血漿特定片段游離dna定量檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒,包括以下組分:用于擴增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對,所述2個引物對的后向引物位點一致,通過前向引物確定所擴增的TP53基因片段的長度;用于擴增內(nèi)參基因Beta-actin的1個引物對;胎兒基因組DNA。本發(fā)明試劑盒在熒光定量PCR技術基礎上引入了校準系統(tǒng),以胎兒基因組DNA為背景DNA,看家基因Beta-actin為內(nèi)參基因,抑癌基因TP53為目的基因,針對抑癌基因TP53不同長度片段設計擴增引物,采用實時熒光定量PCR法同步擴增Beta-actin基因和TP53基因不同長度片段,可定量檢測血漿中特定片段大小的游離DNA含量。
【專利說明】血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分析【技術領域】,涉及一種DNA檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]外周血游離DNA是指外周血中游離于細胞外的部分降解了的機體內(nèi)源性DNA。其來源主要有三個:細胞凋亡、壞死、分泌。
[0003]1989年,STROUN等對腫瘤患者血液游離DNA進行研究時發(fā)現(xiàn)其具有腫瘤細胞DNA的一些特征,因而提出腫瘤患者血液游離DNA可能源自腫瘤細胞。5年后研究者在腫瘤患者的血漿和血清中檢測到了癌基因突變,對其進行光譜分析后發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤相一致?,F(xiàn)已證實,腫瘤患者血液中,具有腫瘤生物學特征的DNA主要源于腫瘤細胞壞死和凋亡后自然散發(fā)或者在增生活躍時自動釋放。另有文獻報道,癌變?nèi)巳貉獫{中游離100~400bp大小的DNA片段濃度明顯高于正常人,可以作為癌癥篩查的標志物。
[0004]但現(xiàn)有技術中,尚未見對血漿中特定大小片段的游離DNA進行定量檢測的方法。雖然有文獻報道,可通過實時熒光定量檢測技術檢測人基因組中某一個看家基因來對外周血中游離DNA進行定量檢測,但由于外周血中DNA片段大小分布多樣,這種檢測技術并不能獲得其中某一特定大小DNA片段的相關信息。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]有鑒于此,本發(fā)明的目的在于提供一種血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒,可以對與腫瘤發(fā)展密切相關的血漿中特定片段大小的游離DNA進行定量檢測,結(jié)果準確、特異、靈敏。
[0006]經(jīng)研究,本發(fā)明提供如下技術方案:
[0007]1.血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒,包括以下組分:
[0008]用于擴增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對;所述2個引物對的后向引物位點一致,通過前向引物確定所擴增的TP53基因片段的長度;
[0009]用于擴增內(nèi)參基因Beta-actin的I個引物對;
[0010]胎兒基因組DNA。
[0011]優(yōu)選的,所述用于擴增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對序列分別如 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.6 所示。
[0012]優(yōu)選的,所述用于擴增內(nèi)參基因Beta-actin的I個引物對序列分別如SEQ IDN0.7 和 SEQ ID N0.8 所示。
[0013]本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn),腫瘤患者血漿中150_400bp DNA片段在血漿總游離DNA中的相對含量百分比明顯高于健康人群,差異顯著,因此,測定血漿中150-400bp DNA片段的濃度可以作為腫瘤篩查的有效手段之一。上述血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒中包括用于擴增長度分別為400bp和150bp的TP53基因片段的2個引物對。以胎兒基因組DNA為背景DNA,看家基因Beta-actin為內(nèi)參基因,采用實時熒光定量PCR法同步擴增Beta-actin基因和TP53基因不同長度片段,可以分別獲得血漿中400bp DNA片段與150bp DNA片段的濃度,然后用150bp DNA片段的濃度減去400bp DNA片段的濃度可獲得150_400bp DNA片段的濃度,從而進行腫瘤篩查。
[0014]進一步,所述血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒還包括以下組分:用于擴增長度分別為大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3個引物對;所述3個引物對與用于擴增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對的后向引物位點一致,通過前向引物確定所擴增的TP53基因片段的長度。
[0015]優(yōu)選的,所述用于擴增長度分別為大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3個引物對序列分別如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.6、SEQ IDN0.5 和 SEQ ID N0.6 所示。
[0016]上述血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒包括用于擴增長度分別為大于400bp、400bp、150bp、100bp、60bp的TP53基因片段的5個引物。以胎兒基因組DNA為背景DNA,看家基因Beta-actin為內(nèi)參基因,采用實時熒光定量PCR法同步擴增Beta-actin基因和TP53基因不同長度片段,可以分別獲得血漿中大于400bp DNA片段、400bp DNA片段、150bp DNA片段、10bp DNA片段、60bp DNA片段的濃度,然后用150bp DNA片段的濃度減去400bp DNA片段的濃度可獲得150-400bp DNA片段的濃度,用10bp DNA片段的濃度減去150bp游離DNA片段的濃度可獲得100-150bp DNA片段的濃度,用60bp DNA片段的濃度減去10bp DNA片段的濃度可獲得60-100bp DNA片段的濃度,從而對血漿中特定片段大小的游離DNA進行定量檢測。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明試劑盒在熒光定量PCR技術基礎上引入了校準系統(tǒng),以胎兒基因組DNA為背景DNA,看家基因Beta-actin為內(nèi)參基因,抑癌基因TP53為目的基因,針對抑癌基因TP53不同長度片段設計擴增引物,采用實時熒光定量PCR法同步擴增Beta-actin基因和TP53基因不同長度片段,可定量檢測血漿中特定片段大小的游離DNA含量。其中,以胎兒基因組DNA為背景DNA,能夠有效去除反應體系的誤差和干擾;以Beta-actin基因為內(nèi)參基因,與TP53基因不同長度片段在同一體系內(nèi)同步擴增,二者的擴增無相互干擾,特異性好,獲得的Cp值可以用來校準擴增體系產(chǎn)生的誤差。本發(fā)明試劑盒實現(xiàn)了與腫瘤密切相關的血漿中特定大小游離DNA片段的定量檢測,排除了其他片段DNA的影響,對腫瘤的篩查、療效判斷、預后等都具有重要意義,其檢測靈敏度達到Ing/mL,批間重復性和穩(wěn)定性達到三類醫(yī)療器械注冊的要求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚,本發(fā)明提供如下附圖進行說明:
[0019]圖1為標準曲線。
[0020]圖2為Beta-actin基因擴增曲線。
[0021]圖3為TP53基因擴增曲線。
[0022]圖4為Beta-actin基因與TP53基因同時擴增圖。
[0023]圖5為加入胎兒基因組作為背景DNA的樣品擴增效果。
[0024] 圖6為未加入胎兒基因組作為背景DNA的擴增效果。
【具體實施方式】
[0025]下面將結(jié)合附圖,對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,或按照制造廠商所建議的條件進行。
[0026]由于TP53基因作為一種抑癌基因存在于所有類型的癌細胞中,因此,本發(fā)明選擇TP53基因作為目的基因。針對其DNA序列,分別設計不同引物進行不同長度DNA片段(長度分別為大于400bp、400bp、150bp、100bp、60bp)的擴增與定量檢測。引物設計方法為:固定后向引物位點,通過前向引物確定DNA擴增片段的大小。優(yōu)選的引物序列如下:
[0027]前向引物:TP53-D400F:5’ -ACACCACTGTGCTCCAGCCT-3,(SEQ ID N0.1);
[0028]TP53-400F:5,-GTTCACTTGTGCCCTGACTTTC-3,(SEQ ID N0.2);
[0029]TP53-150F:5,-CTGCTCAGATAGCGATGGTGAGCAG-3,(SEQ ID N0.3);
[0030]TP53-100F:5,-GGTTGCCCAGGGTCCCCAGGCCTCT-3,(SEQ ID N0.4);
[0031]TP53-60F:5,-CTCAGCATCTTATCCGAGTGGAA-3’ (SEQ ID N0.5);
[0032]后向引物:TP53-R:5’ -TGTTTCTGTCATCCAAATACTCCA-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0033]其中,TP53-D400F和TP53-R用于擴增長度大于400bp的TP53基因片段;TP53-400F和TP53-R用于擴增長度為400bp的TP53基因片段;TP53_150F和TP53-R用于擴增長度為150bp的TP53 基因片段;TP53-100F和TP53-R用于擴增長度為10bp的TP53基因片段;TP53-60F和TP53-R用于擴增長度為60bp的TP53基因片段。
[0034]同時,選擇看家基因Beta-actin為內(nèi)參基因,并設計內(nèi)參引物序列如下:
[0035]前向引物:ACTB-F:5’ -TACCACTGGCATCGTGATGGAC-3’ (SEQ ID N0.7);
[0036]后向引物:ACTB-R:5’ -CATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3’ (SEQ ID N0.8)。
[0037]取胎兒基因組DNA,梯度稀釋后作為DNA標準品,其濃度通過Nanodrop分光光度計測定。向25ul PCR反應體系中加入5ul上述DNA標準品作為DNA模板,以ACTB-F和ACTB-R為引物,用羅氏熒光定量PCR儀(Roche LightCycler480)進行熒光定量檢測。PCR反應體系具體為:13 μ I mix (包含 10XPCR buffer2 μ 1、SYBR Green 飽和性染料 I μ 1、5U/μ I TaqDNA polymerase0.2μ lU5mM MgCl22 μ 1、1mM dNTP0.5 μ I 和 ddH207.3 μ 1,其中 10XPCRbuffer 包含 10-40mM Tris-Cl、50_200mM 氯化鉀、0-5.0mM 二硫蘇糖醇(DTT) ,0-1.0mM乙二胺四乙酸二鈉鈣(EDTA)、0-20vol%乙基苯基聚乙二醇(Nonidet) P-40、0_2.0vol %吐溫 20 (Tween20)、30_70vol % 甘油和穩(wěn)定劑(pH7.0-10.0)),1mM ACTB-F0.5 μ 1,1mMACTB-R0.5 μ 1,5 μ I DNA 模板(lOng/ μ I 血漿 DNA2 μ I 和 lng/ μ I 胎兒基因組 DNA3 μ I),ddH206 y I。PCR反應程序為:變性階段:95°C 3min ;擴增階段:95°C 10s,60。。30s,共40個循環(huán);溶解階段:55-90°C,每0.2°C采集一次熒光。以Cp值為縱坐標,DNA模板濃度為橫坐標,繪制標準曲線,如圖1。標準曲線方程為:Y = -1.36471ηχ+32.327,R2 = 0.9951 ;x代表血漿DNA濃度,Y代表Cp值。
[0038]取外周血樣品,分離血漿,提取血漿DNA,加入胎兒基因組DNA作為背景DNA,采用實時熒光定量PCR法同步擴增Beta-actin基因與TP53基因不同長度片段,定量檢測血漿特定片段游離DNA的濃度。PCR反應體系具體為:13μ I mix(包含10XPCR buffer2y 1、SYBR Green 飽和性染料 I μ 1、5U/μ I Taq DNA polymerase0.2 μ lU5mM MgCl22 μ 1、1mMdNTP0.5 μ I 和 ddH207.3 μ 1,其中 10XPCR buffer 包含 10_40mM Tris-Cl、50_200mM 氯化鉀、0-5.0mM 二硫蘇糖醇(DTT) ,0-1.0mM乙二胺四乙酸二鈉鈣(EDTA)、0_20vol %乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40、0-2.0vol % 吐溫 20 (Tween20)、30_70vol % 甘油和穩(wěn)定劑(pH7.0-10.0)),1mM ACTB-F0.5 μ I,1mM ACTB-R0.5 μ I,1mM TP53-D400F0.5 μ I,1mMTP53-400F0.5 μ I,1mM TP53-150F0.5 μ I,1mM TP53-100F0.5 μ I,1mM TP53-60F0.5 μ 1,1mM TP53-R0.5 μ 1,5μ I DNA 模板(lOng/μ I 血漿 DNA2 μ I 和 lng/μ I 胎兒基因組Ε)ΝΑ3μ 1),ddH203 y I。PCR反應程序為:變性階段:95°C 3min ;擴增階段:95 °C 1s,600C 30s,共40個循環(huán);溶解階段:55-90°C,每0.2°C采集一次熒光。獲得Cp值,通過標準曲線計算得到血漿中大于400bp、400bp、150bp、100bp、60bp游離DNA片段的濃度。然后,用150bp游離DNA片段的濃度減去400bp游離DNA片段的濃度可以獲得150_400bp游離DNA片段的濃度,用10bp游離DNA片段的濃度減去150bp游離DNA片段的濃度可以獲得100-150bp游離DNA片段的濃度,用60bp游離DNA片段的濃度減去10bp游離DNA片段的濃度可以獲得60-100bp游離DNA片段的濃度。
[0039]圖2為Beta-actin基因擴增曲線。圖3為TP53基因擴增曲線。圖4為Beta-actin基因與TP53基因同時擴增圖。從圖2、圖3和圖6可以看出,以Beta-actin基因為內(nèi)參基因,與TP53基因不同長度片段在同一體系內(nèi)同步擴增,二者的擴增無相互干擾,特異性好,獲得的Cp值可以用來校準擴增體系產(chǎn)生的誤差。
[0040]圖5為加入胎兒基因組作為背景DNA的樣品擴增效果。圖6為未加入胎兒基因組作為背景DNA的擴增效果。從圖5和圖6可以看出,以胎兒基因組DNA為背景DNA,能夠有效去除反應體系的誤差和干擾。
[0041]Gene Science公司的統(tǒng)計數(shù)顯示,當血衆(zhòng)中游離DNA濃度大于25ng/ml時,70.8%會發(fā)展為癌癥患者。本發(fā)明采用上述引物和檢測方法,對400例健康人群、198例腸癌患者、298例胃癌患者、200例乳腺癌患者血漿中特定大小的游離DNA片段進行了定量檢測。結(jié)果見表1。
[0042]表1血漿中特定大小游離DNA片段的定量檢測結(jié)果
【權利要求】
1.血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒,其特征在于,包括以下組分: 用于擴增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對;所述2個引物對的后向引物位點一致,通過前向引物確定所擴增的TP53基因片段的長度; 用于擴增內(nèi)參基因Beta-actin的I個引物對; 胎兒基因組DNA。
2.如權利要求1所述的血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒,其特征在于,所述用于擴增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對序列分別如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.6 所示。
3.如權利要求1或2所述的血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒,其特征在于,還包括以下組分: 用于擴增長度分別為大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3個引物對;所述3個引物對與用于擴增長度分別為400bp、150bp的TP53基因片段的2個引物對的后向引物位點一致,通過前向引物確定所擴增的TP53基因片段的長度。
4.如權利要求3所述的血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒,其特征在于,所述用于擴增長度分別為大于400bp、100bp、60bp的TP53基因片段的3個引物對序列分別如SEQ IDN0.1 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 所示。
5.如權利要求1所述的血漿特定片段游離DNA定量檢測試劑盒,其特征在于,所述用于擴增內(nèi)參基因Beta-actin的I個引物對序列分別如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104073554SQ201410174787
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權日:2014年4月28日
【發(fā)明者】王弢, 樂飚, 李宗飛, 張利清, 張麗 申請人:江蘇至真生物醫(yī)藥科技有限公司