纖維酶體基因的改建方法及獲得的新型纖維素酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種纖維酶體基因的改建方法及通過基因改建獲得的新酶，具體涉及一種以熱纖梭菌的纖維酶體和它的單體酶為基礎(chǔ)的基因改建方法，及基因改建產(chǎn)生的新型木質(zhì)纖維水解酶，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明是通過基因重組技術(shù)，切除纖維酶體的單體酶肽鏈中的錨定域以減少冗余部件、用1個(gè)短鏈將支架蛋白上的CBD嫁接到單體酶的分子上，獲得具有不同分子結(jié)構(gòu)、能夠獨(dú)立結(jié)合底物、比單體酶活性高的新型獨(dú)立酶；本發(fā)明還建立了這種新酶的超量表達(dá)技術(shù)。本發(fā)明成功獲得了不依賴于纖維酶體結(jié)構(gòu)的新型纖維素酶NcelD；并且該新型酶NcelD水解CMC的活性、酶的穩(wěn)定性比自然單體酶CelD有明顯的提高；基因改建獲得的NcelD編碼基因在pHsh系統(tǒng)中得到可溶性超量表達(dá)。
【專利說明】纖維酶體基因的改建方法及獲得的新型纖維素酶
[0001]所屬【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及一種纖維酶體基因的改建方法及通過基因改建獲得的新酶，具體涉及一種以熱纖梭菌的纖維酶體和它的單體酶為基礎(chǔ)的基因改建方法，及基因改建產(chǎn)生的新型木質(zhì)纖維水解酶，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。
[0002]【背景技術(shù)】:
木質(zhì)纖維是地球植物的支撐組織，主要成分是通過光合作用碳水化合物，是非常豐富的自然資源。同時(shí)，自然界很多微生物和植食性動(dòng)物能夠產(chǎn)生一系列酶對(duì)木質(zhì)纖維進(jìn)行水解，從而構(gòu)成自然界碳素循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。水解木質(zhì)纖維中纖維素成分的主要酶類包括纖維素酶、纖維素外切酶、纖維二糖酶和b-葡萄糖苷酶等。纖維素酶是b-1，4葡聚糖內(nèi)切酶的簡稱；纖維素酶的催化反應(yīng)是纖維素水解中的限速步驟。[0003]纖維素酶在纖維素利用與加工中具有廣泛的用途。在造紙工業(yè)，纖維素酶在廢紙的脫墨處理中是重要的生物催化劑，同時(shí)在機(jī)械制漿前以纖維素酶預(yù)處理可以增加紙漿的強(qiáng)度性能，顯著降低機(jī)械磨漿時(shí)的能量消耗；在紡織工業(yè)，利用纖維素酶對(duì)棉織物及其混紡織物進(jìn)行打磨刨光處理，可使織物的硬度適當(dāng)下降，織物的懸垂度、回彈性及柔軟度獲得改善；作為飼料添加劑，纖維素酶能夠提高青貯飼料的品質(zhì)，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改善瘤胃的發(fā)酵功能，從而增加動(dòng)物體的日增質(zhì)量，改善產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)，提高經(jīng)濟(jì)效益。另外纖維素酶在食品加工和中草藥加工等領(lǐng)域也有廣泛的用途。但是，植物產(chǎn)生的纖維素結(jié)構(gòu)致密，對(duì)纖維素酶的攻擊具有很強(qiáng)的抵抗能力；迄今發(fā)現(xiàn)的所有天然纖維素酶都只能以有限的速度，緩慢地水解自然的結(jié)晶態(tài)纖維素。
[0004]熱纖梭菌是I種嗜熱厭氧細(xì)菌；它能夠在細(xì)胞表面產(chǎn)生一種水解纖維素和半纖維素酶的多酶聚合體，即纖維酶體(cellulosome)。由于來源于嗜熱細(xì)菌并且有多種酶的協(xié)同作用，纖維酶體的穩(wěn)定性較好、降解纖維素的表觀活性很高。因此幾十年來，纖維酶體吸引了大批學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研究。纖維酶體的結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到充分解析:纖維酶體的中心有I個(gè)支架蛋白，它的肽鏈中有個(gè)纖維素結(jié)合域(CBD)和多個(gè)粘連域(cohesin);纖維酶體的支架上吸附了多種酶的單體，其中包括纖維素酶、木聚糖酶等；各單體酶的肽鏈中都具有一段保守的序列，稱為錨定域(dockerin)，單體酶被分別合成并分泌到細(xì)胞表面后以錨定域與支架上的粘連域相結(jié)合，從而形成多種酶的聚合體。纖維酶體通過CBD附著到纖維素微絲上對(duì)其進(jìn)行消解。纖維酶體中的多種單體酶附著于同I個(gè)支架并共用同I個(gè)纖維素結(jié)合域(CBD)，這種結(jié)構(gòu)不利于通過基因超量表達(dá)生產(chǎn)。
[0005]在分子生物技術(shù)高度發(fā)展的今天，我們發(fā)現(xiàn)纖維酶體的生產(chǎn)有其致命的弱點(diǎn):
(1)纖維酶體產(chǎn)生菌是嗜熱厭氧細(xì)菌，培養(yǎng)條件苛刻，細(xì)胞密度低，發(fā)酵產(chǎn)酶的效率非常低；
(2)纖維酶體由多個(gè)基因編碼，總分子質(zhì)量超過2000kDa，難以進(jìn)行體外重組表達(dá)；(3)纖維酶體含有近20種不同的單體酶，其中許多單體并不是纖維素水解所必需的，還有些單體酶的活性不及其他來源的同類酶，因而，生產(chǎn)這些單體酶是生物能量的浪費(fèi)；(4)纖維酶體中各種單體酶的活性有賴于支架上的CBD，離開支架后單體酶的催化活性下降。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的:
纖維酶體中的各個(gè)單體都由獨(dú)立的基因編碼，這些基因都可以通過基因異源高效表達(dá)重組進(jìn)行生產(chǎn)。但是沒有支架蛋白的纖維素結(jié)合域(CBD)的作用，重組酶的活性不能充分發(fā)揮，而此時(shí)亞基上錨定域也成為多余。要解決的技術(shù)問題是建立一種對(duì)纖維酶體中的單體酶進(jìn)行分子改建的方法，將纖維酶體中依賴于支架蛋白的單體酶構(gòu)建成獨(dú)立酶，獲得生物活性明顯提高的新型木質(zhì)纖維水解酶，并使新酶得到異源可溶性高效表達(dá)，形成高產(chǎn)技術(shù)。
[0007]技術(shù)方案:
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是通過基因重組技術(shù)，切除纖維酶體的單體酶肽鏈中的錨定域以減少冗余部件、用I個(gè)短鏈將支架蛋白上的CBD嫁接到單體酶的分子上，獲得具有不同分子結(jié)構(gòu)、能夠獨(dú)立結(jié)合底物、比單體酶活性高的新型獨(dú)立酶。本技術(shù)方案在本發(fā)明中應(yīng)用于、但是不限于纖維酶體中CelD的分子改建。
[0008]纖維酶體中的單體酶CelD (纖維素酶D)是最知名的活性最高的纖維素酶，由基因celD編碼。運(yùn)用本發(fā)明的技術(shù)方案對(duì)celD基因進(jìn)行改建后產(chǎn)生新型纖維素酶NcelD。NcelD肽鏈的分子結(jié)構(gòu)特征:不帶有與纖維酶體支架蛋白上的粘連域相吸附的錨定域、帶有I段鏈接短肽、有嫁接的CBD ;功能特征:是能夠結(jié)合纖維素的獨(dú)立酶，不需要也不結(jié)合支架蛋白，水解纖維素的活性比自然單體酶CelD提高了 66% ;生產(chǎn)技術(shù):運(yùn)用自主發(fā)明的基因高效表達(dá)載體(美國發(fā)明專利US 7，807，460 B2)，NcelD的編碼基因在大腸桿菌(萬.col O中實(shí)現(xiàn)可溶性高效表達(dá)。
[0009]本發(fā)明所需的實(shí)驗(yàn)材料及來源:
熱纖梭菌(ATCC 27405)購自美國菌種管理保藏中心，并根據(jù)ATCC指南進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)菌DNA的提取、基因的PCR擴(kuò)增和克隆等根據(jù)《分子克隆手冊》第三版上的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Sambrook and Russell, 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。本實(shí)驗(yàn)中所用克隆宿主菌為疋coli DH10B，表達(dá)宿主菌為疋coli BL21。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取纖維酶體上支架蛋白基因序列(GenBank accession N0.L08665.1)和單體酶基因序列(GenBank accession N0.X04584.1 ；L06942.1 )，并在線分析這些基因的信號(hào)妝、錨定域、CBD等序列結(jié)構(gòu)。所采用的表達(dá)載體pHsh參見美國發(fā)明專利US 7，807，460 B2相關(guān)文獻(xiàn)，其基因序列參見基因庫資料(GenBank accession N0.FJ571619);其中目標(biāo)基因的表達(dá)受sigma 32類型啟動(dòng)子調(diào)控。
[0010]具體操作步驟如下:
(O目標(biāo)基因克隆:根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中熱纖梭菌纖維素酶(CelD)基因序列(GenBankaccession N0.X04584.1,SEQ ID N0.1)設(shè)計(jì)并合成引物，在上、下游引物中分別引入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)I和通ol ;以熱纖梭菌基因組DNA為模板，通過PCR的方法擴(kuò)增得到目標(biāo)基因單體酶^7久經(jīng)I和通ο I雙酶切并純化后，連接到經(jīng)過同樣酶切的表達(dá)載體pHsh中；將連接產(chǎn)物通過電擊轉(zhuǎn)化到疋coli細(xì)胞中，涂布于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)出帶有目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化子；從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒DNA，通過基因序列測定確認(rèn)目標(biāo)基因celD克隆成功，CdS的克隆用同樣的方法，CelDXelS等酶的表達(dá)質(zhì)粒被命名為 pHsh-celD, pHsh-celS 等等。
[0011](2)單體酶中錨定域的刪除:根據(jù)步驟(1)所得表達(dá)質(zhì)粒pHsh-celD或pHsh-celS的具體測序序列，設(shè)計(jì)引物以刪除單體酶基因或編碼尾部錨定域的核苷酸序列。用產(chǎn)生平末端的高保真性DNA聚合酶如W (TaKaRa，大連)進(jìn)行反向PCR，擴(kuò)增出包含去除錨定域以外的剩余部分(SEQ ID N0.2)的質(zhì)粒片段，為線狀DNA，用T4 DNA連接酶對(duì)線狀DNA進(jìn)行首尾連接，轉(zhuǎn)化疋coli后得到刪去錨定域的單體酶表達(dá)質(zhì)粒。
[0012](3)CBD的嫁接:設(shè)計(jì)I對(duì)引物，以熱纖梭菌基因組DNA為模板，用產(chǎn)生平末端的高保真性DNA聚合酶如W擴(kuò)增支架蛋白A中編碼CBD的DNA片段SEQ ID N0.3)，并且在基因片段Mi/上游融合人工設(shè)計(jì)的鏈接片段(編碼10-60個(gè)氨基酸，在酶的主體與纖維素結(jié)合域之間起鏈接作用)后，即得到片段(SEQ ID N0.5)，將其插入到步驟(2)所得的刪除了錨定域的表達(dá)質(zhì)粒pHsh-celD中，形成新酶基因celDHbd,我們重新命名為ncelD (SEQ ID N0.6)，轉(zhuǎn)化萬.co7i后通過篩選和序列測定鑒定出序列正確的表達(dá)質(zhì)粒，命名為pHsh-NcelD。采用同樣的方法，我們得到新構(gòu)建的質(zhì)粒pHsh-NcelS。
[0013]單體酶基因celD或celS獲得CBD基因后不再附屬于原來的纖維酶體，而是獨(dú)立的新型酶。
[0014]新型酶基因的高效表達(dá):
新型酶的表達(dá)質(zhì)粒pHsh-NcelD和pHsh-NcelS轉(zhuǎn)化疋coli后在30°C進(jìn)行通氣培養(yǎng)3-6小時(shí)后，將培養(yǎng)溫度提升到40°C _42°C對(duì)基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)3-6小時(shí)后離心收集細(xì)胞，以超聲波或均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞后獲得新酶的粗酶液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0015]有益效果:
(1)本發(fā)明的基因改建方法可取得以下有益效果:
纖梭菌產(chǎn)生的纖維酶體上附著有多個(gè)單體酶，具有較高的活性和穩(wěn)定性。單體酶都由獨(dú)立的基因編碼，可以通過基因工程高效表達(dá)，但是這些單體酶需要附著于纖維酶體的支架蛋白、借助支架蛋白上的纖維素結(jié)合域(CBD)才能充分發(fā)揮它們的活性。本發(fā)明的方法是切除單體酶上的冗余序列，并且將CBD嫁接到單體酶上，獲得不依賴于纖維酶體的新型獨(dú)立酶，其有益效果是:既具有高活性，又方便基因工程生產(chǎn)。
[0016](2)通過本發(fā)明的方法對(duì)纖維素酶D進(jìn)行基因改建取得以下有益效果:
纖維素酶D (CelD)是纖維酶體中活性最高的單體酶。運(yùn)用本發(fā)明的方法對(duì)纖維素酶D進(jìn)行基因改建后產(chǎn)生新型酶NcelD，其水解可溶性纖維素的活性提高了 75%。
[0017](3)用pHsh系統(tǒng)表達(dá)新酶取得的有益效果:
基因高效表達(dá)系統(tǒng)PHsh的表達(dá)載體是本實(shí)驗(yàn)室獨(dú)家產(chǎn)品，獲得美國發(fā)明專利(US7，807，460 B2)。新酶NcelD在pHsh載體中得到可溶性超量表達(dá)，為酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
[0018]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1新基因的設(shè)計(jì)和表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0019]圖2技術(shù)方案示意圖。
[0020]圖3基因表達(dá)產(chǎn)生的重組纖維素酶的SDS-PAGE分析圖譜。泳道標(biāo)記:M，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，含PHsh載體的菌體細(xì)胞中可溶性蛋白圖譜；2，含質(zhì)粒pHsh-CelD菌體細(xì)胞中可溶性蛋白圖譜；3，含質(zhì)粒pHsh-NcelD菌體細(xì)胞中可溶性蛋白圖譜。箭頭所指的條帶是
重組纖維素酶。
[0021]圖4新酶NcelD與原始單體酶CelD的催化活性的比較。[0022]圖5新酶NcelD與原始單體酶CelD的溫度穩(wěn)定性的比較。
[0023]【具體實(shí)施方式】
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法和產(chǎn)品作進(jìn)一步說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0024]實(shí)施例1:從熱纖梭菌基因組DNA擴(kuò)增目標(biāo)基因
引物設(shè)計(jì):根據(jù)NCBI中報(bào)道的熱纖梭菌(ATCC 27405)纖維素酶(CelD)基因序列見SEQID N0.1，去掉該基因的信號(hào)肽序列，設(shè)計(jì)并合成兩條引物序列(5’端分別含有I和ZA0I酶切位點(diǎn)):
celD-Ι:5，AAAACTGCAGGCAAAAATAACGGAGAATTATC 3’
celD-2:5’ CCGCTCGAGTTATATTGGTAATTTCTCGATTAC 3’
基因組PCR擴(kuò)增條件:培養(yǎng)熱纖梭菌細(xì)胞，提取基因組DNA作模板。在50 μ L PCR反應(yīng)體系中加入 2 μ L (20 ng)模板、2 μ L 10 μ M 引物、4 μ L 2.5 μ I^AdNTPUO yL 的5XPrime STAR HS DNA 聚合酶緩沖液、3L 5 μ L 的超純水和(λ 5 μ L 的 Prime STAR HSDNA聚合酶。按溫度周期(98°C變性10s，60°C退火15s，72°C延伸2.5min)擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，在72°C延伸10分鐘。瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在1.8 kb附近出現(xiàn)預(yù)期特異性擴(kuò)增帶，說明PCR條件合適，產(chǎn)物單一。
[0025]實(shí)施例2:熱纖梭菌纖維酶體中單體酶基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
將上述PCR產(chǎn)物割膠回收，進(jìn)行I和通ο I雙酶切，克隆到原核表達(dá)載體pHsh質(zhì)粒上。轉(zhuǎn)化到疋co7i DHlOB中，并在含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，以I進(jìn)行酶切，驗(yàn)證插入基因并進(jìn)行序列測定。結(jié)果表明插入基因長度為1827bp，編碼含有609個(gè)氨基酸殘基，序列與數(shù)據(jù)庫中的序列一致。表達(dá)質(zhì)粒命名為pHsh-CelD。
[0026]實(shí)施例3:基因的分子改建
引物設(shè)計(jì):根據(jù)NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中CelD蛋白肽鏈中的錨定域信息，設(shè)計(jì)并合成兩條反向PCR引物以pHsh-CelD為模板，PCR擴(kuò)增以得到包含有去除錨定域編碼序列ce7i?-d(SEQID N0.2)的質(zhì)粒片段，自連環(huán)化后形成新的質(zhì)粒pHsh-celD-d ;根據(jù)NCBI資料中熱纖梭菌支架蛋白CipA所含CBD的編碼基因SEQ ID N0.3)，同時(shí)，設(shè)計(jì)引物將與di/連在一起得到基因序列ce7i?-d+cM(SEQ ID N0.4)，最后設(shè)計(jì)并合成I對(duì)PCR引物擴(kuò)增帶有I個(gè)鏈接片段的LcM(SEQ ID N0.5)，將celD-?與LcM連接后形成新酶基因celD-d+Lcbd,我們重新命名為招(SEQ ID N0.6)。
[0027]dockerin-up: TAACTCGAGCACCACCACC
dockerin-dn: TTGAGGAGAATTATAGTTGACA
cbd-1: AACGTTGGCAATGCAACACC
cbd-2: GCTTATTTCAAGGTAGGTGTC
以構(gòu)建好的質(zhì)粒pHsh-CelD為模板，以dockerin_up和dockerin-dn為引物,進(jìn)行反向PCR ^fPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并割膠回收得到去除了 celD錨定域編碼序列的線性DNA片段產(chǎn)物(4036bp)。同時(shí)以熱纖梭菌基因組為模板，以cbd-Ι和cbd_2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因和鏈接序列。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并割膠回收得到帶有鏈接序列的片段(429bp)。將膠回收產(chǎn)物線性DNA片段和片段進(jìn)行磷酸化連接反應(yīng)，并電擊轉(zhuǎn)化到疋co7i DHlOB感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，進(jìn)行序列測定，長度為2043 bp的基因序列與預(yù)期一致。將改建成功的目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)物命名為新型纖維素酶D (NceID)，其表達(dá)質(zhì)粒命名為pHsh-NcelD。
[0028]實(shí)施例4:纖維素酶CelD和新酶NcelD的表達(dá)
將重組質(zhì)粒pHsh- CelD和pHsh-NcelD分別轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，獲得基因重組菌。重組菌接種在含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，置于30°C下震蕩培養(yǎng)3-6小時(shí)后，將溫度提升到40°C _42°C對(duì)基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在提高的溫度下繼續(xù)培養(yǎng)3-6小時(shí)后，離心收集細(xì)胞，以超聲波使細(xì)胞裂解后離心，上清液為CelD和NcelD的粗酶液，進(jìn)行SDS-PAGE分析，表明得到了超量表達(dá)(圖3)。具體誘導(dǎo)表達(dá)條件:接種單菌落于含有100μ g/mL的LB培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至OD6tltl為0.6-0.8之間，將其迅速轉(zhuǎn)到42°C培養(yǎng)6小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為200 rpm。
[0029]實(shí)施例5:重組CelD和NcelD的純化
培養(yǎng)液5000 rpm，4°C離心10 min收集細(xì)胞。用滅菌的去離子水洗滌細(xì)胞三次，徹底除去殘留的培養(yǎng)基，按照1:2 (濕重:體積)的比例重懸于適量的鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑(50mM,pH 6.0)緩沖液中，用高壓破碎法破碎細(xì)胞后，以16000 rpm, 4°C離心15 min去除細(xì)胞碎片，上清液即為胞內(nèi)粗酶液。將離心得到的粗酶液在60°C水浴鍋中進(jìn)行熱處理30 min,以去除大腸桿菌中的雜蛋白。熱處理后，4°C下以12000 rpm離心10 min去除熱變性的雜蛋白，上清液為通過熱處理得到部分純化的酶液。
[0030]必要時(shí)用以下方法對(duì)酶進(jìn)行進(jìn)一步純化:將熱處理后的粗酶液進(jìn)行DEAE-Sephrose離子交換層析。將80 mL離子交換樹脂裝柱后，先用10倍體積的去離子水沖洗用于保存填料的乙醇 ，再用緩沖液A平衡6~8個(gè)柱體積；將部分純化的酶液泵入離子交換柱，流速為2 mL/min，用緩沖液洗滌2個(gè)柱體積將未結(jié)合的蛋白徹底洗盡；用400 mL含有O~0.5 mo I/L NaCl的梯度鹽洗脫，收集含目標(biāo)蛋白的洗脫液，以75%硫酸銨沉淀酶蛋白(4°C過夜)，4°C離心20 min后棄上清，加入緩沖液輕輕溶解蛋白并進(jìn)行透析。所使用的透析緩沖液為Tris-HCl (25mM,pH7.0)，在冰上進(jìn)行透析，每2小時(shí)更換一次透析緩沖液(更換3次)獲得純酶。
[0031]實(shí)施例6:纖維素酶活性測定方法
纖維素酶活性一般有兩種表述:CMC水解活性、結(jié)晶纖維素水解活性。酶活性的測定都是用還原糖分析法，即用酶水解CMC或結(jié)晶纖維素底物后，測定反應(yīng)液中增加的還原糖的量。
[0032]反應(yīng)液的組分:45 μL 50 mM pH 5.0的緩沖液、50 μL 0.5% CMC或結(jié)晶纖維素(W/V)、5 PL適當(dāng)稀釋的酶液。
[0033]反應(yīng)溫度和時(shí)間:55°C預(yù)熱10 min后加入5 μL酶液，如果以CMC為底物在55°C反應(yīng)5 min ;如果以結(jié)晶纖維素為底物，在55°C反應(yīng)30 min。
[0034]反應(yīng)終止與顯色:加入300 μL終止劑/顯色劑PAHBAH (配方為:4體積的0.5 MNaOH和I體積的溶于0.5 M HCl的5% PAHBAH混合)終止反應(yīng)；將混合物置于沸水浴中孵育10 min，置冰上冷卻后，用分光光度計(jì)測定在波長410 nm處的吸收值。酶的活性單位定義為每分鐘催化產(chǎn)生I Mmol還原糖的酶量。
[0035]實(shí)施例7:蛋白質(zhì)濃度和還原糖濃度定量方法首先配置fcadford貯存液，其組成為:95 %乙醇10 mL與88 %磷酸20 mL混合，加入35 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶解后室溫下避光保存。
[0036]fcadford 工作液配方為:425 mL H2O ；15 mL 95 % 乙醇；30 mL 85 % 磷酸；30 mLBradford忙存液。
[0037]配好后,用Whatman I號(hào)濾紙過濾,避光保存于室溫,可使用數(shù)周，但在使用前要再用濾紙過濾。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線:配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(I !^/!^牛血清白蛋白)，選擇2.5 g~20 g的不同蛋白量，加入適量的水，使總體積為100 L，然后加入I mL的Bradford工作液，上下振蕩混勻，放置2 min后在595 nm處測定吸收值，測量應(yīng)在10 min內(nèi)完成。線性回歸后得到吸光度-牛血清白蛋白量標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y = 0.0174x + 0.0051, R2 = 0.995，x表示BSA (g)，y表示吸光度A595。
[0038]樣品檢測同上 法，用適當(dāng)稀釋樣品代替牛血清白蛋白，測量待測樣品的A595,從BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定待測樣品的濃度。
[0039]葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:配制0.5 mM葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不同濃度梯度的葡萄糖與NaOH/對(duì)羥基苯甲酸酰肼試劑反應(yīng)，測定反應(yīng)液的吸光度A41tl值。線性回歸擬合后得到吸光度-葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y = 189.23x + 0.03,R2 = 0.999，x表示葡萄糖濃度(Mmol)，I表不吸光度A41tl。
[0040]酶學(xué)性質(zhì)的測定:
(I)最適反應(yīng)溫度的測定:取適量稀釋的純化酶液在40~80°C范圍內(nèi)，每隔5°C，分別測定酶活，反應(yīng)體系為:適量稀釋的酶液5 μ1，50 mM鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑緩沖液(pH5.5)45 μΙ,Ο.5% (W/V)的CMC 50 μL，反應(yīng)時(shí)間為5 min。以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。
[0041](2)溫度穩(wěn)定性的測定:取適量稀釋的純化酶液分別在45°C、50°C、55°C、60°C、65°C >70°C pH 5.5下保溫60 min，在不同的時(shí)間取樣測定酶活，以未保溫(4°C保存)的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活,確定酶的溫度穩(wěn)定性。
[0042](3)最適反應(yīng)pH的測定:不同的pH (2.6^9.6) (pH在60°C校正)緩沖液，其中pH 2.6，3.8，4.0，4.2，4.6 的是 50 mM 乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH 4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,
7.0，7.5，8.0的是50 mM鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑緩沖液，pH 8.0，8.6，9.2，9.6的是50 mMTris-甘氨酸緩沖液。于55°C分別測定酶活，反應(yīng)體系為:5 μL適量稀釋的純化酶液，45μ1不同pH值的緩沖液，50 μL 0.5% (ff/V) CMC，反應(yīng)5 min。以酶活力最高為100%，計(jì)算相對(duì)活性。
[0043](4) pH穩(wěn)定性的測定:取5 μL適量稀釋的純化酶液分別加入不同pH值的緩沖液中，在60°C下保溫30 min，再加入50 μL 0.5% (ff/V) CMC，反應(yīng)時(shí)間5min再分別測定殘留酶活性，以未保溫(4°C保存)的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，比較不同pH條件下酶的穩(wěn)定性。緩沖液的選擇同最適反應(yīng)PH的測定。反應(yīng)所用緩沖液為pH 2.6~9.6的緩沖液。
[0044]試驗(yàn)結(jié)果表明，新型酶NcelD的活性和穩(wěn)定性比自然酶CelD有明顯提高(圖4、5)。
【權(quán)利要求】
1.一種纖維酶體基因的改建方法，其特征在于，所述方法包括克隆目標(biāo)基因、刪除單體酶上的冗余序列、嫁接纖維素結(jié)合域步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種纖維酶體基因的改建方法，其特征在于，所述克隆目標(biāo)基因步驟為:以纖維酶體的支架蛋白的編碼基因?yàn)槟０澹ㄟ^PCR擴(kuò)增其中的編碼纖維素結(jié)合域的基因片段
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種纖維酶體基因的改建方法，其特征在于，所述刪除單體酶上的冗余序列步驟為:刪除cdi?中編碼錨定域的堿基序列，得到基因片段
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種纖維酶體基因的改建方法，其特征在于，所述嫁接纖維素結(jié)合域步驟為將基因片段cbd融合到celD-?的尾部，得到基因celD-^cbd。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種纖維酶體基因的改建方法，其特征在于，所述基因片段cbd的上游帶有I個(gè)鏈接片段，編碼10-60個(gè)氨基酸，在酶的主體與纖維素結(jié)合域之間起鏈接作用，融合有該鏈接片段的cbd序列稱之為Lcbd。
6.一種通過基因改建獲得的新型纖維素酶NcelD，其特征在于，所述新型纖維素酶NcelD由基因cdD-d+Zdi/編碼，其肽鏈不帶有與纖維酶體支架蛋白上的粘粒模塊相吸附的錨定域、帶有I段鏈接短肽、具有嫁接的纖維素結(jié)合域片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種通過基因改建獲得的新型纖維素酶NcelD，其特征在于，所述新型纖維素酶NcelD是能夠結(jié)合纖維素的獨(dú)立酶，不需要也不結(jié)合支架蛋白，水解纖維素的活性比自然單體酶CelD高。
8.一種新型纖維素酶NcelD的超量表達(dá)方法，其特征在于，以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)PHsh的質(zhì)粒為表達(dá)載體，表達(dá)質(zhì)粒命名為pHsh-NcelD。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK103923933SQ201410173567
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】邵蔚藍(lán), 王洪成, 王蒙 申請人:江蘇大學(xué)