用，還降低了發(fā)展針 對因子VIII的免疫反應(yīng)的可能（因?yàn)槭┯昧溯^少的抗原）。
[0109] 實(shí)施例
[0110] 提供了下列實(shí)施例來說明本發(fā)明的實(shí)施方式，但是它們不意欲限制本發(fā)明的范 圍。
[0111] 材料與方法
[0112] 試劑
[0113] 重組因子 VIII (Kogenate?)是 Bayer Corporation (Berkeley，CA)的 Lisa Regan 博士慷慨贈送的。含有20%磷脂酰膽堿（PC)、40%磷脂酰乙醇胺（PE)和40%磷脂酰絲氨 酸（PS)的磷脂囊泡如先前所述使用辛基葡糖苷制備（Mimms等人，"Phospholipid Vesicle Formation and Transmembrane Protein Incorporation Using Octyl Glucoside (使用 辛基葡糖苷的磷脂囊泡形成和跨膜蛋白整合），"Biochemistry20 :833-840(1981)，通過引 用將其整體并入本文）。試劑α-凝血酶、因子Vila、因子IXaP、因子X和因子Xa (Enzyme Research Laboratories，South Bend，IN)、輕素和憐脂（DiaPharma，West Chester，0H)、發(fā) 色的 Xa 底物 Pefachrome Xa(Pefa_5523，CH3OC〇-D-CHA_GIy-Arg-pNA · AcOH ;Centerchem Inc. Norwalk CT)、重組人組織因子（rTF)、Innovin (Dade Behring，Newark，DE)、突光底物 Z_Gly-Gly-Arg-AMC(Calbiochem，San Diego，CA)和凝血酶校準(zhǔn)物（Diagnostica Stago， Parsippany，NJ)購自所指示的賣主。
[0114] 野生型和變體因子VIII的構(gòu)建、表達(dá)和純化：
[0115] 將 Ala 突變體（在 D27、H281、R282、E287、D302、S313、H317、T522、S524、R531、 N538、E540、S650、S654、D666、E683、N684、S695、D696、S1791、D1795、Q1820、E1829、S1949、 N1950 和 R1966 處）；Phe 突變體（在 Y476、Y664、Y1786 和 Y1792 處）；Ala 和 Val 突變體 (在帶電荷的殘基E272、D519、E665和E1984處）；和野生型因子VIII形式分別構(gòu)建為在B 結(jié)構(gòu)域中缺乏殘基Gln744_Serl637的無 B結(jié)構(gòu)域的因子VIII (Doering等人，"Expression and Characterization of Recombinant Murine Factor VIII (重組鼠因子 VIII 的表 達(dá)和表征），"Thromb Haemost. 88 :450-458(2002),通過引用將其整體并入本文）?？寺?和表達(dá)構(gòu)建體是Pete Lollar博士和John Healey博士慷慨贈送的。如先前所描述的 在BHK細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)重組野生型和變體因子VIII形式并將其純化（Wakabayashi等 人,"Residuesll〇-126in the AlDomain of Factor VIII Contain a Ca2+Binding Site Required for Cofactor Activity)因子VIII的A1結(jié)構(gòu)域中的殘基110-126含有輔因子 活性所需的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)），"J Biol Chem. 279 :12677-12684 (2004)，通過引用將其整體并 入本文）。轉(zhuǎn)染后，變體之間因子VIII分泌的量沒有顯著差異。如通過SDS-PAGE判斷的， 來自兩個(gè)750cm 2培養(yǎng)瓶的變體蛋白產(chǎn)量范圍在大于10μ g至約100μ g，純度為約85%至大 于95%。因子VIII制劑中的主要污染物為白蛋白并且其在因子VIII中存在的濃度顯示對 活性參數(shù)的穩(wěn)定性沒有影響。因子VIII的濃度使用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)測量，并且 因子VIII的活性通過一期凝集測定和二期發(fā)色的因子Xa生成測定來確定，如下文所述。
[0116] SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡
[0117] 將因子VIII蛋白（0. 77yg用于凝膠染色并且0. 34yg用于蛋白質(zhì)印跡）在8% 聚丙烯酰胺凝膠上以恒定電壓（100V)電泳。將凝膠用Gelcode Blue (Thermo Scientific, Rockford，IL)染色；或?qū)⒛z轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上并用生物素化的抗A2抗體（R8B12， Green Mountain Antibodies, Burlington, VT)探測，然后用過氧化物酶軛合的鏈霉親 和素（Calbiochem，San Diego, CA)孵育。使化學(xué)發(fā)光底物（ECF 底物，GE Healthcare, Piscataway，NJ)反應(yīng)，并且使用磷光影象分析儀（Storm860, GE Healthcare)掃描突光信 號。單鏈因子VIII形式（170kDa)和重鏈（HC，90kDa)的密度使用ImageQuant軟件（GE Healthcare)定量并且計(jì)算了量的比率。
[0118] ELISA
[0119] 如先前所描述的進(jìn)行夾心ELISA以測量因子VIII蛋白的濃度（Wakabayashi 等人，"A Glull3Ala Mutation within a Factor VIII Ca2+-Binding Site Enhances Cofactor Interactions in Factor Xase(因子 VIII Ca2+結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的 Glull3Ala 突變 增強(qiáng)因子Xase中的輔因子相互作用），'^Biochemistry44 :10298-10304(2005)，通過引用將 其整體并入本文），使用純化的商業(yè)重組因子VIII (Kogenate，Bayer Corporation)作為標(biāo) 準(zhǔn)物。因子 VIII 的捕獲使用抗 C2 抗體（ESH-8，American Diagnostica Inc.，Stamford， CT)，并采用生物素化的R8B12抗體來進(jìn)行因子VIII檢測。
[0120] -期凝集測定（One-stage Clotting Assay)
[0121] 使用化學(xué)消除了因子VIII的基質(zhì)血漿進(jìn)行一期凝集測定（參見，"Methodology of the One-stage Assay of Factor VIII (VIII :C)(因子 VIII (VIII :C) -期測定的方 法），"Scand J Haematol Suppl. 41 :13-24(1984),通過引用將其整體并入本文）并使用 Diagnostica Stago 凝集儀器進(jìn)行測定。在 37°C下用 APTT 試劑（General Diagnosticsl 孵育血漿6分鐘，然后添加稀釋的因子VIII至杯皿中。1分鐘后對混合物進(jìn)行復(fù)鈣，測定凝 集時(shí)間并將其與混合的正常血漿標(biāo)準(zhǔn)物比較。
[0122] 二期發(fā)色因子Xa生成測定
[0123] 根據(jù)先前所描述的方法（Wakabayashi 等人，"Metal Ion-independent Association of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity (金屬離子非依賴性的因子 VIII 亞 基締合以及鈣離子和銅離子對輔因子活性和亞基間親和力的作用），"Bi〇ChemiStry40 : 10293-10300(2001) ;Wakabayashi 等人，"Ca2+Binding to Both the Heavy and Light Chains of Factor VIII Is Required for Cofactor Activity(Ca2+與因子 VIII 的重鏈 和輕鏈二者的結(jié)合是輔因子活性所需的），" Biochemistry41 :8485-8492 (2002)，通過引 用將它們每一個(gè)整體并入本文），在純化的系統(tǒng)（Lollar等人，"Factor VIII and Factor Villa(因子 VIII 和因子 Villa)，"Methods Enzymol. 222 :128-143(1993)，通過引用將其 整體并入本文）中監(jiān)測因子X向因子Xa轉(zhuǎn)化的速率。用20ηΜα -凝血酶激活在含有20mM N-[2-羥乙基]哌嗪-Ν'- [2-乙烷磺酸](HEPES)，ρΗ7· 2、0· 1M NaCl、0· 01 % 吐溫 20、0· 01 % BSA、5mM CaCl2和10 μ M PSPCPE囊泡的緩沖液（緩沖液A)中的因子VIII (InM) 1分鐘。通 過添加蛭素（l〇U/ml)來終止反應(yīng)并使所得的因子Villa與因子IXa(40nM)反應(yīng)1分鐘。 添加因子X(300nM)以開始反應(yīng)，1分鐘后通過添加50mM EDTA來淬滅反應(yīng)。與發(fā)色底物 Pefachrome Xa(0. 46mM的終濃度）反應(yīng)后測定生成的因子Xa。所有反應(yīng)都在23°C下進(jìn)行。
[0124] 凝血酶生成測定
[0125] 血漿中生成的凝血酶的量通過自動校準(zhǔn)的凝血酶生成圖象法測量（Hemker等人， "Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma(凝集 的血菜中自動校準(zhǔn)的凝血酶生成測量），'T*athophysiol Haemost Thromb. 33:4-15(2003); Hemker 等人，"Thrombin Generation in Plasma ：Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential (血楽中的凝血酶生成：經(jīng)由內(nèi)源凝血酶潛能的凝血酶生成評 估），"Thromb Haemost. 74 :134-138(1995)，通過引用將他們每一個(gè)整體并入本文）。在 96孔板中，將來自缺乏因子VIII抑制劑的重度血友病A患者的80 μ 1缺乏因子VIII (小 于 1%的殘余活性，血小板貧乏）的血菜 (George King Bio-Medical, Overland Park, KS) 與在含有下列物質(zhì)的 HEPES-BSA 緩中液（20mM HEPES，pH7. 35、0. 15M NaCl、6%BSA)中的 因子VIII樣品（20μ 1 ;6nM)混合：3pM rTF(rTF儲液的濃度通過因子Xa生成測定使用 已知濃度的因子Vila測定）、PSPCPE囊泡（24 μ M)，或與20 μ 1凝血酶校準(zhǔn)物（630nM)混 合，并且立即通過與在含有0. 1M CaCl2的HEPES-BSA緩沖液中的20 μ 1熒光底物（2. 5mM， Z-Gly-Gly-Arg-AMC)混合來開始反應(yīng)。在37°C下將所有試劑預(yù)熱。試劑的終濃度為 InM因子VIII(除非另外指明）、0.5pM rTF、4yM PSPCPE囊泡、433以]?熒光底物、13.31111 CalCl；^[I 105nM凝血酶校準(zhǔn)物。使用微板突光分光光度計(jì)（Spetramax Gemini,Molecular Devices, Sunnyvale, CA)用355nm(激發(fā)）/460nm(發(fā)射）的濾光設(shè)置以8秒鐘的間隔監(jiān) 測37°C下的熒光信號的顯現(xiàn)。熒光信號通過來自熒光酶校準(zhǔn)物樣品的參考信號來校正 (Hemker 等人/'Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement in Clotting Plasma(凝集的血楽中自動校準(zhǔn)的凝血酶生成測量h'Tathophysiol Haemost Thromb.33 : 4-15 (2003)，通過引用將他們每一個(gè)整體并入本文）并且如先前所述計(jì)算以nM表示的實(shí)際 凝血酶生成（Hemker 等人，"Thrombin Generation in Plasma ：Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential (血楽中的凝血酶生成：經(jīng)由內(nèi)源凝血酶潛能的凝血酶生 成評估），" Thromb Haemost. 74 :134-138 (1995)，通過引用將其整體并入本文。
[0126] 在較高的溫度下的因子VIII活性
[0127] 在52-60°C下孵育在緩沖液A中的野生型因子VIII或因子VIII變體（4nM)。在所 指示的時(shí)間取出等分試樣并使用二期發(fā)色因子Xa生成測定來測定殘余的因子VIII活性。
[0128] 因子Villa活性的時(shí)程
[0129] 在23°C下用20nM凝血酶激活在含有10 μ M PSPCPE囊泡的緩沖液A中的野生型和 突變體因子VIII(4nM)l分鐘。立即用蛭素（10U/ml)淬滅反應(yīng)，在所指示的時(shí)間取出等分 試樣并在添加因子IXa(40nM)和因子X(300nM)后使用因子Xa生成測定來測定活性。對于 在存在因子IXa的條件下進(jìn)行的衰退測量，在添加凝血酶之前將因子IXa(40nM)添加至反 應(yīng)物中。
[0130] 血漿中的因子VIII穩(wěn)定性
[0131] 將野生型或變體因子VIII (ΙηΜ)添加到來自缺乏因子VIII抑制劑的重度血友病A 患者的缺乏因子VIII (小于1%的殘余活性）的血楽（George King Bio-Medical)中。對 血漿補(bǔ)充〇. 02% NaN3以防止微生物的生長，并在37°C下孵育樣品。在所指示的時(shí)間取出 等分試樣并使用一期凝集測定來測定殘余的活性。
[0132] 數(shù)據(jù)分析
[0133] 通過非線性最小二乘回歸使用如下的等式將因子Villa的活性值作為時(shí)間的函 數(shù)與單指數(shù)衰退曲線擬合：
[0134] A = A〇Xe_k，t
[0135] 其中A為殘余的因子Villa活性（nM/分鐘/nM因子VIII)，為初始活性，k為 表觀速率常數(shù)，并且t為在較高的溫度下因子VIII的反應(yīng)時(shí)間（分鐘）（對于因子VIII 衰退實(shí)驗(yàn)）或在淬滅凝血酶激活后的反應(yīng)時(shí)間（分鐘）（對于因子Villa衰退測量）。通 過Kaleidagraph (Synergy, Reading, PA)進(jìn)行非線性最小二乘回歸分析。通過Student t 檢驗(yàn)進(jìn)行平均值的比較。使用Swiss PDB Viewer分析了因子VIII A結(jié)構(gòu)域的模制結(jié)構(gòu) (Pemberton等人,"A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin(基于人血楽銅藍(lán)蛋 白的晶體結(jié)構(gòu)的人因子VIII的三個(gè)A結(jié)構(gòu)域的分子模型），"Bl〇〇d89 :2413-2421 (1997)， 通過引用將其整體并入本文）以鑒定定位在A2結(jié)構(gòu)域界面的帶電荷的殘基和根據(jù)分離 互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域的極性原子的大于2. 8 A的閾值顯示出極小的氫鍵相互作用可能的帶電荷 的殘基（Weiner 等人，"A New Force Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic Acids Proteins (核酸蛋白的分子機(jī)械模擬的新力場），"J Am Chem Soc. 106: 765-784(1984)，通過引用將其整體并入本文）。
[0136] 實(shí)施例1 :靶向氫鍵相互作用的因子VIII突變體的活性值
[0137] 目前仍然不夠了解的涉及因子VIII中的A2結(jié)構(gòu)域的鍵合相互作用代表了調(diào)節(jié)輔 因子活性的主要機(jī)制。因子VIII同源性模型（Pemberton等人，"A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin(基于人血楽銅藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)的人因子VIII的三個(gè)A結(jié)構(gòu)域 的分子模型），"Bl〇〇d89 :2413-2421 (1997)，通過引用將其整體并入本文）鑒定了許多氫鍵 連接A2結(jié)構(gòu)域中的殘基與A1或A3結(jié)構(gòu)域中的那些殘基的可能。使用氫供體和受體原子 之間的空間間隔小于2. 8 A這一標(biāo)準(zhǔn)（Weiner等人，"A New Force Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic Acids Proteins (核酸蛋白的分子機(jī)械模擬的新力 場），"J Am Chem Soc. 106 :765-784 (1984)，通過引用將其整體并入本文），鑒定出30個(gè)殘 基具有可能參與與來自互補(bǔ)的A結(jié)構(gòu)域的原子氫鍵鍵合的側(cè)鏈原子（參見下表1)。在所鑒 定的殘基的約一半中，側(cè)鏈原子與骨架的羰基氧或酰胺氫原子并置，而剩余的則表現(xiàn)相鄰 側(cè)鏈之間可能有相互作用。除了用Phe取代Tyr之外，將因子VIII A結(jié)構(gòu)域中的靶殘基分 別突變?yōu)锳la，點(diǎn)突變以無 B結(jié)構(gòu)域的因子VIII穩(wěn)定地表達(dá)。
[0138] 使用一期凝集測定和（二期）因子Xa生成測定測量純化的蛋白的因子VIII活性。 來自一期測定（圖1)的結(jié)果表明30個(gè)點(diǎn)突變體中9個(gè)顯示出相對于野生型因子VIII小 于50%的活性。這些變體中的5個(gè)表現(xiàn)出一期/二期測定差異（大于1. 5倍的差異），其 中3個(gè)突變體（S524A、H281A和E287A)僅在二期測定中顯示出降低。在幾個(gè)被靶向的殘基 中突變的活性值降低與那些側(cè)鏈對因子VIII和/或因子Villa的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用一致。
[0139] 表1 :能夠氫鍵鍵合的氨基酸殘基
[0140]

【權(quán)利要求】
1. 一種編碼重組因子VIII的病毒載體，其中所述重組因子VII包含導(dǎo)致因子VIII和 因子Villa二者的穩(wěn)定性增強(qiáng)的一種或多種突變，其中所述一種或多種突變包括在A1A2或 A2A3結(jié)構(gòu)域界面的任一界面或者兩個(gè)界面用疏水性氨基酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)帶電荷的 氨基酸殘基。
2. -種遺傳工程化以制備重組因子VIII的細(xì)胞，其中所述重組因子VII包含導(dǎo)致因子 VIII和因子Villa二者的穩(wěn)定性增強(qiáng)的一種或多種突變，其中所述一種或多種突變包括在 A1A2或A2A3結(jié)構(gòu)域界面的任一界面或者兩個(gè)界面用疏水性氨基酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)帶 電荷的氣基酸殘基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒載體或根據(jù)權(quán)利要求2所述的遺傳工程化的細(xì)胞，其 中所述一種或多種突變包括野生型因子VIII的Glu287殘基的取代、野生型因子VIII的 Asp302殘基的取代、野生型因子VIII的Asp519殘基的取代、野生型因子VIII的Glu665殘 基的取代、野生型因子VIII的Glul984殘基的取代或它們的組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒載體或遺傳工程化的細(xì)胞，其中所述Asp302殘基的取代 為 D302A。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒載體或遺傳工程化的細(xì)胞，其中所述Glu287殘基的取代 為 E287A。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒載體或遺傳工程化的細(xì)胞，其中所述Glu665殘基的取代 為 E665A 或 E665V。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒載體或遺傳工程化的細(xì)胞，其中所述Asp519殘基的取代 為 D519A 或 D519V。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒載體或遺傳工程化的細(xì)胞，其中所述Glul984殘基的取 代為 E1984A 或 E1984V。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的病毒載體或遺傳工程化的細(xì)胞，其中所述一種或多種突變包 括選自下列的兩種或更多種取代：Glu665殘基、Asp519殘基和Glul984殘基。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的病毒載體或遺傳工程化的細(xì)胞，其中所述兩種或更 多種取代包括：D519VE665V、D519AE665V、D519VE1984A、E665VE1984A、E665AE1984V、 D519AE665VE1984A、D519VE665VE1984A 或 D519VE665VE1984V。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒載體或根據(jù)權(quán)利要求2所述用于使用的遺傳工程化的 細(xì)胞，其中所述重組因子VIII還包含下列的一種或多種：（i)經(jīng)修飾以增強(qiáng)重組因子VIII 對因子IXa和因子X中的一種或兩種的親和力的因子IXa和/或因子X結(jié)合結(jié)構(gòu)域；（ii) 增強(qiáng)在培養(yǎng)物中的分泌的修飾的位點(diǎn)；（iii)增強(qiáng)其循環(huán)半衰期的修飾的血清蛋白結(jié)合位 點(diǎn)；（iv)有效降低其抗原性和/或免疫原性的至少一個(gè)糖基化識別序列；和（v)改善重組 因子Villa的活性的修飾的鈣結(jié)合位點(diǎn)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒載體或根據(jù)權(quán)利要求2所述的遺傳工程化的細(xì)胞，其用 于治療動物中的血友病A。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述用于使用的病毒載體或遺傳工程化的細(xì)胞，其中所述動物是 哺乳動物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述用于使用的病毒載體或遺傳工程化的細(xì)胞，其中所述哺乳動 物選自由下列組成的組：人、大鼠、小鼠、豚鼠、狗、貓、猴、黑猩猩、猩猩、牛、馬、綿羊、豬、山 羊、兔和雞。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒載體，其中所述病毒載體包含腺伴隨病毒載體。
16. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的遺傳工程化的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是重組皮膚成纖維細(xì)胞。
17. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的遺傳工程化的細(xì)胞，其中多個(gè)所述細(xì)胞浩瀚在可植入裝置 中。
18. 根據(jù)權(quán)利要求12所述用于使用的病毒載體或遺傳工程化的細(xì)胞，其中所述治療還 包括周期性地重復(fù)施用所述病毒載體或遺傳工程化的細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/10GK104152489SQ201410171441
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2007年11月1日
【發(fā)明者】P.J.費(fèi)伊, H.瓦卡巴亞施 申請人:羅切斯特大學(xué)