復(fù)合菌劑及其應(yīng)用以及利用其制備有機(jī)肥的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌。相應(yīng)地，本發(fā)明還公開了一種復(fù)合菌劑制備有機(jī)肥的方法，包括以下步驟：a.將復(fù)合菌劑與植物類纖維原料混合均勻，得到發(fā)酵原料；b.將發(fā)酵原料進(jìn)行堆肥發(fā)酵；c.將堆肥后的發(fā)酵原料干燥得到有機(jī)肥。復(fù)合菌劑所包含的微生物之間不產(chǎn)生拮抗作用，能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過程中有效地合作，充分利用生產(chǎn)原料的各化學(xué)組分，最終生產(chǎn)出高品質(zhì)的有機(jī)肥。得到的有機(jī)肥符合國家標(biāo)準(zhǔn)(NY884-2012)的參數(shù)指標(biāo)，能夠改善土壤種植性狀，有利于土壤微生物菌群組成的優(yōu)化，提供全方面的植物根系營養(yǎng)。
【專利說明】復(fù)合菌劑及其應(yīng)用以及利用其制備有機(jī)肥的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及復(fù)合菌劑及其應(yīng)用以及利用其制備有機(jī)肥的方法，復(fù)合菌劑可以應(yīng)用于植物纖維類廢棄物快速資源化處理，尤其是木薯酒糟的快速資源化處理。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)業(yè)廢棄物是指在整個(gè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中被丟棄的有機(jī)類物質(zhì)，目前我國每年產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)廢棄物以幾十億噸計(jì)。其中農(nóng)林生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的植物類殘余廢棄物占據(jù)了很大的一部分比重，而且是所有農(nóng)業(yè)廢棄物中最難被利用的一種。
[0003]作為農(nóng)業(yè)廢棄物中比重較高的植物纖維類廢棄物，其來源廣泛，比如在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中殘留的作物秸桿、園林廢棄物、樹皮、果殼、蔗渣和酒糟渣等。這一大類農(nóng)業(yè)廢棄物的化學(xué)組成主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，具有產(chǎn)量大、可再生、再生周期短和環(huán)境友好等特點(diǎn)。將植物纖維類廢棄物進(jìn)行堆肥化處置回歸到農(nóng)業(yè)再利用是一種重要的農(nóng)業(yè)廢棄物資源化處理手段。其通過高溫好氧堆肥發(fā)酵、厭氧發(fā)酵和好氧厭氧結(jié)合的多種發(fā)酵方式，將植物纖維類廢棄物進(jìn)行快速腐熟、穩(wěn)定和干燥，制備成能夠改良土壤性狀、提高土壤耕地性能和提升農(nóng)產(chǎn)品作物品質(zhì)的有機(jī)肥。
[0004]植物纖維類廢棄物的有機(jī)肥化隨著技術(shù)手段的提升和產(chǎn)品利用價(jià)值的提升，越來越受到各行業(yè)的關(guān)注，其生產(chǎn)工藝也在不斷地優(yōu)化和改進(jìn)之中。而高效的堆肥菌劑又是植物纖維類廢棄物堆肥生產(chǎn)有機(jī)肥技術(shù)的關(guān)鍵與核心。高效的堆肥發(fā)酵菌劑包含能夠快速有效降解纖維類廢棄物中難 以被利用的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)，使其能夠更好地改良土壤、培肥地力。與此同時(shí)降解的纖維類物質(zhì)為菌劑中其他菌種提供能量來源，產(chǎn)生對作物有利的氣基酸和糖類等有益物質(zhì)。聞效菌劑所制備的有機(jī)肥，其活菌數(shù)聞，施用該有機(jī)肥能夠促進(jìn)土壤微生物的活動(dòng)，促進(jìn)作物根系對土壤中營養(yǎng)的吸收，最終達(dá)到增產(chǎn)增質(zhì)的效果。
[0005]目前，已有專利涉及植物纖維類廢棄物發(fā)酵有機(jī)肥菌劑獲得授權(quán)。ZL200910233577.6公開了一種農(nóng)業(yè)廢棄物快速堆肥菌劑及其生產(chǎn)有機(jī)肥的方法，通過一株能在50°C下快速分解各種富含纖維素廢棄物的菌株NJZS對纖維類廢棄物進(jìn)行堆肥發(fā)酵得到有機(jī)肥。ZL200810224244.2公開了一種用于降解秸桿的菌劑，其活性成分主要包括綠色木霉 CICC40502 (Trichodermaviride)、黃綠木霉(Trichodermaaureoviride)和飼料類芽孢桿菌(Paenibacilluspabuli)三種菌種，能夠快速腐熟稻桿制備有機(jī)肥。ZL00121101.3公開了一種有機(jī)物快速腐熟菌劑，其由7株纖維素分解菌和載體組成，適用于肥的快速腐熟生產(chǎn)。
[0006]以上公開的有機(jī)肥菌劑相關(guān)方面的專利均能夠提供快速腐熟有機(jī)肥生產(chǎn)原料的特性，達(dá)到縮短有機(jī)肥發(fā)酵周期的目的。但是在實(shí)際生產(chǎn)中，由于有機(jī)肥的生產(chǎn)原料來源不同，每批次的碳氮比、PH值和物理性狀組成等重要發(fā)酵條件都不同，僅僅依賴單一或少量的菌株組成的發(fā)酵菌劑，很難保證每批次產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定，難以實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)的有機(jī)肥大規(guī)?；a(chǎn)。有鑒于此，有必要提供一種復(fù)合菌劑，能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過程中有效地合作，將不同來源的原料統(tǒng)一發(fā)酵成高品質(zhì)的有機(jī)肥產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過程中有效地合作，將不同來源的原料統(tǒng)一發(fā)酵成高品質(zhì)的有機(jī)肥產(chǎn)品的復(fù)合菌劑及其應(yīng)用以及利用其制備有機(jī)肥的方法。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽抱桿菌(BaciIIusmegaterium)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、米曲霉(AspergillusOryzae)、綠色木霉(Trichodermaviride)、白地霉(Geotrichumcandidum)、黑曲霉(AspergiIIusniger)、少抱根霉(Rhizopusoligosporus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)。其中，枯草芽孢桿菌能夠在高溫堆肥階段繼續(xù)存活,并且產(chǎn)生大量的蛋白酶、纖維素酶、糖酶等水解酶系對原料進(jìn)行充分水解，同時(shí)枯草芽孢桿菌還能對主要的土傳病原菌通過拮抗作用進(jìn)行有效抑制。巨大芽孢桿菌能夠在生長過程中產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，可將土壤中的難容的含磷物質(zhì)分解或溶解，轉(zhuǎn)化成容易被植物吸收的磷元素，提高磷的利用率。同時(shí)巨大芽孢桿菌在增殖過程中能夠釋放出高活性的分解酵素及多種促進(jìn)因子，促進(jìn)植物養(yǎng)分的吸收，提高肥效。圓褐固氮菌作為一種自生固氮菌，具有將強(qiáng)的固氮能力，同時(shí)也可以分泌生長素，促進(jìn)植株的生長和果實(shí)的發(fā)育?？祵幠久?、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉能夠產(chǎn)生高活力的纖維素酶、糖化酶和蛋白酶，可以降解堆肥原料中的纖維素、半纖維素和蛋白質(zhì)等主要組分。
[0009]本發(fā)明的復(fù)合菌劑由多種微生物組成，包含了好氧和厭氧，細(xì)菌和真菌，纖維降解菌、固氮菌和產(chǎn)益生元菌等多種有效微生物，能夠?qū)⒉煌瑏碓吹脑辖y(tǒng)一發(fā)酵成高品質(zhì)的有機(jī)肥產(chǎn)品。本發(fā)明所提出的復(fù)合菌劑經(jīng)過多次篩選得到，所包含的微生物之間不產(chǎn)生拮抗作用，能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過程中有效地合作，充分利用生產(chǎn)原料的各化學(xué)組分，最終生廣出聞品質(zhì)的有機(jī)肥。
[0010]需要說明的是，本發(fā)明的實(shí)施例采用的菌種來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，其編號為:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉 CICC2148、綠色木霉 CICC40502、白地霉 CICC3152、黑曲霉 CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0011]在一些實(shí)施方式中，復(fù)合菌劑的制備方法包括以下步驟:
[0012]i活化培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌和圓褐固氮菌分別取I~2環(huán)菌種接種至對應(yīng)的活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液；
[0013]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按1% (V/V)的接種量分別接種到對應(yīng)的擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液；
[0014]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種到固體培養(yǎng)基中，在28~30°C下培養(yǎng)2~3天，然后在37~40°C下培養(yǎng)2~3天，得到固體種子；
[0015] iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)3~5天，然后在37~40°C下培養(yǎng)3~5天，最后在50~55°C下干燥至含水量低于20%,得到復(fù)合菌劑。
[0016]本發(fā)明的復(fù)合菌劑通過活化、擴(kuò)大培養(yǎng)、固體培養(yǎng)和固體擴(kuò)大培養(yǎng)多個(gè)步驟制備而成，制備方法簡單、易于實(shí)現(xiàn)，多級活化和擴(kuò)大培養(yǎng)使得復(fù)合菌劑的活菌含量高，最終得到的固體復(fù)合菌劑能夠維持長時(shí)間的高活菌率，非常適合大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。
[0017]在一些實(shí)施方式中，在步驟i中，各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0018]枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5 %、余量為去離子水、pH7.4~7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150-200r/min、35-37°C、15 ~18h ；
[0019]康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速100 ~150r/min、28-30°c、24 ~28h ；
[0020]植物乳桿菌進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5 %、檸檬酸氫二銨0.2 %、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.2~6.6，培養(yǎng)條件:35-37°C>24~28h、靜置培養(yǎng)；
[0021]圓褐固氮菌進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1%、磷酸二氫鉀0.2%。、氯化鈉0.2%。、硫酸鎂0.2%。、硫酸鈣0.2%。、碳酸鈣0.5%、余量為去離子水、pH7.0~
7.2，轉(zhuǎn)速 150-200r/min、35-37°C、15 ~18h。
[0022]上述各菌種分開進(jìn)行活化培養(yǎng)，每個(gè)菌種的活化培養(yǎng)都具有對應(yīng)的活化培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，能夠使各菌種快速活化。其中，吐溫為聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，簡稱聚山梨酯(Polysorbate)。
[0023]在一些實(shí)施方式中，在步驟ii中，各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0024]枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.4~7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150~200r/min、35-37°C、15 ~18h ；
[0025]康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速100 ~150r/min、28 ~30°C、24 ~28h ；
[0026]植物乳桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5 %、檸檬酸氫二銨0.2 %、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2 %、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水，pH6.2~6.6，培養(yǎng)條件為:35-37 0C >24~28h、靜置培養(yǎng)；
[0027]圓褐固氮菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1%、磷酸二氫鉀
0.2%。、氯化鈉0.2%。、硫酸鎂0.2%。、硫酸鈣0.2%。、碳酸鈣0.5%、余量為去離子水，pH7.0~
7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 150 ~200r/min、35-37°C、15 ~18h。
[0028]上述各菌種分開進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每個(gè)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)都具有對應(yīng)的擴(kuò)大培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，能夠使各菌種快速增殖，縮短擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)間。其中，吐溫為聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，簡稱聚山梨酯(Polysorbate)。
[0029]在一些實(shí)施方式中，在步驟iii中:固體培養(yǎng)基為木薯酒糟或木薯酒糟與豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸桿按5~8:1:1 (W/W)混合。
[0030]在一些實(shí)施方式中，在步驟iv中:固體擴(kuò)大培養(yǎng)基為木薯酒糟或木薯酒糟與豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸桿按5~8:1:1 (W/W)混合。
[0031]在一些實(shí)施方式中，豆柏的粗蛋白含量>43%，從而使固體培養(yǎng)基或固體擴(kuò)大培養(yǎng)基具有充分的蛋白含量。
[0032]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種利用上述復(fù)合菌劑制備有機(jī)肥的方法，包括以下步驟:[0033]a按添加比例I~5 % (W/W)，將復(fù)合菌劑與植物類纖維原料混合均勻，得到發(fā)酵原料，其中，發(fā)酵原料的水分含量為50~60%、pH6.0~8.5，復(fù)合菌劑的活性成分包含枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌和圓褐固氮菌；
[0034]b將發(fā)酵原料進(jìn)行堆肥發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵環(huán)境的溫度在30°C以下時(shí)，堆肥的時(shí)間為20~25天，當(dāng)發(fā)酵環(huán)境在溫度在30°C以上時(shí)，堆肥的時(shí)間為15~20天。在發(fā)酵過程中，每隔3~4天翻料一次；
[0035]c將堆肥后的發(fā)酵原料于50°C下干燥至水分含量低于30%，即得到有機(jī)肥。
[0036]上述制備有機(jī)肥的方法，利用復(fù)合菌劑對植物類纖維原料進(jìn)行堆肥發(fā)酵，發(fā)酵周期短，條件溫和，易于實(shí)現(xiàn)。復(fù)合菌劑中的多種活性菌能夠?qū)Σ煌瑏碓吹闹参锢w維類原料進(jìn)行高效快速分解，使得自身得到快速增殖，因此在生產(chǎn)有機(jī)肥的發(fā)酵過程中需要調(diào)控的步驟較為簡單，操作方便。得到的有機(jī)肥中的有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以烘干基計(jì))大于45%，總養(yǎng)分(氮+五氧化二磷+氧化鉀)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以烘干基計(jì))大于5%，水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于30%，PH值:5.5~8.5，符合國家標(biāo)準(zhǔn)(NY884-2012)的參數(shù)指標(biāo)。得到的有機(jī)肥能夠改善土壤種植性狀，有利于土壤微生物菌群組成的優(yōu)化，提供全方面的植物根系營養(yǎng)，促進(jìn)植物生長，提升作物產(chǎn)量。
[0037]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述復(fù)合菌劑在制備有機(jī)肥的應(yīng)用。復(fù)合菌劑所包含的微生物之間不產(chǎn)生拮抗作用，能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過程中有效地合作，充分利用生產(chǎn)原料的各化學(xué)組分，最終生產(chǎn)出高品質(zhì)的有機(jī)肥。
[0038]本發(fā)明的有益效果為:復(fù)合菌劑由多種微生物組成，包含了好氧和厭氧，細(xì)菌和真菌，纖維降解菌、固氮菌和產(chǎn)益生元菌等多種有效微生物，能夠?qū)⒉煌瑏碓吹脑辖y(tǒng)一發(fā)酵成高品質(zhì)的有機(jī)肥產(chǎn)品。本發(fā)明所提出的復(fù)合菌劑所包含的微生物之間不產(chǎn)生拮抗作用，能夠在有機(jī)肥的生產(chǎn)過程中有效地合作，充分利用生產(chǎn)原料的各化學(xué)組分，最終生產(chǎn)出高品質(zhì)的有機(jī)肥。利用復(fù)合菌劑制備有機(jī)肥可以實(shí)現(xiàn)植物纖維類廢棄物資源化處理，得到的有機(jī)肥中的有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以烘干基計(jì))大于45%，總養(yǎng)分(氮+五氧化二磷+氧化鉀)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以烘干基計(jì))大于5%，水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于30%，？!1值:5.5~8.5，完全達(dá)到有機(jī)肥國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。且生產(chǎn)周期短、工藝穩(wěn)定。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。[0040]實(shí)施例1
[0041]復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0042]復(fù)合菌劑的制備:
[0043]i活化培養(yǎng):將儲存于4°C冰箱的斜面菌種:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分別取I環(huán)菌種接種至對應(yīng)的500ml活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液。其中，活化培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0044]各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0045]枯草芽孢桿菌CICC21082和巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量為去離子水、pH7.4，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 150r/min、35°C、15h ；
[0046]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速100r/min、28°C、24h ；
[0047]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.2，培養(yǎng)條件:35°C、24h、靜置培養(yǎng)；
[0048]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水、ρΗ7.0，轉(zhuǎn)速 150r/min、35°C、15h。
[0049]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量接種到對應(yīng)的IL液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液。其中，擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0050]各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0051]枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.4，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 150r/min、35°C、15h ；
[0052]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速100r/min、28°C、24h ;
[0053]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水、pH6.2，培養(yǎng)條件為:35°C、24h、靜置培養(yǎng)；
[0054]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氫鉀0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水，ρΗ7.0，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 150r/min、35°C、15h。
[0055]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種到5Kg木薯酒糟固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在28°C下培養(yǎng)2天，然后在37°C下培養(yǎng)2天，得到固體種子。
[0056]iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到50Kg木薯酒糟固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)3天，然后在37°C下培養(yǎng)3天，最后在50°C下干燥至含水量低于20%,得到復(fù)合菌劑。
[0057]對本實(shí)施例所制備的復(fù)合菌劑進(jìn)行活菌數(shù)的檢測，檢測結(jié)果如表1所示。從表1的結(jié)果中可以得出微生物菌劑的有效菌種活菌數(shù)大都能達(dá)到IO5個(gè)/克(三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均值)以上，能夠得到一種高活性的復(fù)合菌劑。
[0058]實(shí)施例2
[0059]復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0060]復(fù)合菌劑的制備:
[0061]i活化培養(yǎng):將儲存于4°C冰箱的斜面菌種:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分別取2環(huán)菌種接種至對應(yīng)的50ml活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液。其中，活化培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0062]各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0063]枯草芽孢桿菌CICC21082和巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h ；
[0064]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150r/min、30°C、28h ；
[0065]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.6，培養(yǎng)條件:37°C、28h、靜置培養(yǎng)；
[0066]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氫鉀0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水、ρΗ7.2，轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h。
[0067]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量接種到對應(yīng)的IL液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液。其中，擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0068]各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:[0069]枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h ；
[0070]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150r/min、30°C、28h ;
[0071]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水、pH6.6，培養(yǎng)條件為:37°C、28h、靜置培養(yǎng)；
[0072]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水，pH7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h。
[0073]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種至lj5Kg木薯酒糟、豆柏和秸桿按8:1:1 (W/W)混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)3天，然后在40°C下培養(yǎng)3天，得到固體種子。
[0074]iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏和秸桿按8:1:1 (W/W)混合的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)5天，然后在40°C下培養(yǎng)5天，最后在55°C下干燥至含水量低于20%，得到復(fù)合菌劑。
[0075]對本實(shí)施例所制備的復(fù)合菌劑進(jìn)行活菌數(shù)的檢測，檢測結(jié)果如表1所示。從表1的結(jié)果中可以得出復(fù)合菌劑的各菌種的有效菌種活菌數(shù)大都能達(dá)到IO6個(gè)/克(三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均值)以上，能夠得到一種高活性的復(fù)合菌劑。
[0076]實(shí)施例3
[0077]復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0078]復(fù)合菌劑的制備:
[0079]i活化培養(yǎng):將儲存于4°C冰箱的斜面菌種:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分別取I環(huán)菌種接種至對應(yīng)的500ml活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液。其中，活化培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0080]各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0081]枯草芽孢桿菌CICC21082和巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、37°C、17h ；
[0082]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速130r/min、29°C、26h ；[0083]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.3，培養(yǎng)條件:36°C、26h、
靜置培養(yǎng)；
[0084]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水、ρΗ7.2，轉(zhuǎn)速 180r/min、37°C、17h。
[0085]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量接種到對應(yīng)的IL液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液。其中，擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0086]各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0087]枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.4，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、36°C、17h ；
[0088]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速130r/min、30°C、26h ;
[0089]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水、PH6.3，培養(yǎng)條件為:37°C、26h、靜置培養(yǎng)；
[0090]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水，pH7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、36°C、17h。
[0091]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種至lj5Kg木薯酒糟、豆柏和秸桿按5:1:1 (W/W)混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)3天，然后在40°C下培養(yǎng)3天，得到固體種子。
[0092]iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏和秸桿按5:1:1 (W/W)混合的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)5天，然后在40°C下培養(yǎng)5天，最后在50°C下干燥至含水量低于20%，得到復(fù)合菌劑。
[0093]對本實(shí)施例所制備的復(fù)合菌劑進(jìn)行活菌數(shù)的檢測，檢測結(jié)果如表1所示。從表1的結(jié)果中可以得出復(fù)合菌劑的各菌種的有效菌種活菌數(shù)大都能達(dá)到IO5個(gè)/克(三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均值)以上，能夠得到一種高活性的復(fù)合菌劑。
[0094]實(shí)施例4
[0095]復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0096]復(fù)合菌劑的制備:
[0097]i活化培養(yǎng):將儲存于4°C冰箱的斜面菌種:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分別取I環(huán)菌種接種至對應(yīng)的500ml活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液。其中，活化培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0098]各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0099]枯草芽孢桿菌CICC21082和巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、37°C、17h ；
[0100]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速130r/min、29°C、26h ；
[0101]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.3，培養(yǎng)條件:36°C、26h、靜置培養(yǎng)；
[0102]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水、ρΗ7.2，轉(zhuǎn)速 180r/min、37°C、17h。
[0103]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量接種到對應(yīng)的IL液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液。其中，擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0104]各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:
[0105]枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.4，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、36°C、17h ；
[0106]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速130r/min、30°C、26h ;
[0107]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5 %、檸檬酸氫二銨0.2 %、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水、pH6.3，培養(yǎng)條件為:37°C、26h、靜置培養(yǎng)；
[0108]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水，pH7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 180r/min、36°C、17h。
[0109]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種到 5Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量≥43%)按5:1(W/W)混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)3天，然后在40°C下培養(yǎng)3天，得到固體種子。
[0110]iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量> 43% )按5:1(W/W)混合的固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)5天，然后在40°C下培養(yǎng)5天，最后在50°C下干燥至含水量低于20%，得到復(fù)合菌劑。
[0111]對本實(shí)施例所制備的復(fù)合菌劑進(jìn)行活菌數(shù)的檢測，檢測結(jié)果如表1所示。從表1的結(jié)果中可以得出復(fù)合菌劑的各菌種的有效菌種活菌數(shù)大都能達(dá)到IO5個(gè)/克(三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均值)以上，能夠得到一種高活性的復(fù)合菌劑。
[0112]實(shí)施例5
[0113]復(fù)合菌劑，其活性成分包含枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603。
[0114]復(fù)合菌劑的制備:[0115]i活化培養(yǎng):將儲存于4°C冰箱的斜面菌種:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580、康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152、植物乳桿菌CICC20768和褐球固氮菌CICC20603分別取2環(huán)菌種接種至對應(yīng)的50ml活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液。其中，活化培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0116]各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:枯草芽孢桿菌CICC21082和巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3 %、蛋白胨1 %、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速200r/min、37°C>18h ；
[0117]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150r/min、30°C、28h ；
[0118]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.6，培養(yǎng)條件:37°C、28h、靜置培養(yǎng)；
[0119]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氫鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水、ρΗ7.2，轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h。
[0120]ii擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量接種到對應(yīng)的IL液體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液。其中，擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)方式為搖瓶培養(yǎng)。
[0121]各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下:枯草芽孢桿菌CICC21082、巨大芽孢桿菌CICC21580分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏
0.3%、蛋白胨l%、NaC10.5%、余量為去離子水、pH7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速200r/min、37°C、18h ；
[0122]康寧木霉CICC40108、米曲霉CICC2148、綠色木霉CICC40502、白地霉CICC3152、黑曲霉CICC40614、少孢根霉CICC3152進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150r/min、30°C、28h ;[0123]植物乳桿菌CICC20768進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨I %、牛肉膏I %、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水、pH6.6，培養(yǎng)條件為:37°C、28h、靜置培養(yǎng)；
[0124]褐球固氮菌CICC20603進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖I %、磷酸二氣鐘0.2%。、氣化納0.2%。、硫酸續(xù)0.2%。、硫酸令丐0.2%。、碳酸!|丐0.5%、余里!為去尚子水，pH7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速 200r/min、37°C、18h。
[0125]iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種到5Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量大于或等于43% )按8:1 (W/W)混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)3天，然后在40°C下培養(yǎng)3天，得到固體種子。
[0126]iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到50Kg木薯酒糟、豆柏(粗蛋白含量大于或等于43% )按8:1(W/W)混合的固體培擴(kuò)大養(yǎng)基中，充分混勻，在30°C下培養(yǎng)5天，然后在40°C下培養(yǎng)5天，最后在55°C下干燥至含水量低于20%，得到復(fù)合菌劑。
[0127]對本實(shí)施例所制備的復(fù)合菌劑進(jìn)行活菌數(shù)的檢測，檢測結(jié)果如表1所示。從表1的結(jié)果中可以得出復(fù)合菌劑的各菌種的有效菌種活菌數(shù)大都能達(dá)到IO5個(gè)/克(三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)均值)以上，能夠得到一種高活性的復(fù)合菌劑。
[0128]表1不同實(shí)例中各菌劑中有效菌種活菌數(shù)測定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.復(fù)合菌劑，其特征在于，其活性成分包含枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌和圓褐固氮菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，所述復(fù)合菌劑的制備方法包括以下步驟: i活化培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌和圓褐固氮菌分別取I~2環(huán)菌種接種至對應(yīng)的活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到各菌種的活化菌種液； ?擴(kuò)大培養(yǎng):將各菌種的活化菌種液按I % (V/V)的接種量分別接種到對應(yīng)的擴(kuò)大培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到各菌種的種子液； iii固體培養(yǎng):將各菌種的種子液等體積混合，按10% (V/ff,ml/g)的接種比例接種到固體培養(yǎng)基中，在28~30°C下培養(yǎng)2~3天，然后在37~40°C下培養(yǎng)2~3天，得到固體種子; iv固體擴(kuò)大培養(yǎng):將固體種子按5% (W/W)接種比例添加到固體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)3~5天，然后在37~40°C下培養(yǎng)3~5天，最后在50~55°C下干燥至含水量低于20%，得到復(fù)合菌劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，在步驟i中，各菌種的活化培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下: 枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第一活化培養(yǎng)基配方為:牛肉膏.0.3%、蛋白胨l%、NaC1 0.5%、余量為去離子水、pH7.4~7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150_200r/min、35-37°C、15 ~18h ； 康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉分別進(jìn)行活化培養(yǎng)的第二活化培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速.100 ~150r/min、28-30°c、24 ~28h ； 植物乳桿菌進(jìn)行活化培養(yǎng)的第三活化培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏.0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、吐溫0.1%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。、余量為去離子水、pH6.2~6.6，培養(yǎng)條件:35_37°C、24~28h、靜置培養(yǎng)； 圓褐固氮菌進(jìn)行活化培養(yǎng)的第四活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1%、磷酸二氫鉀0.2%。、氯化鈉0.2%。、硫酸鎂0.2%。、硫酸鈣0.2%。、碳酸鈣0.5%、余量為去離子水、pH7.0~7.2，轉(zhuǎn)速 150-200r/min、35-37°C、15 ~18h。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，在步驟ii中，各菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)基重量百分比計(jì)的配方及培養(yǎng)條件如下: 枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第一擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為牛肉膏.0.3%、蛋白胨I %、NaCl0.5%、余量為去離子水、pH7.4~7.6，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150~.200r/min、35-37°C、15 ~18h ； 康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第二擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、余量為去離子水、pH自然，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速100~.150r/min、28 ~30 °C >24 ~28h ； 植物乳桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第三擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏.0.5%,檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2 %、吐溫0.1 %、乙酸鈉0.5 %、磷酸氫二鉀0.2 %、硫酸鎂0.58%。、硫酸錳0.25%。，余量為去離子水，pH6.2~6.6，培養(yǎng)條件為:35_37°C、24~28h、靜置培養(yǎng)； 圓褐固氮菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的第四擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1%、磷酸二氫鉀0.2%。、氯化鈉0.2%。、硫酸鎂0.2%。、硫酸鈣0.2%。、碳酸鈣0.5%、余量為去離子水、pH7.0~7.2，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速150~200r/min、35-37°C、15~18h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，在步驟iii中:固體培養(yǎng)基為木薯酒糟或木薯酒糟與豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸桿按5~8:1:1 (W/W)混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，在步驟iv中:固體擴(kuò)大培養(yǎng)基為木薯酒糟或木薯酒糟與豆柏按5~8:1 (W/W)混合或木薯酒糟、豆柏和秸桿按5~8:1:1 (W/W)混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，所述豆柏的粗蛋白含量>43%。
8.權(quán)利要求1所述的復(fù)合菌劑制備有機(jī)肥的方法，其特征在于，包括以下步驟: a按添加比例1~5% (W/W)，將復(fù)合菌劑與植物類纖維原料混合均勻，得到發(fā)酵原料，其中，發(fā)酵原料的水分含量為50~60%、pH6.0~8.5，復(fù)合菌劑的活性成分包含枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、康寧木霉、米曲霉、綠色木霉、白地霉、黑曲霉、少孢根霉、植物乳桿菌和圓褐固氮菌； b將發(fā)酵原料進(jìn)行堆肥發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵環(huán)境的溫度在30°C以下時(shí)，堆肥的時(shí)間為20~25天，當(dāng)發(fā)酵環(huán)境在溫度在30°C以上時(shí)，堆肥的時(shí)間為15~20天。在發(fā)酵過程中，每隔3~4天翻料一次； c將堆肥后的發(fā)酵原料于50°C下干燥至 水分含量低于30%，即得到有機(jī)肥。
9.權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述的復(fù)合菌劑在制備有機(jī)肥的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/065GK103898032SQ201410173158
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】唐波, 李舒宇, 仝志勇, 陳玉和 申請人:江蘇聯(lián)海生物科技有限公司