一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法，主要包括以下步驟：a)菌種活化與增殖培養(yǎng)；b)收集菌體；c)預(yù)凍及真空冷凍干燥。本發(fā)明中采用白扁豆多糖等作為抗凍因子，使保加利亞乳桿菌具有更好的抗凍能力，同時(shí)使用薏苡仁和山藥混合多糖提取物等為凍干保護(hù)劑，使菌粉有更高的存活率，同時(shí)更好地開發(fā)利用了我國(guó)“藥食同源”中的藥物資源。
【專利說(shuō)明】—種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于保加利亞乳桿菌制品生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)是發(fā)酵生產(chǎn)乳制品的重要乳酸菌，其能賦予酸乳產(chǎn)品柔和的酸味和香氣，可以改進(jìn)產(chǎn)品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)，還具有維持微生態(tài)環(huán)境、抗突變、抗腫瘤、降血脂和提高免疫力等重要功能，因此一直是食品工業(yè)、醫(yī)藥和微生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。
[0003]菌種在真空冷凍干燥時(shí)，酶的活性喪失少，并能保持菌種形態(tài)、色澤，冷凍干燥菌粉復(fù)水性好，脫水徹底，保存期長(zhǎng)，儲(chǔ)存運(yùn)輸和使用都很方便。但是，在實(shí)際的使用時(shí)，冷凍干燥過(guò)程中水的結(jié)晶、細(xì)胞的失水等情況使得菌體出現(xiàn)死亡或損傷，對(duì)于菌種的保存、生產(chǎn)使用非常不利。有報(bào)道稱，菌體在無(wú)任何保護(hù)措施下凍干時(shí)會(huì)使其存活率很低，甚至低至
0.1%。
[0004] 目前，利用凍干技術(shù)制備和貯存保加利亞乳桿菌菌粉己有很多報(bào)道。在實(shí)際使用中，需要獲得高活菌數(shù)的菌粉和減少細(xì)胞在凍干過(guò)程中的損傷。目前最主要的方法是在冷凍干燥前加入凍干保護(hù)劑來(lái)制備凍干菌粉，如CN102952755A中公開了一種保加利亞乳桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑，其配方如下:20~30重量份乳糖、20~30重量份脫脂乳粉、3~5重量份抗壞血酸鈉、0.2~0.6重量份聚乙二醇4000、0.2~0.8重量份聚乙烯吡咯烷酮、0.5~
2.0重量份牛血清白蛋白和100份蒸餾水。另外也有大量關(guān)于保加利亞乳桿菌凍干菌粉的報(bào)道。對(duì)于保加利亞乳桿菌的増菌，專利CN102952722A公開了一種保加利亞乳桿菌的增菌培養(yǎng)基和制備方法，其增菌培養(yǎng)基配方如下:每IOOmL蒸餾水包括0.4g乳糖、0.4mL新生牛血清、0.8g酪蛋白水解物、0.090mL質(zhì)量濃度為1%的羥脯氨酸、0.050mL質(zhì)量濃度為1%的谷氨酸和0.59g Κ2ΗΡ04。專利CN1844354A也公開了一種保加利亞乳桿菌增菌培養(yǎng)基，其主要成分為:菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基100mL、5-15mL番茄汁、0.5_2g蛋白胨、0.1-1.0g乳糖。還有許多研究者也報(bào)道了保加利亞乳桿菌增菌培養(yǎng)基。專利CN103387939A報(bào)道了一種適于25°C發(fā)酵酸奶的保加利亞凍干菌粉的制備方法。
[0005]凍干保護(hù)劑的使用極大地提高了菌體在真空冷凍干燥下的存活率和凍干菌粉的穩(wěn)定性，還可以在培養(yǎng)基中添加一些分子物質(zhì)，這些物質(zhì)可在保加利亞乳桿菌培養(yǎng)時(shí)于體內(nèi)積累或轉(zhuǎn)化成其它物質(zhì)，進(jìn)而抑制凍干過(guò)程中細(xì)胞損傷的發(fā)生。這些物質(zhì)的添加也可改變保加利亞乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的抗凍蛋白，從而有效提高保加利亞乳桿菌菌體的抗冷凍能力，可以達(dá)到減少甚至避免菌體凍干損傷、提高活菌存活率和菌粉活菌數(shù)、減少?gòu)?fù)合凍干保護(hù)劑的添加量、延長(zhǎng)凍干保加利亞乳桿菌菌粉常溫保存期的目的。目前還沒(méi)有檢索到有關(guān)使用保加利亞乳桿菌増菌抗凍培養(yǎng)基來(lái)制備凍干菌粉的報(bào)道和發(fā)明專利。同時(shí)，使用“藥食同源”藥物中的有效物質(zhì)來(lái)刺激保加利亞乳桿菌的菌體增殖、作為抗凍因子和作為凍干保護(hù)劑的報(bào)道也較少。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種更好地開發(fā)利用我國(guó)中藥資源作為凍干保護(hù)劑、提高菌體抗凍能力的保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟:
[0008]a)菌種活化與增殖培養(yǎng):將保加利亞乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中活化，將已活化的菌種接種于增殖抗凍培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，得到增殖的菌液；
[0009]b)收集菌體:將上述增殖的菌液離心處理，棄去上清液，得到菌泥；
[0010]c)干燥:在所制備的菌泥中按每克菌泥添加0.2-0.24g脫脂奶粉、0.06-0.1g抗壞血酸鈉、0.8-1.4mL的磷酸緩沖液、0.1-0.3g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻后真空冷凍干燥，即得保加利亞乳桿菌凍干菌粉；
[0011]所述増殖抗凍培養(yǎng)基配方組成為:乳糖10-20g、海藻糖2_6g、白扁豆多糖
0.2-0.6g、低聚木糖2-4g、酵母提取物4-10g、大豆蛋白胨8_10g、谷氨酸鈉0.6-1.0g、梓檬酸氫二銨 1.0-2.0g、乙酸鈉 1.0-2.0g、磷酸氫二鉀 1.0-2.0g, MnSO40.01-0.06g、吐溫800.5-1.0mL、蒸餾水 1000mL。 [0012]所述步驟a)中活化是指將保加利亞乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中于35_38°C培養(yǎng)22-26h，再按每IOOmL培養(yǎng)基中接種3_5mL菌種的比例，接種于與上述MRS液體培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，并在相同條件下活化至第三代。
[0013]所述步驟a)中增殖培養(yǎng)的接種比例為每IOOmL增殖抗凍培養(yǎng)基中接種3_5mL已活化的菌種。
[0014]所述步驟a)中增殖培養(yǎng)是于35_38°C下培養(yǎng)16_18h。
[0015]所述增殖抗凍培養(yǎng)基的配置步驟包括:
[0016]首先按量稱取乳糖、白扁豆多糖、酵母提取物、大豆蛋白胨、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、MnSO4和吐溫80溶解于蒸餾水a(chǎn)中，加熱溶解、攪拌均勻，再調(diào)pH值至6.4-6.6，按照裝量70% -90%盛放于厭氧瓶中，于118-121°C滅菌15min，冷卻至室溫，得到已滅菌的培養(yǎng)基；
[0017]再稱取海藻糖、低聚木糖和谷氨酸鈉溶解于蒸餾水b中，所述蒸餾水a(chǎn)和蒸餾水b的總量為1000mL,混合均勻后過(guò)濾除菌，將濾液與上述已滅菌的培養(yǎng)基按照無(wú)菌操作要求混合均勻，即得保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基。
[0018]所述白扁豆多糖的制備步驟包括:
[0019]首先將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100-150份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至
5.0-6.8 ；
[0020]其次在40-55 °C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量0.5-2%、活力為8000-1000(^/^的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量1-2%、活力為20000-30000U/g的果膠酶，保溫1.5-2.5h后加熱至沸騰，再保溫15-20min ；
[0021]然后抽濾并將濾液濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，靜置10_14h后抽濾，將所得濾渣于45-55°C烘干，即得白扁豆粗多糖；
[0022]最后取干燥的白扁豆粗多糖溶于水浴加熱至50_70°C的蒸餾水中，按每0.5g白扁豆粗多糖溶于15_20mL蒸餾水的比例計(jì)算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量1-4%的木瓜蛋白酶，酶解0.5-lh后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15-25%體積的Sevag試劑除蛋白20_30min ;2000-4000rpm離心15_20min后取上清液，反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
[0023]所述步驟b)中離心處理為0-4°C、8000-10000rpm離心15_20min。
[0024]所述薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備步驟包括:
[0025]首先將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥混合物粉碎后浸泡于150-200份蒸餾水中，其中薏苡仁和去皮的山藥按1:1混合，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，在80-100°C水浴溫度下提取 1-2h，冷卻至 40-55°C ；
[0026]接著在40_55°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量1-2.5%的果膠酶和0.8-1 %的α -淀粉酶，并保溫1.5-2.0h后加熱至沸騰，再保溫10_15min ；
[0027]然后抽濾并將濾液濃縮，向濃縮液中加入3-4倍體積的95%乙醇，靜置10_14h后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖；
[0028]最后用80%乙醇溶液洗滌粗混合多糖，過(guò)濾后將所得沉淀于45_55°C烘干，即得薏苡仁和山藥混合多糖提取物。
[0029]所述步驟c)中真空冷凍干燥是在凍干機(jī)中進(jìn)行18-24h。
[0030]所述步驟c)中真空冷凍干燥之前在_40°C預(yù)凍6_14h。
[0031]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的保加利亞乳桿菌凍干菌粉是在含白扁豆多糖等物質(zhì)的增殖抗凍培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖的，增殖的菌液經(jīng)離心處理，再加入薏苡仁和山藥混合多糖提取物等物質(zhì)，干燥后得到凍干菌粉，本發(fā)明中采用白扁豆多糖等作為抗凍因子，使保加利亞乳桿菌具有更好的抗凍能力，同時(shí)使用薏苡仁和山藥混合多糖提取物等為凍干保護(hù)劑，使菌粉有更高的存活率，根據(jù)本發(fā)明制備的保加利亞乳桿菌凍干菌粉可使其凍干存活率最高可達(dá)75.21%，菌粉活菌數(shù)最高達(dá)1.96X10nCFU/g ;而以常用的商業(yè)MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)、使用磷酸緩沖液為凍干保護(hù)劑制備的保加利亞乳桿菌菌粉凍干存活率最高僅為19.72%,活菌數(shù)最高僅為7.8X109cfu/g。本發(fā)明中白扁豆多糖中所含有的各種糖類對(duì)保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)具有刺激作用、也是滲透性抗凍因子，另外，其具有抗氧化、增強(qiáng)免疫等作用，對(duì)人體有較大的益處；薏苡仁和山藥多糖中的許多低聚糖對(duì)保加利亞乳桿菌具有良好的冷凍保護(hù)和增殖效果，同樣有利于人體健康，本發(fā)明更好地開發(fā)利用了我國(guó)“藥食同源”中的藥物資源，提高了中藥使用價(jià)值，能夠增加保加利亞乳桿菌的使用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0033]實(shí)施例1
[0034]a)菌種活化與增殖培養(yǎng):
[0035]將保加利亞乳桿菌接種到已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)22_26h，再按體積比(v/v)為3%的比例接種于與上述相同的培養(yǎng)基中，即每IOOmL培養(yǎng)基中接種3mL菌種，并在相同條件下活化至第三代。
[0036] 向增殖抗凍培養(yǎng)基中接入4% (v/v)已活化的保加利亞乳桿菌，36°C恒溫培養(yǎng)16h0
[0037]b)收集菌體:[0038]然后在4°C、8000rpm下離心20min,棄去上清液,獲得菌泥。
[0039]c)預(yù)凍及真空冷凍干燥:
[0040]向每克菌泥中加入0.24g脫脂奶粉、0.06g抗壞血酸鈉、1.0mL磷酸緩沖液、0.1g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻，于_40°C預(yù)凍10h，然后放入凍干機(jī)于_56°C、5Pa下進(jìn)行真空冷凍干燥24h，即得保加利亞乳桿菌凍干菌粉。
[0041]其凍干存活率可為72.31 % (對(duì)照培養(yǎng)基為19.72 % )，菌粉活菌數(shù)達(dá)1.34X 10nCFU/g(對(duì)照培養(yǎng)基為 7.1 X 109CFU/g)。
[0042]其中，保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基的配置步驟包括:
[0043]首先準(zhǔn)確稱取乳糖20g、白扁豆多糖0.4g、酵母提取物4g、大豆蛋白胨8g、檸檬酸氫二銨1.5g、乙酸鈉1.2g、磷酸氫二鉀1.5g、MnSO40.05g和吐溫800.8mL溶解于950mL蒸餾水中，加熱溶解、攪拌均勻，再調(diào)PH值至6.4-6.6，按照裝量70 %盛放于厭氧瓶中，并在瓶蓋的橡膠塞上向內(nèi)插ImL注射器針頭，于121°C滅菌15min后拔下針頭，冷卻至室溫；
[0044]然后準(zhǔn)確稱取3g海藻糖、3g低聚木糖和1.0g谷氨酸鈉溶解于50mL蒸餾水中，混合均勻，再用0.22 μ m無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，將濾液與上述已滅菌的培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)中按照無(wú)菌操作要求混合均勻，即得保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基。
[0045]白扁豆多糖的制備方法包括以下步驟:將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于150份蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH值 至5.0-6.8，在45°C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量1.5%、活力為8000U/g的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量I %、活力為30000U/g的果膠酶，保溫2h后于電磁爐上加熱至沸騰，其后調(diào)節(jié)電磁率功率為1000W保溫20min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置IOh后抽濾，所得濾渣即為粗白扁豆多糖，將所得濾渣于50°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于20mL、水浴加熱至55°C的蒸餾水中計(jì)算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量I %的木瓜蛋白酶，酶解0.9h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15%體積的Sevag試劑除蛋白20min,其中Sevag試劑中氯仿:正丁醇=4:1 ;2000rpm離心15min后取上清液，反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
[0046]薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備:將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥混合物粉碎后浸泡于150份蒸餾水中，其中薏苡仁和去皮的山藥按1:1混合，調(diào)節(jié)pH值至
6.0-7.0，在80°C水浴溫度下提取2h，冷卻至40°C后，在40°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量I %的果膠酶和0.8%的α -淀粉酶，并保溫2.0h，其后于電磁爐上加熱至沸騰，保溫lOmin，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入3倍體積的95%乙醇，在冰箱中靜置IOh后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗滌粗多糖，過(guò)濾后將所得沉淀于45°C烘干，即得薏苡仁和山藥混合多糖提取物。
[0047]實(shí)施例2
[0048]a)菌種活化與增殖培養(yǎng):
[0049]將保加利亞乳桿菌接種到已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于35°C培養(yǎng)22_26h，再按4% (v/v)比例接種于與上述相同的培養(yǎng)基中，并在相同條件下活化至第三代。
[0050]向增殖抗凍培養(yǎng)基中接入3% (v/v)已活化的保加利亞乳桿菌，37°C恒溫培養(yǎng)16h0
[0051]b)收集菌體:[0052]然后在4°C、1000Orpm下離心15min,棄去上清液,獲得菌泥。
[0053]c)預(yù)凍及真空冷凍干燥:
[0054]向每克菌泥中加入0.24g脫脂奶粉、0.06g抗壞血酸鈉、0.8mL磷酸緩沖液、0.2g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻，于_40°C預(yù)凍10h，然后放入凍干機(jī)于_56°C、5Pa下進(jìn)行真空冷凍干燥20h，即得保加利亞乳桿菌凍干菌粉。
[0055]其凍干存活率可為74.82 % (對(duì)照培養(yǎng)基為10.2 % )，菌粉活菌數(shù)達(dá)1.96X 10nCFU/g(對(duì)照培養(yǎng)基為 6.4X109CFU/g)。
[0056]其中，保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基的配置步驟包括:
[0057]首先準(zhǔn)確稱取乳糖16g、白扁豆多糖0.5g、酵母提取物6g、大豆蛋白胨10g、檸檬酸氫二銨1.8g、乙酸鈉1.0g、磷酸氫二鉀1.2g、MnSO40.04g和吐溫801.0mL溶解于95OmL蒸餾水中，加熱溶解、攪拌均勻，再調(diào)PH值至6.4-6.6，按照裝量80%盛放于厭氧瓶中，并在瓶蓋的橡膠塞上向內(nèi)插ImL注射器針頭，于121°C滅菌15min后拔下針頭，冷卻至室溫；
[0058]然后準(zhǔn)確稱取5g海藻糖、2g低聚木糖和0.6g谷氨酸鈉溶解于50mL蒸餾水中，混合均勻，再用0.22 μ m無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，將濾液與上述已滅菌的培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)中按照無(wú)菌操作要求混合均勻，即得保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基。
[0059]白扁豆多糖的制備方法包括以下步驟:將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于125份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至5.0-6.8，在40°C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量I %、活力為9000U/g的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量1.5%、活力為20000U/g的果膠酶，保溫2.5h后于電磁爐上加熱至沸騰，其后調(diào)節(jié)電磁率功率為1000W保溫18min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置IOh后抽濾，所得濾渣即為粗白扁豆多糖，將所得濾渣于55°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于15mL、水浴加熱至50°C的蒸餾水中計(jì)算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量3%的木瓜蛋白酶，酶解0.6h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液18%體積的Sevag試劑(氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白25min, 3000rpm離心20min后取上清液,反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
[0060]薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備:將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥(1:1混合)粉碎后浸泡于200份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，在100°C水浴溫度下提取lh，冷卻至45°C后，在45°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量2%的果膠酶和1%的α -淀粉酶，并保溫1.5h，其后于電磁爐上加熱至沸騰，保溫15min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入3倍體積的95%乙醇，在冰箱中靜置12h后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗滌粗多糖，過(guò)濾后將所得沉淀于50°C烘干，即得薏苡仁和山藥混合多糖提取物。
[0061]實(shí)施例3
[0062]a)菌種活化與增殖培養(yǎng):
[0063]將保加利亞乳桿菌接種到已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于38°C培養(yǎng)22_26h，再按5% (v/v)比 例接種于與上述相同的培養(yǎng)基中，并在相同條件下活化至第三代。
[0064]向增殖抗凍培養(yǎng)基中接入4% (v/v)已活化的保加利亞乳桿菌，35°C恒溫培養(yǎng)16h0
[0065]b)收集菌體:[0066]然后在0°C、1000Orpm下離心15min,棄去上清液,獲得菌泥。
[0067]c)預(yù)凍及真空冷凍干燥:
[0068]向每克菌泥中加入0.2g脫脂奶粉、0.08g抗壞血酸鈉、1.2mL磷酸緩沖液、0.3g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻，于_40°C預(yù)凍14h，然后放入凍干機(jī)于_56°C、5Pa下進(jìn)行真空冷凍干燥22h，即得保加利亞乳桿菌凍干菌粉。
[0069]其凍干存活率可為75.20 % (對(duì)照培養(yǎng)基為15.4 % )，菌粉活菌數(shù)達(dá)1.80 X 10nCFU/g (對(duì)照培養(yǎng)基為 7.8 X 109CFU/g)。
[0070]其中，保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基的配置步驟包括:
[0071]首先準(zhǔn)確稱取乳糖18g、白扁豆多糖0.6g、酵母提取物5g、大豆蛋白胨10g、檸檬酸氫二銨1.2g、乙酸鈉1.0g、磷酸氫二鉀1.8g、MnSO40.03g和吐溫801.0mL溶解于950mL蒸餾水中，加熱溶解、攪拌均勻，再調(diào)PH值至6.4-6.6，按照裝量90%盛放于厭氧瓶中，并在瓶蓋的橡膠塞上向內(nèi)插ImL注射器針頭，于120°C滅菌15min后拔下針頭，冷卻至室溫；[0072]然后準(zhǔn)確稱取4g海藻糖、4g低聚木糖和0.Sg谷氨酸鈉溶解于50mL蒸餾水中，混合均勻，再用0.22 μ m無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，將濾液與上述已滅菌的培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)中按照無(wú)菌操作要求混合均勻，即得保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基。
[0073]白扁豆多糖的制備方法包括以下步驟:將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100份蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH值至5.0-6.8，在55 °C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量2 %、活力為10000U/g的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量2%、活力為20000U/g的果膠酶，保溫1.5h后于電磁爐上加熱至沸騰，其后調(diào)節(jié)電磁率功率為1000W保溫20min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置14h后抽濾，所得濾渣即為粗白扁豆多糖，將所得濾渣于50°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于20mL、水浴加熱至70°C的蒸餾水中計(jì)算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量4%的木瓜蛋白酶，酶解Ih后得酶解液，酶解液使用多糖溶液25%體積的Sevag試劑 (氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白30min, 4000rpm離心20min后取上清液,反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
[0074]薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備:將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥(1:1混合)粉碎后浸泡于200份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，在90°C水浴溫度下提取1.5h，冷卻至50°C后，在50°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量1.5%的果膠酶和1%的α-淀粉酶，并保溫2.0h，其后于電磁爐上加熱至沸騰，保溫15min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇，在冰箱中靜置14h后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗滌粗多糖，過(guò)濾后將所得沉淀于55°C烘干，即得薏苡仁和山藥混合多糖提取物。
[0075]實(shí)施例4
[0076]a)菌種活化與增殖培養(yǎng):
[0077]將保加利亞乳桿菌接種到已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于36°C培養(yǎng)22_26h，再按3% (v/v)比例接種于與上述相同的培養(yǎng)基中，并在相同條件下活化至第三代。
[0078]向增殖抗凍培養(yǎng)基中接入5% (v/v)已活化的保加利亞乳桿菌，38°C恒溫培養(yǎng)17h。
[0079]b)收集菌體:[0080]然后在l°C、9000rpm下離心16min,棄去上清液,獲得菌泥。
[0081]c)預(yù)凍及真空冷凍干燥:
[0082]向每克菌泥中加入0.22g脫脂奶粉、0.1g抗壞血酸鈉、1.4mL磷酸緩沖液、0.3g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻，于_40°C預(yù)凍8h，然后放入凍干機(jī)于-56°C、5Pa下進(jìn)行真空冷凍干燥21h，即得保加利亞乳桿菌凍干菌粉。
[0083]其凍干存活率可為75.21 % (對(duì)照培養(yǎng)基為18.63 % )，菌粉活菌數(shù)達(dá)
1.85X 10nCFU/g(對(duì)照培養(yǎng)基為 7.6X 109CFU/g)。
[0084]其中，保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基的配置步驟包括:
[0085]首先準(zhǔn)確稱取乳糖13g、白扁豆多糖0.3g、酵母提取物8g、大豆蛋白胨9g、檸檬酸氫二銨2.0g、乙酸鈉1.5g、磷酸氫二鉀1.0g、MnSO40.06g和吐溫800.6mL溶解于95OmL蒸餾水中，加熱溶解、攪拌均勻，再調(diào)PH值至6.4-6.6，按照裝量70 %盛放于厭氧瓶中，并在瓶蓋的橡膠塞上向內(nèi)插ImL注射器針頭，于119°C滅菌15min后拔下針頭，冷卻至室溫；
[0086]然后準(zhǔn)確稱取2g海藻糖、4g低聚木糖和0.7g谷氨酸鈉溶解于50mL蒸餾水中，混合均勻，再用0.22 μ m無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，將濾液與上述已滅菌的培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)中按照無(wú)菌操作要求混合均勻，即得保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基。
[0087]白扁豆多糖的制備方法包括以下步驟:將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于120份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至5.0-6.8，在48°C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量I %、活力為8000U/g的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量I %、活力為20000U/g的果膠酶，保溫1.8h后于電磁爐上加熱至沸騰，其后調(diào)節(jié)電磁率功率為1000W保溫17min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置13h后抽濾，所得濾渣即為粗白扁豆多糖，將所得濾渣于53°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于16mL、水浴加熱至60°C的蒸餾水中計(jì)算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量2%的木瓜蛋白酶，酶解0.Sh后得酶解液，酶解液使用多糖溶液20%體積的Sevag試劑(氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白23min, 3000rpm離心16min后取上清液,反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
[0088]薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備:將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥(1:1混合)粉碎后浸泡于170份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，在100°C水浴溫度下提取1.5h，冷卻至45°C后，在45°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量2%的果膠酶和
0.8%的α -淀粉酶，并保溫1.9h，其后于電磁爐上加熱至沸騰，保溫13min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入3倍體積的95%乙醇，在冰箱中靜置Ilh后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗滌粗多糖，過(guò)濾后將所得沉淀于48°C烘干，即得薏苡仁和山藥混合多糖提取物。
[0089]實(shí)施例5
[0090]a)菌種活化與增殖培養(yǎng):
[0091]將保加利亞乳桿菌接種到已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)22_26h，再按3% (v/v)比例接種于與上述相同的培養(yǎng)基中，并在相同條件下活化至第三代。
[0092]向增殖抗凍培養(yǎng)基中接入5% (v/v)已活化的保加利亞乳桿菌，38°C恒溫培養(yǎng)18h。
[0093]b)收集菌體:[0094]然后在2°C、8000rpm下離心17min,棄去上清液,獲得菌泥。
[0095]c)預(yù)凍及真空冷凍干燥:
[0096]向每克菌泥中加入0.21g脫脂奶粉、0.07g抗壞血酸鈉、1.0mL磷酸緩沖液、0.2g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻，于_40°C預(yù)凍6h，然后放入凍干機(jī)于-56°C、5Pa下進(jìn)行真空冷凍干燥18h，即得保加利亞乳桿菌凍干菌粉。
[0097]其凍干存活率可為73.46 % (對(duì)照培養(yǎng)基為15.4 % )，菌粉活菌數(shù)達(dá)
1.65 X 10nCFU/g (對(duì)照培養(yǎng)基為 6.9 X 109CFU/g)。
[0098]其中，保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基的配置步驟包括:
[0099]首先準(zhǔn)確稱取乳糖10g、白扁豆多糖0.2g、酵母提取物10g、大豆蛋白胨9g、檸檬酸氫二銨1.0g、乙酸鈉2.0g、磷酸氫二鉀2.0g、MnSO40.01g和吐溫800.5mL溶解于950mL蒸餾水中，加熱溶解、攪拌均勻，再調(diào)PH值至6.4-6.6，按照裝量80%盛放于厭氧瓶中，并在瓶蓋的橡膠塞上向內(nèi)插ImL注射器針頭，于118°C滅菌15min后拔下針頭，冷卻至室溫；
[0100]然后準(zhǔn)確稱取6g海藻糖、3g低聚木糖和0.9g谷氨酸鈉溶解于50mL蒸餾水中，混合均勻，再用0.22 μ m無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，將濾液與上述已滅菌的培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)中按照無(wú)菌操作要求混合均勻，即得保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基。
[0101]白扁豆多糖的制備方法包括以下步驟:將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于140份蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH 值至5.0-6.8，在50°C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量0.5%、活力為10000U/g的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量2%、活力為30000U/g的果膠酶，保溫2.5h后于電磁爐上加熱至沸騰，其后調(diào)節(jié)電磁率功率為1000W保溫15min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，在冰箱中靜置12h后抽濾，所得濾渣即為粗白扁豆多糖，將所得濾渣于45°C烘干，即得白扁豆粗多糖。按每0.5g干燥的白扁豆粗多糖溶于18mL、水浴加熱至65°C的蒸餾水中計(jì)算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量2.5%的木瓜蛋白酶，酶解0.5h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液23%體積的Sevag試劑(氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白28min, 2000rpm離心18min后取上清液，反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
[0102]薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備:將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥(1:1混合)粉碎后浸泡于180份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0，在90°C水浴溫度下提取lh，冷卻至55°C后，在55°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量2.5%的果膠酶和
0.9%的α-淀粉酶，并保溫1.8h，其后于電磁爐上加熱至沸騰，保溫12min，然后使用布氏漏斗抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，向濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇，在冰箱中靜置13h后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖，用80%乙醇溶液洗滌粗多糖，過(guò)濾后將所得沉淀于52°C烘干，即得薏苡仁和山藥混合多糖提取物。
【權(quán)利要求】
1.一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:包括以下步驟: a)菌種活化與增殖培養(yǎng):將保加利亞乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中活化，將已活化的菌種接種于增殖抗凍培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，得到增殖的菌液； b)收集菌體:將上述增殖的菌液離心處理，棄去上清液，得到菌泥； c)干燥:在所制備的菌泥中按每克菌泥添加0.2-0.24g脫脂奶粉、0.06-0.1g抗壞血酸鈉、0.8-1.4mL的磷酸緩沖液、0.1-0.3g薏苡仁和山藥混合多糖提取物，混合均勻后真空冷凍干燥，即得保加利亞乳桿菌凍干菌粉； 所述増殖抗凍培養(yǎng)基配方組成為:乳糖10-20g、海藻糖2-6g、白扁豆多糖0.2-0.6g、低聚木糖2-4g、酵母提取物4-10g、大豆蛋白胨8-10g、谷氨酸鈉0.6-1.0g、檸檬酸氫二銨`1.0-2.0g、乙酸鈉 1.0-2.0g、磷酸氫二鉀 1.0-2.0g、MnS040.01-0.06g、吐溫 800.5-1.0mL、蒸餾水 1000mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟a)中活化是指將保加利亞乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中于35-38 °C培養(yǎng)22_26h，再按每IOOmL培養(yǎng)基中接種 3-5mL菌種的比例，接種于與上述MRS液體培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中，并在相同條件下活化至第三代。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟a)中增殖培養(yǎng)的接種比例為每IOOmL增殖抗凍培養(yǎng)基中接種3_5mL已活化的菌種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟a)中增殖培養(yǎng)是于35-38°C下培養(yǎng)16_18h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述增殖抗凍培養(yǎng)基的配置步驟包括: 首先按量稱取乳糖、白扁豆多糖、酵母提取物、大豆蛋白胨、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、MnSO4和吐溫80溶解于蒸餾水a(chǎn)中，加熱溶解、攪拌均勻，再調(diào)pH值至6.4-6.6，按照裝量70%-90%盛放于厭氧瓶中，于118-1211:滅菌151^11，冷卻至室溫，得到已滅菌的培養(yǎng)基； 再稱取海藻糖、低聚木糖和谷氨酸鈉溶解于蒸餾水b中，所述蒸餾水a(chǎn)和蒸餾水b的總量為1000mL,混合均勻后過(guò)濾除菌，將濾液與上述已滅菌的培養(yǎng)基按照無(wú)菌操作要求混合均勻，即得保加利亞乳桿菌增殖抗凍培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述白扁豆多糖的制備步驟包括: 首先將5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100-150份蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至5.0-6.8 ； 其次在40-55°C的水浴溫度下加入白扁豆質(zhì)量0.5-2%、活力為8000-1000(^/^的纖維素酶和白扁豆質(zhì)量1-2%、活力為20000-3000(^/^的果膠酶，保溫1.5-2.5h后加熱至沸騰，再保溫15-20min ； 然后抽濾并將濾液濃縮，向濃縮液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，靜置10-14h后抽濾，將所得濾渣于45-55°C烘干，即得白扁豆粗多糖； 最后取干燥的白扁豆粗多糖溶于水浴加熱至50-70°C的蒸餾水中，按每0.5g白扁豆粗多糖溶于15_20mL蒸餾水的比例計(jì)算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖質(zhì)量1-4%的木瓜蛋白酶，酶解0.5-lh后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15-25%體積的Sevag試劑除蛋白20_30min ;2000-4000rpm離心15_20min后取上清液，反復(fù)離心處理三次，得到的上清液經(jīng)真空冷凍干燥后即得白扁豆多糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟b)中離心處理為0_4°C、8000-10000rpm離心15_20min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述薏苡仁和山藥混合多糖提取物的制備步驟包括: 首先將5份干燥的薏苡仁和去皮的山藥混合物粉碎后浸泡于150-200份蒸餾水中，其中薏苡仁和去皮的山藥按1:1混合，調(diào)節(jié)PH值至6.0-7.0，在80-100°C水浴溫度下提取1-2h，冷卻至 40-550C ； 接著在40-55°C水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山藥混合物質(zhì)量1-2.5%的果膠酶和0.8-1 %的α -淀粉酶，并保溫1.5-2.0h后加熱至沸騰，再保溫10_15min ； 然后抽濾并將濾液濃縮，向濃縮液中加入3-4倍體積的95%乙醇，靜置10-14h后抽濾，所得濾渣即為粗混合多糖； 最后用80%乙醇溶液洗滌粗混合多糖，過(guò)濾后將所得沉淀于45-55°C烘干，即得薏苡仁和山藥混合多糖提取物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種保加利亞乳桿菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟c)中真空冷凍干燥是在凍干機(jī)中進(jìn)行18-24h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的一種嗜熱鏈球菌凍干菌粉制備方法，其特征在于:所述步驟c)中真空冷凍干燥 之前在_40°C預(yù)凍6-14h。
【文檔編號(hào)】C12N1/04GK103923835SQ201410171964
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】陳合, 陳世偉, 舒國(guó)偉 申請(qǐng)人:陜西科技大學(xué)