用于酶漂白食品的新穎酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于酶漂白食品的新穎酶。本發(fā)明涉及：根據(jù)caroase01-05的新穎的多肽或它們中任一的任何功能等價(jià)物，其適用于制備具有提高的白度的食品的方法；所述酶用于提高至少食品一部分的白度的用途；用于制備食品的方法，其中使用所述酶；和所獲得的食品。
【專利說明】用于酶漂白食品的新穎酶
[0001]本發(fā)明是申請日為2006年7月12日、申請?zhí)枮?00680025579.0、題為“用于酶漂
白食品的新穎酶”的申請的分案申請。
[0002]本發(fā)明涉及適用于食品(其具有提高的白度)制備方法的新穎酶、該酶提高食品的至少一部分的白度的用途、用于制備食品的方法(其中使用所述酶)和獲得的食品。
[0003]在一些類型的食品中，食品至少一部分為白色是人們期望的，例如在乳制品(例如乳酪、乳清、黃油和乳粉)中和在基于面粉的產(chǎn)物(例如面包和面條)中。
[0004]然而，這類食品的原料或中間體可能包含色素，這可引起食品為米色到黃色。這類色素的實(shí)例是類胡蘿卜素(胡蘿卜素和葉黃素)和黃酮。
[0005]例如在白面包中，人們期望看到白色的碎屑。更白的碎屑可通過使用酶(例如過氧化氫酶、過氧化物酶、酯酶和/或脂肪氧化酶)獲得，參閱例如'Oxido-reductasesand Lipases as Dough-Bleaching Agent ' by P.Gelinas et al, Cereal Chem,75 (6),810-814(1998)。提到的所有酶都對碎屑具有漂白效應(yīng)。目前，烘焙工業(yè)主要使用酶活性的大豆粉，其含有脂肪氧化酶。大豆粉中的脂肪氧化酶由于自由基和其他活性氧的作用，能夠漂白小麥面粉色素，所述自由基和其他活性氧在脂肪氧化酶氧化脂肪酸時(shí)形成。該反應(yīng)稱作共氧化(co-oxidation)。在大?粉中存在二種脂肪氧化酶:L1、L2和L3,其中L2和L3具有最佳的漂白活性(W.Gr osch, G.Laskawy and F.Weber, J.Agric.Food Chem24 (1976)，456)。大豆粉不僅含有脂肪氧化酶，還含有漂白效應(yīng)所必需的脂肪酸，導(dǎo)致改善的漂白效應(yīng)。
[0006]使用大豆作為脂肪氧化酶來源的缺點(diǎn)在于目前大部分大豆是被遺傳修飾的(GMO)。因?yàn)槿澜绲南M(fèi)者偏好于使用非GMO來源的面包改良添加劑，所以非常需要大豆脂肪氧化酶的替代方案。除了來自大豆的脂肪氧化酶L2和L3之外的其它已知酶具有下述缺點(diǎn):它們的表現(xiàn)不如來自大豆的脂肪氧化酶好。在實(shí)踐中，為了獲得期望的白度，將這些酶與輔助因子或其他酶組合以達(dá)到期望的碎屑白度水平。過氧化物酶通過分子氧非酶地催化不飽和化合物(例如不飽和脂肪酸)的氧化(CE.Eriksson et.al.JA0S48 (1971) 442)。這些被氧化的脂肪酸產(chǎn)生自由基，所述自由基可能與面粉色素反應(yīng)，以與脂肪氧化酶反應(yīng)產(chǎn)物相似的方式產(chǎn)生顏色更淺的產(chǎn)物。
[0007]本發(fā)明的目的是提供適用于制備食品的新穎酶，所述食品的至少一部分的白度被提聞。
[0008]令人驚奇地發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的漂白酶能夠?qū)⑸刂苯愚D(zhuǎn)化為導(dǎo)致白度提高的形式。這些酶可以以多種形式顯示它們對色素的直接漂白效應(yīng)。例如，它們可通過例如氫化將色素中的不飽合鍵飽和來直接轉(zhuǎn)化色素，或它們可直接切割色素形成降解產(chǎn)物。術(shù)語直接是指酶作用于色素，色素自身作為底物。不明確排除使用輔助因子來達(dá)成轉(zhuǎn)化。
[0009]另外發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的漂白多肽能夠直接切割色素(所謂的切割酶)。根據(jù)本發(fā)明的合適切割酶是能夠切割類胡蘿卜素(胡蘿卜素和葉黃素)和黃酮的酶。類胡蘿卜素可以以兩種不同方式被切割，中心的和偏心的。類胡蘿卜素中心切割導(dǎo)致形成類視黃醇(C2tl-化合物)。偏心切割可產(chǎn)生更多樣性的化合物，例如脫落酸。能夠中心切割類胡蘿卜素的酶為例如 EP-A-1031623 和 J.Lintig and K.Vogt (2000) J.Biol.Chem.275，11915 中描述的例如β-胡蘿卜素15，15'-單加氧酶(EC1.14.99.36)。該酶先前已知為β _胡蘿卜素 15，15'-雙加氧酶=ECl.13.11.21。
[0010]使用能夠中心切割的酶的另一好處在于形成類視黃醇。這些是視覺的關(guān)鍵成分，β-胡蘿卜素被切割為兩分子的視黃醛。該視黃醛可以被修飾為視黃醇，也稱作維生素Α。能夠偏心切割類胡蘿卜素的酶為9-順-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(例如X.Qinand J.A.D.Zeevaart (1999)，Proc.Nat.Acad.Science, 96,15354)和 β -胡蘿卜素 9 '，10'-雙加氧酶(例如 Kiefer et al.(2001)，J.Biol.Chem.287，14110)。
[0011]該目的通過本發(fā)明中公開的新穎酶達(dá)成。
[0012]在第一方面，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的多肽，其具有漂白活性和一種或多種選自以下的特征:
[0013]I)根據(jù)SEQ ID NO:08-12任一的經(jīng)分離的多肽或其任一的功能等價(jià)物；
[0014]2)經(jīng)分離的多肽,其可通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞例如Aspergillus niger中表達(dá)下述物質(zhì)獲得:根據(jù)SEQ ID NO:01-07任一的多核苷酸，或其任一的功能等價(jià)物，或包含所述多核苷酸或其任一功能等價(jià)物的載體，和
[0015]3)多肽，其至少包含SEQ ID NO:13-17之一。
[0016]術(shù)語“具有漂白活性的多肽”在此處和下文中定義為能夠降解β_胡蘿卜素的多肽或能夠漂白食品的多肽。β_胡蘿卜素降解可以通過例如本專利申請的“材料和方法”章節(jié)中公開的至少一種方 法測量，例如根據(jù)Zorn的方法或根據(jù)Aziz的方法。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多肽在Aziz和Zorn測定法中均顯示漂白活性。漂白食品的能力可以通過將產(chǎn)物A (其中被研究的多肽用于其制備中)的白度與產(chǎn)物B (其與產(chǎn)物A的區(qū)別僅在于所研究的多肽未用于其產(chǎn)物中)的白度視覺地或通過已知的反射測定法比較來測定，其中在被研究的多肽具有漂白活性時(shí)，產(chǎn)物A的b因子會(huì)比產(chǎn)物B的b因子更接近O。
[0017]更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多肽能夠降解β-胡蘿卜素(如根據(jù)Zorn所測定的)并且能夠漂白食品(如通過反射測量法測量b因子所測定的)。最優(yōu)選地，在被漂白的食品具有不規(guī)則的表面結(jié)構(gòu)(例如面包屑)的情況下，根據(jù)本發(fā)明的多肽能夠降解胡蘿卜素(如根據(jù)Zorn所測定的)，因?yàn)榇藭r(shí)反射測量方法不那么可靠。
[0018]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供經(jīng)純化的多肽。根據(jù)本發(fā)明的多肽包括由根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽。特別優(yōu)選的是根據(jù)SEQ ID NO:08-12的多肽活其任一的功能等價(jià)物。
[0019]包含根據(jù)本發(fā)明的多肽的融合蛋白也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的多肽的制造方法。
[0020]為了避免疑惑；SEQIDNO:01-07是指包含SEQ IDNO:0USEQ ID NO:02、SEQ IDNO:03,SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:06 和 SEQ ID NO:07 的 DNA 組；SEQ ID NO:08-12是指包含 SEQ ID NO:08, SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11 和 SEQ ID NO:12 的蛋白質(zhì)序列組；SEQ ID NO:13-18 是指包含 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO:16 和 SEQ ID NO:17 的蛋白質(zhì)序列組。另外，術(shù)語 caroase-01、caroase-02、caroase_03、caroase-04、caroase-05 (整組被稱作 “caroase-01_05”)用于表不分別具有 SEQ ID NO:08-12的多肽。[0021]第二方面，本發(fā)明提供具有下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列在高嚴(yán)格度條件下優(yōu)選地與根據(jù)SEQ ID NO:01-07之任一的序列雜交。因此，本發(fā)明提供核酸，所述核酸與根據(jù)SEQ ID NO:01-07的序列約55%、優(yōu)選地65%、更優(yōu)選地70%、進(jìn)一步更優(yōu)選地 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同源。
[0022]在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供這類經(jīng)分離的多核苷酸，其可得自真菌，優(yōu)選地得自絲狀真菌，特別是優(yōu)選Marasmius,例如M.scorodonius。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供經(jīng)分離的多核苷酸，其包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO:08-12中所示的氨基酸序列或其任一的功能等價(jià)物。
[0024]在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供經(jīng)分離的多核苷酸，其編碼根據(jù)SEQ IDNO:08-12的多肽或其任一的功能等價(jià)物的至少一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。
[0025]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供根據(jù)SEQ ID NO:01-07的漂白酶基因。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼漂白酶的多核苷酸或這些多肽中任一的變體或片段，所述漂白酶的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:08-12中。
[0026]在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼序列的多核苷酸(優(yōu)選SEQ IDNO:01-07的多核苷酸序列)，所述編碼序列編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽。
[0027]第三方面，本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列的載體，和可用于擴(kuò)增或檢測本發(fā)明DNA的引物、探針和片段。
[0028]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供一種載體，其中根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列功能性連接，所述調(diào) 節(jié)序列適用于在合適的宿主細(xì)胞(如細(xì)菌或絲狀真菌，優(yōu)選Marasmius 例如 M.scorodonius>AspergiIIus 例如 A.niger 或 A.0ryzae)中表達(dá)所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還提供用于制備本發(fā)明多核苷酸和載體的方法。
[0029]第四方面，本發(fā)明還涉及重組產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明的異源或同源多核苷酸。
[0030]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供重組的宿主細(xì)胞，其中本發(fā)明過氧化物酶的表達(dá)被顯著提高，或其中過氧化物酶的活性被提高。
[0031]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供重組產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明的異源或同源DNA，其中所述細(xì)胞能夠生產(chǎn)本發(fā)明的功能性過氧化物酶，優(yōu)選能夠過表達(dá)(overexpress)本發(fā)明過氧化物酶的細(xì)胞,例如包含提高的本發(fā)明基因拷貝數(shù)的Aspergillus 菌株。
[0032]第五方面，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的漂白多肽在任何工業(yè)方法中的用途，優(yōu)選如本文所述的用途。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的多肽
[0034]本發(fā)明提供經(jīng)分離的多肽，其具有根據(jù)SEQ ID NO:08-12中任一的氨基酸序列，以及可通過在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)SEQ IDNO:01-07多核苷酸獲得的氨基酸序列。另外，包含上述多肽功能等價(jià)物的肽或多肽也包含在本發(fā)明中。上述肽共同包含在術(shù)語“根據(jù)本發(fā)明的多肽”中。
[0035]術(shù)語“肽”和“寡肽”在此處和下文中被認(rèn)為是同義的(如通常所認(rèn)為的)，每個(gè)術(shù)語可以按照上下文的需要互換使用表示通過肽鍵偶聯(lián)的至少兩個(gè)氨基酸鏈。詞語“多肽”在本文中用于含有多于七個(gè)氨基酸殘基的鏈。本文的所有寡肽和多肽式從左到右、從氨基端到羧基端書寫。本文使用的氨基酸單字母代碼為本領(lǐng)域公知并可見于Sambrook, etal.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd, ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。
[0036]“經(jīng)分離的”多肽或蛋白質(zhì)表示從其天然環(huán)境中取出的多肽或蛋白質(zhì)。例如，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是分離的，其為通過任何合適的技術(shù)被實(shí)質(zhì)純化的天然或重組多肽，所述技術(shù)如例如Smith and Johnson, Gene67:31-40 (1988)中公開的單步純化方法。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的caroase-01-05漂白酶或其功能等價(jià)物可通過公知的方法從重組細(xì)胞中回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。最優(yōu)選地，使用高效液相色譜("HPLC ")用于純化。
[0038]本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成過程的產(chǎn)物和通過重組技術(shù)從原核或真核宿主(包括例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中生產(chǎn)的產(chǎn)物。根據(jù)重組生產(chǎn)過程中所使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以被糖基化或未糖基化。另外，本發(fā)明的多肽也可包括原始的改良甲硫氨酸殘基，在一些情況下是宿主介導(dǎo)過程的結(jié)果。
[0039]功能等價(jià)物
[0040]術(shù)語“功能等價(jià)物”和“功能變體”在本文中可交換使用。caroaseO1-OOTNA的功能等價(jià)物是編碼多肽的經(jīng)分離DNA,所述多肽顯示與本文定義的caroase01-05Marasmiusscorodonius漂白酶中至少一個(gè)至少相同或更好的漂白活性。本發(fā)明caroase01_05多肽的功能等價(jià)物是下述多肽，所述多肽顯示與本文定義的caroaseOl_05Marasmiusscorodonius漂白酶中 至少一個(gè)至少相同或更好的漂白活性。
[0041]功能性蛋白質(zhì)多肽等價(jià)物可僅含有SEQ ID NO:08-12中任一個(gè)的一種或多種氨基酸的保守性取代，或這些中任一個(gè)的非必需氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非必需氨基酸是SEQ ID NO:08-12任一個(gè)中可被改變而不顯著改變生物學(xué)功能的殘基。例如，在本發(fā)明caroase01-05蛋白質(zhì)中保守的氨基酸殘基被預(yù)測為特別不適合改變。另外，根據(jù)本發(fā)明的caroaseO 1-05蛋白質(zhì)和其他過氧化物酶中保守的氨基酸不太可能適合改變。
[0042]術(shù)語“保守取代”旨在表示一種取代，其中氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代。這些家族是本領(lǐng)域公知的，并包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、帶有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶β分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
[0043]功能性核酸等價(jià)物可典型地含有沉默突變或不改變所編碼多肽生物功能的突變。因此，本發(fā)明提供編碼caroaseOl-05蛋白質(zhì)的核酸分子，它的對特定生物學(xué)活性不必需的氨基酸殘基有所改變。這類caroaseOl-05蛋白質(zhì)與SEQ ID NO:08-12任一的氨基酸序列不同，但仍保持至少一種生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO:08-12任一種已知的氨基酸序列至少約55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 同源或更同源的基本同源的氨基酸序列。
[0044]例如，涉及如何制造表型沉默氨基酸取代的指導(dǎo)在Bowie，J.U.et al.，Science247:1306-1310(1990)中提供，其中作者指出存在兩種主要的途徑用于研究氨基酸序列對改變的耐受。第一種方法依賴于進(jìn)化的過程，其中突變被自然選擇接受或拒絕。第二種方法使用基因工程在被克隆基因的特定位點(diǎn)引入氨基酸改變，選擇或篩選以鑒定維持功能性的序列。如作者所述，這些研究顯示蛋白質(zhì)對氨基酸取代驚人地耐受。作者還指出改變很可能在蛋白質(zhì)的某些位置被允許。例如，大部分內(nèi)陷的氨基酸殘基需要非極性的側(cè)鏈，而通常很少保留表面?zhèn)孺湹奶卣?。其他這類表型沉默突變描述于上文Bowie et al和其中所引的參考文獻(xiàn)中。
[0045]編碼與SEQ ID NO:08_12任一蛋白質(zhì)同源的caroase01_05蛋白質(zhì)的經(jīng)分離核酸分子可以如下產(chǎn)生:向根據(jù)SEQ ID NO:01-07的編碼核苷酸序列中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失，使得一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入被引入所編碼的蛋白質(zhì)中。這類突變可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被引入，例如定向誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。
[0046]術(shù)語“功能等價(jià)物”也包括M.scorodonius caroaseO 1-05蛋白質(zhì)的直向同源物。M.scorodonius caroase01-05蛋白質(zhì)的直向同源物是可從其他菌株或物種中分離并具有相似或相同生物活性的蛋白質(zhì)。這類直向同源物可容易地被鑒定，因?yàn)榘cSEQ ID NO:08-12任一個(gè)基本同源的氨基酸序列。
[0047]如本文所定義的，術(shù)語“基本同源”是指第一氨基酸或核苷酸序列含有足夠數(shù)量或最小數(shù)量的與第二氨基酸或核苷酸序列相同或等價(jià)(例如具有類似的側(cè)鏈)的氨基酸或核苷酸，從而所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)域。例如，含有下述共同結(jié)構(gòu)域的氨基酸或核苷酸序列在本文被定義為足夠相同，所述共同結(jié)構(gòu)域具有約55%，優(yōu)選65%，更優(yōu)選 70%，進(jìn)一步更優(yōu)選 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性或更多。
[0048]編碼其他caroase01-05家族成員的核酸(其因此具有與SEQ IDNO:01_07不同的核苷酸序列)也屬于本發(fā)明的范圍。另外，編碼來自不同物種caroase01-05的核酸(其因此具有與SEQ ID NO:01-07不同的核苷酸序列)屬于本發(fā)明的范圍。
[0049]對應(yīng)于本發(fā)明caroaseO 1-0OTNA變體(例如天然等位變體)和同源物的核酸分子可根據(jù)它們與本文公開的caroase01-05核酸分子的同源性,使用本文公開的DNA或其合適片段作為雜交探針，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)優(yōu)選地在高嚴(yán)格度雜交條件下分離。
[0050]除了天然存在的caroase01-05序列的等位變體外,本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)了解可通過突變技術(shù)將改變引入SEQ ID NO:01-07的核苷酸序列中，從而導(dǎo)致caroaseO 1_05蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的改變而不顯著改變caroase01-05蛋白質(zhì)的功能。
[0051]在本發(fā)明的另一方面，提供經(jīng)改進(jìn)的caroase01-05蛋白質(zhì)。經(jīng)改進(jìn)的caroase01-05蛋白質(zhì)是其中至少一種生物學(xué)活性被改進(jìn)的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)可通過向caroase01-05編碼序列的全部或部分隨機(jī)引入突變(例如通過飽和誘變)來獲得，得到的突變體可被重組表達(dá)并篩選其生物活性。例如，本領(lǐng)域提供用于測量過氧化物酶酶活性的標(biāo)準(zhǔn)測定法，從而改良的蛋白質(zhì)可容易地被選擇。
[0052] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，caroase01-05蛋白質(zhì)分別具有根據(jù)SEQ ID NO:08_12任一的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，caroaseOl-05多肽與根據(jù)SEQ ID NO:08-12的氨基酸序列基本上分別同源，并分別保持根據(jù)SEQ ID NO:08-12的多肽的至少一種生物活性，但是因?yàn)樘烊煌蛔兓蛉缟纤龅恼T變而在氨基酸序列上有所不同。
[0053]在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，caroase01-05蛋白質(zhì)具有由經(jīng)分離的核酸片段編碼的氨基酸序列，所述核酸片段能夠與根據(jù)SEQ ID NO:01-07的核酸雜交，優(yōu)選在高嚴(yán)格度雜交條件下雜交。
[0054]因此，caroase01-05蛋白質(zhì)是下述蛋白質(zhì),所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO:08_12任一所示的氨基酸序列至少約 55%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98^^99%同源或更多同源的氨基酸序列，并保持根據(jù)SEQ ID NO:08-12任一的多肽的至少一種功能活性。
[0055]在本發(fā)明的另一方面。多肽包含至少一個(gè)SEQ ID NO: 13-17中所示的序列。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多肽包含至少兩個(gè)SEQ ID NO:13-17中所示的序列。最優(yōu)選地，多肽包含SEQ ID NO:13-17中所示的全部序列。
[0056]也可例如通過篩選本發(fā)明蛋白質(zhì)突變體(例如截短突變體)的組合文庫的過氧化物酶活性來鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)的功能等價(jià)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過在核酸水平組合誘變產(chǎn)生變體的多樣化文庫。變體多樣化文庫可如下產(chǎn)生:例如將合成的寡核苷酸酶連接為基因序列從而可能的 蛋白質(zhì)序列的簡并集合可作為個(gè)體多肽被表達(dá)，或者作為更大的融合蛋白質(zhì)組(例如噬菌體展示)被表達(dá)。存在多種方法可被用于從簡并寡核苷酸序列產(chǎn)生本發(fā)明多肽的可能變體文庫。用于合成簡并寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域已知(參閱例如 Narang(1983) Tetrahedron39:3 ；ltakura et al.(1984) Annu.Rev.Biochem.53:323 ；ltakura et al.(1984) Sciencel98: 1056 ；Ike et al.(1983) Nucleic Acid Res.11:477)。
[0057]另外，本發(fā)明多肽編碼序列的片段文庫可被用于產(chǎn)生多肽的多樣化群體，用于篩選隨后的變體選擇。例如，編碼序列片段的文庫可如下產(chǎn)生:用核酸酶在每個(gè)分子僅發(fā)生一次切割的條件下處理感興趣的編碼序列的雙鏈PCR片段、將雙鏈DNA變性、將DNA變性形成雙鏈DNA (其可包括來自不同切割產(chǎn)物的正義/反義對)、通過用SI核酸酶處理從重新形成的雙鏈體去除單鏈部分，和將得到的片段文庫連接為表達(dá)載體。通過該方法可產(chǎn)生表達(dá)文庫，所述文庫編碼感興趣的蛋白質(zhì)不同尺寸的N-末端和中間片段。
[0058]本領(lǐng)域已知若干技術(shù)用于篩選通過截短點(diǎn)突變產(chǎn)生的組合文庫中的基因產(chǎn)物，和篩選cDNA文庫中具有選定特性的基因產(chǎn)物。用于篩選大基因文庫的最廣泛使用的技術(shù)(其適合高通量分析)典型地包括將基因文庫克隆進(jìn)可復(fù)制的表達(dá)載體中、用得到的載體文庫轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)胞，和在下述條件下表達(dá)組合基因，所述條件下所期望的活性的檢測有利于載體的分離，所述載體編碼其產(chǎn)物被檢測的基因?；貧w總體誘變(REM)——一種增強(qiáng)文庫中功能突變體頻率的技術(shù)一一可與鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)變體的篩選測定法組合使用(Arkinand Yourvan (1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:7811-7815 ；Delgrave et al.(1993)Protein Engineering6 (3):327-331)。
[0059]除了所不的caroaseOl-O5 基因序列(其中，caroase-01 是 SEQ ID NO:01 或 O2 ；caroase-02 是 SEQ ID NO:03 或 4 ;caroase_03 是 SEQ ID NO:05 ；caroase-04 是 SEQ ID NO:06和caroase-05是SEQ ID NO:07)外,本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白可能導(dǎo)致caroase蛋白質(zhì)氨基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性可存在于給定的種群中。這類遺傳多態(tài)性可存在于來自不同群體或同一群體(由于天然等位突變)的細(xì)胞中。等位突變體也可包括功能等價(jià)物。[0060]根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段也可包括不編碼功能多肽的多核苷酸。這類多核苷酸可作為用于PCR反應(yīng)的探針或引物作用。
[0061]根據(jù)本發(fā)明的核酸無論它們是否編碼功能或非功能的多肽，均可用作雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有caroaseOl-05活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途包括，但不限于:(I)從cDNA文庫(例如來自除M.scorodonius之外的其他生物)分離編碼caroaseOl-05蛋白質(zhì)的基因或其等位變體；(2)與分裂中期染色體圖片原位雜交(例如FISH)，提供 caroase01-05 基因的精確染色體定位，如 Verma et al., Human Chromosomes:aManual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)所述；(3) Northern 印跡分析，檢測特定組織和/或細(xì)胞中caroaseOl-05mRNA的表達(dá),和(4)探針和引物,其可用作診斷工具來分析給定生物學(xué)(例如組織)樣品中核酸的存在，所述核酸能夠與caroase01-05探針雜交。
[0062]本發(fā)明還包括獲得caroaseOl-05基因功能等價(jià)物的方法。這類方法包括:獲得包括經(jīng)分離核酸的被標(biāo)記探針，所述核酸編碼根據(jù)SEQ ID NO:08-12任一序列的全部或部分或其任一的變體；用被標(biāo)記的探針在允許所述探針與文庫中核酸片段雜交的條件下篩選核酸片段文庫，從而形成核酸雙鏈體；和從任何標(biāo)記的雙鏈體中的核酸片段制備全長基因序列，獲得與caroase01-05基因相關(guān)的基因。
[0063]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的caroase01-05核酸與示出的核酸序列(分別是caroase-ΟΙ 為 SEQ ID NO:01 或 02 ;caroase_02 為 SEQ ID NO:03 或 04 ;caroase_03 為 SEQID NO:5 ;caroase-04 為 SEQ ID NO:06 和 caroase-05 為 SEQ ID NO:07)或其任一的補(bǔ)體為至少 55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源。
[0064]在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的caroase01-05多肽與SEQ ID NO:08_12任一分別所示的氨基酸序列為至少 55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源或更同源。
[0065]多核苷酸
[0066]本發(fā)明提供編碼漂白酶(過氧化物酶)的多核苷酸，所述漂白酶暫時(shí)被稱作caroaseOl-05，其具有SEQ ID NO:08-12的氨基酸序列或其任一的功能等價(jià)物。編碼caroase01-05的基因的序列通過擴(kuò)增得自Marasmius scorodonius的cDNA獲得。具有分別編碼caroase-01和caroase-02的SEQ ID NO:02和SEQ ID NO:04的序列是被挑出來的基因的最優(yōu)化版本，其中已發(fā)生密碼子最優(yōu)化。密碼子最優(yōu)化可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法使用，并特別適用于促進(jìn)基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明提供包含caroaseOl-05過氧化物酶編碼基因的多核苷酸序列。因此，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:01-07的核苷酸序列或其任一的功能等價(jià)物。Marasmius scorodonius中SEQ ID NO:01-07具有漂白活性的發(fā)現(xiàn)非常驚人，特別是由于該序列與已知的漂白酶具有非常低的同源性。
[0067]更具體地，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的多核苷酸，其可在嚴(yán)格條件下(優(yōu)選地在高嚴(yán)格度條件下)與SEQ ID NO:01-07的多核苷酸雜交。有利地，這類多核苷酸可得自真菌，優(yōu)選地得自絲狀真菌，特別是得自Marasmius scorodonius。更具體地,本發(fā)明涉及具有SEQ IDNO:01-07核苷酸序列的經(jīng)分離的多核苷酸。[0068]此處和下文中使用術(shù)語“基因”和“重組基因”是指可從染色體DNA中分離的核酸分子，其包括編碼蛋白質(zhì)(例如M.scorodonius漂白酶)的開放讀碼框?；蚩砂ň幋a序列、非編碼序列、內(nèi)含子和調(diào)節(jié)序列。此外，基因是指本文定義的經(jīng)分離的核酸分子。
[0069]本發(fā)明的核酸分子(如具有SEQ ID NO:01-07核苷酸序列或其功能等價(jià)物的核酸分子)可使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息被分離。例如。使用SEQ ID NO:01-07核酸序列的全部或部分作為雜交探針，可使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如如 Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T.Molecular Cloning:A LaboratoryManual.2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY1989中所述)分離本發(fā)明的核酸分子。
[0070]另外，可使用合成的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分離包括SEQ IDNO:01-07全部或部分的核酸分子，所述引物根據(jù)SEQ ID NO:01-07中包含的序列信息被設(shè)計(jì)。
[0071]可使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，使用適當(dāng)?shù)囊锔鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。這樣擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)適當(dāng)?shù)妮d體并通過DNA序列分析表征。
[0072]另外，對應(yīng)于本發(fā)明核苷酸序列或與之雜交的寡核苷酸可通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)(例如使用自動(dòng)DNA合成儀)制備。
[0073]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)分離核酸分子包含SEQ ID NO:01_07中顯示的核苷酸序列。該DNA包含分別編碼根據(jù)SEQ ID NO:08-12的M.scorodonius caroase01-05多肽的序列。
[0074]在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)分離核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是SEQ ID NO:01-07所示核酸序列的補(bǔ)體或這些核苷酸序列的功能等價(jià)物。
[0075]與另一核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是與另一核苷酸序列充分互補(bǔ)使得其能夠與另一核苷酸序列雜交形成穩(wěn)定雙鏈體的核酸分子。
[0076]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及經(jīng)分離的核酸分子(其編碼本發(fā)明的多肽或其功能等價(jià)物，如生物活性片段或結(jié)構(gòu)域)以及足夠用作用于鑒定編碼本發(fā)明多肽的核酸分子的雜交探針的核酸分子，和這類核酸分子的片段，所述片段適合用作PCR引物用于擴(kuò)增或突變核酸分子。
[0077]“經(jīng)分離的多核苷酸”或“經(jīng)分離的核酸”是與兩個(gè)編碼序列均不緊鄰的DNA或RNA,而在所述DNA或RNA來源的生物的天然存在基因組中，所述編碼序列與所述DNA或RNA緊鄰(一個(gè)位于5’端，一個(gè)位于3’端)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸包括與編碼序列緊鄰的一些或所有5’非編碼(例如啟動(dòng)子)序列。該術(shù)語因此包括例如被整合進(jìn)載體中、自主復(fù)制質(zhì)粒或病毒中、或原核生物或真核生物基因組DNA中、或作為不依賴于其他序列的獨(dú)立分子(例如通過PCR產(chǎn)生的或經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶處理的cDNA或基因組DNA)存在的重組DNA。其還包括是雜合基因部分的重組DNA，所述雜合基因編碼額外的多肽，所述多肽基本不含細(xì)胞材料、病毒材料、或培養(yǎng)基(當(dāng)通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí))、或化學(xué)前體或其他化學(xué)品(當(dāng)化學(xué)合成時(shí))。另外，“經(jīng)分離的核酸片段”是天然不作為片段存在的和在天然狀態(tài)下不會(huì)發(fā)現(xiàn)的核酸片段。
[0078]本文使用術(shù)語“多核苷酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA。核酸可以使用寡核苷酸類似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸)合成。這類寡核苷酸可用于例如制備核酸，所述核酸具有改變的堿基配對能力或提高的核酸酶抗性。
[0079]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了經(jīng)分離的核酸分子,所述核酸分子對caroase01-05核酸分子(例如caroase01-05核酸分子各自的編碼鏈)是反義的。本文所述核酸分子的互補(bǔ)鏈也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0080]序列錯(cuò)誤
[0081]本文提供的序列信息不應(yīng)當(dāng)狹義地理解為要求包括錯(cuò)誤鑒定的堿基。本文公開的特定序列可容易地用于從真菌(特別是M.scorodonius)中分離完整基因，所述完整基因隨后可容易地被進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析，從而鑒定序列錯(cuò)誤。
[0082]除非另有說明，本文通過測序DNA分子測定的所有核苷酸序列都使用自動(dòng)DNA測序儀測定，本文測定的由DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都通過將如上測定的DNA序列翻譯來預(yù)測。因此，如本領(lǐng)域針對通過該自動(dòng)化途徑測定的任何DNA序列所已知的，本文測定的任何核苷酸序列可含有一些錯(cuò)誤。通過自動(dòng)化測定的核苷酸序列與所測序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列典型地 至少約90%相同，更典型地至少約95%到至少約99.9%相同?？赏ㄟ^其他途徑(包括本領(lǐng)域公知的手動(dòng)DNA測序法)更精確地測定實(shí)際地序列。如本領(lǐng)域還已知的，被測定的核苷酸序列中與實(shí)際序列相比的單個(gè)插入或缺失會(huì)在核苷酸序列翻譯中引起讀碼框位移，從而從該插入或缺失開始，由所測定的核苷酸序列編碼的預(yù)測氨基酸序列會(huì)與所測序DNA分子編碼的實(shí)際氨基酸序列完全不同。
[0083]本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定這類錯(cuò)誤鑒定的堿基并知道如何改正這類錯(cuò)誤。
[0084]核酸片段、探針和引物
[0085]根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可僅包含SEQ ID NO:01~07中所不核酸序列的部分或片段，例如可用作探針或引物的片段，或編碼caroaseOl-05蛋白質(zhì)部分的片段。從克隆caroase01-05基因和cDNA測定的核苷酸序列允許產(chǎn)生探針和引物，所述探針和引物被設(shè)計(jì)為用于鑒定和/或克隆其他caroase01-05家族成員，以及來自其他物種的caroase01_05同源物。探針/引物典型地包含基本上純凈的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含核苷酸序列的區(qū)域，所述區(qū)域在高嚴(yán)格度條件下優(yōu)選地與SEQ ID NO:01-07中所示核苷酸序列或其任一的功能等價(jià)物的至少約12或15個(gè)，優(yōu)選地約18或20個(gè)，優(yōu)選地約22或25個(gè)，更優(yōu)選地約30、35、40、45、50、55、60、65或75個(gè)或更多的連續(xù)核苷酸雜交。
[0086]基于caroaseO 1-05核苷酸序列的探針可被用于檢測例如在其他生物中編碼相同或同源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物或基因組caroase01-05序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針還包含與其結(jié)合的標(biāo)簽基團(tuán)，例如所述標(biāo)簽基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔助因子。這類探針也可被用作診斷測試試劑盒的部分，用于鑒定表達(dá)caroaseOl-05蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
[0087]同一性&同源性
[0088]術(shù)語“同源性”或“同一性百分比”在本文可互換使用。就本發(fā)明的目的而言，其在本文定義為為了測定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的同一性百分比，就最佳比較的目的將序列進(jìn)行比對(例如可向第一氨基酸或核酸序列中引入缺口用于與第二氨基酸或核酸序列最佳比對)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置是相同的。兩個(gè)序列之間的同一性百分比是兩序列分享的相同位置數(shù)的函數(shù)(即同一性％=相同位置/位置總數(shù)(即重疊位置)xlOO)。優(yōu)選地，兩個(gè)序列長度相同。
[0089]技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道下述事實(shí):可獲得若干種不同的計(jì)算機(jī)程序來測定兩個(gè)序列之間的同源性。例如，可通過使用數(shù)學(xué)算法完成兩個(gè)序列之間序列比較和同一性百分比的測定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用 Needleman and Wunsch (J.Mo1.Biol.(48):444-453 (1970))算法，使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重來測定兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性百分比，所述算法已被整合進(jìn)GCG軟件包(可得自 http://www.accelrys.com/ so Iut ions/bio informat ician/)的 GAP 程序中。技術(shù)人員會(huì)理解所有這些不同的參數(shù)會(huì)產(chǎn)生稍微不同的結(jié)果，但是使用不同的算法時(shí)兩個(gè)序列之間的總體同一性百分比不會(huì)顯著改變。
[0090]還在另一實(shí)施方案中，用GCG軟件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的缺口權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重測定兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性百分比。在另一實(shí)施方案中，用 E.Meyers and W.Miller (CAB10S，4:11-17(1989)的算法，使用PAM120重量殘基表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個(gè)氨基酸或核苷酸序列之間的同一性百分比，所述算法已被整合進(jìn)ALIGN程序(2.0版)中(可得自:http://vega.1gh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)。
[0091 ] 本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可進(jìn)一步被用作“查詢序列”針對公開數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，來例如鑒定其他的家族成員或相關(guān)序列。這類搜索可使用例如Altschul, et al.(1990)J.Mo1.Biol.215 =403-10 的 NBLAST 和 XBLAST 程序(2.0 版)進(jìn)行。BLAST 核苷酸搜索可用NBLAST程序進(jìn)行(分值=100，字長=12)來獲得與本發(fā)明caroase01-05核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST 蛋白質(zhì)搜索可用XBLAST程序進(jìn)行(分值=50，字長=3)來獲得與本發(fā)明caroaseOl-05蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了就比較的目的獲得有缺口的比對，可使用如 Altschul et al.，(1997) Nucleic Acids Res.25 (17):3389-3402 中所述的 GappedBLAST。使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。參閱http:// www.ncb1.nlm.nih.gov/。
[0092]雜交
[0093]本文使用術(shù)語“雜交”旨在描述用于雜交和洗滌的條件，在所述條件下彼此至少約55%,至少約40%,至少約70%,更優(yōu)選地至少約80%,進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約85%到90%，更優(yōu)選地至少95%同源的核苷酸序列典型地保持與彼此雜交。
[0094]這類雜交條件的優(yōu)選的、非限制性實(shí)例是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45°C下雜交，然后在IX SSC, 0.1% SDS中50°C下(優(yōu)選地在55°C下，優(yōu)選地在60°C下，進(jìn)一步更優(yōu)選地在65°C下)洗滌一次或多次。
[0095]高嚴(yán)格度條件包括例如在68°C下5x SSC/5x Denhardfs溶液/1.0% SDS中雜交和在0.2x SSC/0.1% SDS中室溫下洗滌?；蛘呦礈炜稍?2°C進(jìn)行。
[0096]技術(shù)人員會(huì)知道應(yīng)用于嚴(yán)格和高嚴(yán)格度雜交條件的條件。涉及這類條件的額外指導(dǎo)在本領(lǐng)域是容易獲得的，例如見Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.；and Ausubel et al.(eds.), 1995,Current Protocols in Molecular Biology, (John ffiley&Sons, N.Y.)。[0097]當(dāng)然，僅與Poly A序列(例如mRNA的3’端Poly⑷尾)或T (或U)殘基的互補(bǔ)串雜交的多核苷酸不包括在用于與本發(fā)明核酸的一部分特異雜交的多核苷酸中，因?yàn)檫@類多核苷酸會(huì)與含有Poly (A)串或其補(bǔ)體的任何核酸分子(例如實(shí)際上任何雙鏈的cDNA克隆)雜交。
[0098]從其他生物獲得全長DNA
[0099]在典型的途徑中，可篩選從其他生物(例如絲狀真菌，特別是來自于Marasmius種)構(gòu)建的cDNA文庫。
[0100]例如,可通過Northern印跡分析篩選Marasmius菌株中同源的caroase01_05多核苷酸。通過檢測與本發(fā)明多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄物，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從分離自適當(dāng)菌株的RNA構(gòu)建cDNA文庫?；蛘呖墒褂媚軌蚺c本發(fā)明caroaseOl-05多核苷酸雜交的探針篩選全基因組DNA文庫。
[0101]可例如通過進(jìn)行PCR(其使用以本文所述核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的兩個(gè)簡并寡核苷酸引物池)分離同源的基因序列。
[0102]反應(yīng)模板可以是通過反轉(zhuǎn)錄mRNA獲得的cDNA,所述mRNA從已知能表達(dá)或被預(yù)測能表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的菌株中制備。PCR產(chǎn)物可以被亞克隆并測序，以確保擴(kuò)增的序列代表了新的caroase01-05核酸序列或其功能等價(jià)物的序列。
[0103]可使用PCR片段通過多種已知方法分離全長cDNA克隆。例如，被擴(kuò)增的片段可以被標(biāo)記并用于篩選噬菌體或粘粒 cDNA文庫。或者被標(biāo)記的片段可被用于篩選基因組文庫。
[0104]也可使用PCR技術(shù)從其他生物分離全長cDNA序列。例如可按照標(biāo)準(zhǔn)方法從適當(dāng)?shù)募?xì)胞或組織來源分離RNA?？墒褂霉押塑账嵋飳NA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用于起始第一鏈合成，所述寡核苷酸引物對被擴(kuò)增片段的5’端是特異的。
[0105]然后可使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)對得到的RNA/DNA雜交體“加尾)”(例如用鳥嘌呤)，所述雜交體可以用Rnase H消化，然后開始第二鏈合成(例如用Poly-C引物)。因此，可容易地分離被擴(kuò)增片段上游的cDNA序列。關(guān)于有用的克隆策略的總數(shù)，參閱例如Sambrook et al.,上文；和 Ausubel et al.,上文。
[0106]載體
[0107]本發(fā)明的另一方面涉及載體，優(yōu)選地涉及表達(dá)載體，所述載體含有編碼caroase01-05蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)物的核酸。本文使用術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)其所連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！保涫侵腑h(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其中可連接額外的DNA區(qū)段。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可被連接進(jìn)病毒基因組中。某些載體能夠在其被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加體哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(例如非附加體哺乳動(dòng)物載體)通過引入宿主細(xì)胞被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起被復(fù)制。另外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們可操作連接的基因的表達(dá)。這類載體在本文中稱作“表達(dá)載體”。通常，重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體常常是質(zhì)粒的形式。術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”在本文可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體最常應(yīng)用的形式。然而，本發(fā)明旨在包括具有等價(jià)功能的其它形式的表達(dá)載體，如病毒載體(例如復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
[0108]本發(fā)明的重組表達(dá)載體以適合核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式包含本發(fā)明的核酸，這意味著重組表達(dá)載體包括以要用于表達(dá)的宿主細(xì)胞為基礎(chǔ)所選擇的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列與待表達(dá)的核酸序列可操作地連接。在重組表達(dá)載體中“可操作地連接”旨在表示感興趣的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許核苷酸序列表達(dá)的方式連接(例如當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系中或在宿主細(xì)胞中)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)調(diào)控元件(例如多腺苷酸化信號(hào))。這類調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel ；Gene Expression Technology:Methods in Enzymologyl85, Academic Press,San Diego, CA(1990)。調(diào)節(jié)序列包括在許多類型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達(dá)的序列，和僅在某一宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的序列(例如組織特異調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于如下因素:待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可被引入宿主細(xì)胞中，從而生產(chǎn)由本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽(例如caroase01-05蛋白質(zhì)，caroase01-05蛋白質(zhì)的突變體形式，其片段、變體或功能等價(jià)物，融合蛋白等)。
[0109]本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以被設(shè)計(jì)為用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)caroase01-05蛋白質(zhì)。例如，caroase01_05蛋白質(zhì)可以在真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞如E.col1、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞在Goeddel, Gene Expression Technology:Methods in Enzymologyl85, Academic Press, SanDiego, CA(1990)中進(jìn)一步被討論。或者重組表達(dá)載體可以被體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如使用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。
[0110]本發(fā)明中有用的表達(dá)載體包括來自染色體、附加體和病毒的載體,例如來自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如桿狀病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)的載體和來自其組合的載體(如來自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體，如粘粒和噬菌粒)。
[0111] DNA插入物可與合適的啟動(dòng)子(如卩遼菌體λ PL啟動(dòng)子，E.coli lac、trp和tac啟動(dòng)子，SV40早期和晚期啟動(dòng)子和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子，僅列出一些)可操作地連接。其他合適的啟動(dòng)子應(yīng)是技術(shù)人員已知的。在特定的實(shí)施方案中，優(yōu)選使用能夠在原核生物或絲狀真菌中指導(dǎo)過氧化物酶高表達(dá)水平的啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的。表達(dá)構(gòu)建體可含有用于轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點(diǎn)和(在被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中)用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼部分應(yīng)包含位于待翻譯多肽起點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄起始AUG和適當(dāng)?shù)匚挥谀┒说慕K止密碼子。
[0112]載體DNA可通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)被引入原核或真核細(xì)胞中。本文使用術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”旨在表示用于將外源核酸(例如DNA)引入宿主細(xì)胞的多種本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、侵染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可見于Sambix)0k，etal.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., BasicMethods in Molecular Biology (1986)和其他實(shí)驗(yàn)室手冊。
[0113]對穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言，已知取決于所使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，只有一小部分細(xì)胞可以將外源DNA整合進(jìn)它們的基因組中。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標(biāo)記(例如抗生素抗性)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括賦予藥物(如G418、潮霉素和甲氨喋呤(methatrexate))抗性的標(biāo)記。編碼可選擇標(biāo)記的核酸可在編碼caroaseOl-05蛋白質(zhì)的相同載體上被引入宿主細(xì)胞，或可在單獨(dú)的載體上被引入?？赏ㄟ^藥物選擇來鑒定被引入的核酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如引入了可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞會(huì)存活，而其他細(xì)胞會(huì)死亡)。
[0114]原核生物中蛋白質(zhì)的表達(dá)通常在E.coli中使用含有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體完成，所述啟動(dòng)子指導(dǎo)融合或非融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。融合載體對其中被編碼的蛋白質(zhì)添加大量氨基酸(例如添加至重組蛋白質(zhì)的氨基端)。這類融合載體典型地為三個(gè)目的服務(wù):I)提高重組蛋白質(zhì)的表達(dá)；2)提高重組蛋白質(zhì)的溶解度；和3)通過在親和純化中作為配體來幫助重組蛋白質(zhì)的純化。通常在融合表達(dá)載體中，在融合部分的接點(diǎn)和重組蛋白中引入蛋白水解切割位點(diǎn)，使得能夠從融合部分分離重組蛋白，隨后純化融合蛋白。這類酶及其同源的識(shí)別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。
[0115]如所指出的，表達(dá)載體應(yīng)優(yōu)選地含有可選擇標(biāo)記。這類標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，和用于在E.coli和其他細(xì)菌中培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。適當(dāng)宿主的代表性實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞如E.col1、Streptomyces和Salmonellatyphimurium ;真菌細(xì)胞如酵母；昆蟲細(xì)胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9 ;動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS和Bowes黑色素瘤；和植物細(xì)胞。用于上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。
[0116]載體中，優(yōu)選在細(xì)菌中使用的是可得自Qiagen的pQE70、pQE60和PQE-9;可得自 Stratagene 的 pBS 載體、Phagescript 載體、Bluescript 載體、pNH8A、pNH16A、pNH18A、PNH46A 和可得自 Pharmacia 的 ptrc99a、pKK223_3、ρΚΚ233_3、pDR540、pRIT5。載體中優(yōu)選的真核載體是可得自Stratagene的PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZTl和pSG ;和可得自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易地知道其他合適的載體。
[0117]在已知的細(xì) 菌啟動(dòng)子中，用于本發(fā)明的包括E.coli Iacl和IacZ啟動(dòng)子，T3和T7啟動(dòng)子，gpt啟動(dòng)子，lambdaPR, PL啟動(dòng)子和trp啟動(dòng)子，HSV胸苷激酶啟動(dòng)子，早期和晚期SV40啟動(dòng)子，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子如Rous肉瘤病毒("RSV")的啟動(dòng)子和金屬硫蛋白啟動(dòng)子如小鼠金屬硫蛋白-1啟動(dòng)子。
[0118]可通過向載體中插入增強(qiáng)子序列提高高等真核生物對編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約從10到300bp，其作用于提高啟動(dòng)子在給定宿主細(xì)胞類型中的轉(zhuǎn)錄活性。增強(qiáng)子的實(shí)例包括SV40增強(qiáng)子(其位于復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)bplOO到270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的多瘤增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。
[0119]為了將經(jīng)翻譯的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中、壁膜間隙中或細(xì)胞外環(huán)境中，可將適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)整合進(jìn)表達(dá)的多肽中。該信號(hào)對多肽可以是內(nèi)源的，或它們可以是異源信號(hào)。
[0120]可以以修飾的形式(如融合蛋白)表達(dá)多肽，并可不僅包括分泌信號(hào)，還包括額外的異源功能區(qū)。因此例如可向多肽N端添加額外的氨基酸(特別是帶電氨基酸)區(qū)以促進(jìn)純化時(shí)或隨后的操作和儲(chǔ)存時(shí)在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和持久性。還可向多肽添加肽殘基以便于純化。
[0121]宿主細(xì)胞
[0122]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)提供了一種細(xì)胞，所述細(xì)胞為例如含有本發(fā)明核酸的經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或重組宿主細(xì)胞?！敖?jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞”或“重組細(xì)胞”是通過重組DNA技術(shù)將本發(fā)明核酸引入其中(或引入其祖先中)的細(xì)胞。原核和真核細(xì)胞例如細(xì)菌、真菌、酵母等均被包括。
[0123]合適宿主細(xì)胞的實(shí)例為Microcystis, Lepista例如L.1rina, Cyathus例如C.pallidus, Ganoderma 例如 G.applanatum, Ischnoderma 例如 1.Benzoinum, Marasmius例如 M.scorodonius, Trametes 例如 T.versicolor 的 T.suaveolens, Cryptococcus 例如C.1aurentii, Hypomyces 例如 H.0doratus 或 Phaffia 例如 P.rhodozyma, Phanerochaete 例如 P.chrysosporium, Lentinula 例如 L.edodes, Coprinus 例如 C.cinereus,Gloeophyllum例如 G.trabeum, Ophiostoma 例如 0.piliferum, Aspergillus 例如 A.niger> A.0ryzae>A.nidulans, Thermomyces 例如 T.lanuginosa, Sporotrichum 例如 S.thermophile,Aureobasidium 例如 A.pullulans, Amorphotheca 例如 A.resinae, Leucosporidium 例如L.scottii, Cunninghamella 例如 C.elegans。
[0124]特別優(yōu)選的是來自絲狀真菌，特別是Aspergillus (例如Aspergillus oryzae或Aspergillus niger)和 Marasmius (例如 Marasmius scorodonius)的細(xì)胞，或來自酵母如Pichia(例如Pichia Pastoris)的細(xì)胞，或來自細(xì)菌的細(xì)胞。
[0125]可選擇下述宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)被插入序列的表達(dá)，或以特異的、所期望的方式修飾和加工基因產(chǎn)物。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這類修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)揮最佳功能。
[0126]多種宿主細(xì)胞具有用于蛋白質(zhì)和基因廣物翻譯后加工和修飾的特征性和特異的機(jī)制。分子生物學(xué)和/或微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的適當(dāng)細(xì)胞系或宿主體系可以被選擇，以確保所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的所期望的和正確的修飾和加工。為此，可使用具有下述細(xì)胞機(jī)制(cellular machinery)的真核宿主細(xì)胞,所述細(xì)胞機(jī)制用于適當(dāng)?shù)丶庸ぴ嫁D(zhuǎn)錄物、糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物。這類宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的。
[0127]宿主細(xì)胞還包括，但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CH0、VER0、BHK、HeLa、C0S、MDCK、293、3T3、WI38和脈絡(luò)從細(xì)胞系。如果需要，根據(jù)本發(fā)明的多肽可通過被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系生產(chǎn)。公眾可獲得大量適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體，用于構(gòu)建這類細(xì)胞系的方法也是公眾已知的，例如在Ausubel et al.(上文)中。
[0128]根據(jù)本發(fā)明的多肽在工業(yè)方法中的用途
[0129]本發(fā)明的另一方面包括本發(fā)明的多肽或其功能等價(jià)物(下文稱作漂白酶)在工業(yè)方法中的用途，例如用作去污劑、酶石洗滌方法或食物(例如烘焙產(chǎn)品或乳制品)生產(chǎn)。
[0130]本發(fā)明的多肽可被作為酶制劑使用，或由能夠生產(chǎn)所述酶的微生物原位生產(chǎn)。酶制劑可來自多種來源，例如來自植物、動(dòng)物和微生物。優(yōu)選地，所述酶制劑來自微生物，因?yàn)槲⑸镌试S以受控的方式以工業(yè)規(guī)模獲得所述酶?？赏ㄟ^選定的細(xì)菌菌株的經(jīng)典發(fā)酵過程，或通過發(fā)酵過表達(dá)本發(fā)明多肽的微生物獲得來自微生物的酶制劑。所述微生物可以是細(xì)菌、真菌或酵母。用作非經(jīng)典發(fā)酵中宿主細(xì)胞的合適微生物的實(shí)例參見上面對宿主細(xì)胞的討論。
[0131]酶制劑也可包含其他合適的酶,如例如氧化還原酶、淀粉酶、脂肪分解酶、水解酶。已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)氧化還原酶(例如已糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、麥芽糖氧化酶或葡萄糖氧化酶)的組合特別地對本發(fā)明漂白酶的酶活性具有協(xié)同效應(yīng)。氧化還原酶可得自不同的來源，包括微生物。優(yōu)選地使用來自真菌來源的氧化還原酶，例如來自絲狀真菌。合適的氧化還原酶是可得自例如Aspergillus種(如Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶。本發(fā)明因此還涉及本發(fā)明多肽與氧化還原酶的新穎酶組合。
[0132]如果應(yīng)用中存在氧化還原酶對其有活性的底物，則使用本發(fā)明的酶制劑的應(yīng)用中該效應(yīng)被進(jìn)一步增強(qiáng)。如果所述底物不存在，則其也可以被添加至方法中。這類底物的實(shí)例是在使用已糖氧化酶或葡萄糖氧化酶時(shí)添加葡萄糖。本發(fā)明因此也涉及新穎的組合物，所述組合物包含酶制劑(其含有本發(fā)明多肽的)和氧化還原酶以及所述氧化還原酶的底物。
[0133]本發(fā)明還涉及新穎的酶組合和新穎的組合物在下文所述的本發(fā)明食品生產(chǎn)方法中的用途。
[0134]令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的多肽或其功能等價(jià)物可被用于提高食品的至少一部分的白度。優(yōu)選地，本發(fā)明的漂白多肽被用于以下的食物生產(chǎn)方法中。用于生產(chǎn)食品的方法(其中所述食品的中間體形式包含色素)包括以下述用量添加至少一種本發(fā)明的多肽，與其生產(chǎn)中未添加所述酶的食品比，所述用量有效提高了食品的至少一部分的白度。
[0135]食品的中間體形式在本文被定義為生產(chǎn)過程中獲得食品最終形式之前產(chǎn)生的任何形式。中間體形式可包含所使用的個(gè)體原料和/或其混合物和/或與添加劑和/或操作助劑的混合物，或其隨后被加工的形式。
[0136]本發(fā)明的多肽以有效用量被添加。技術(shù)人員可通過改變酶劑量并測量色素降解和/或最終食品的白度提高而容易地確定該有效用量。如果所述酶能夠轉(zhuǎn)化β_胡蘿卜素，則酶的有效用量可以按照β -降解單位來表達(dá)(例如Aziz或Zorn單位，參閱“材料和方法”) [0137]可以從至少一種原料制造食品，所述原料為植物來源，如小麥面粉。后者已知含有色素如類胡蘿卜素(胡蘿卜素和葉黃素)和黃酮，它們導(dǎo)致烘焙出的面包的碎屑顏色?；蛘?，這些色素可來自除植物原料以外的其他來源，例如來自乳。類胡蘿卜素的實(shí)例是帶有胡蘿卜素主鏈的其他物質(zhì)，特別是帶有β_胡蘿卜素或辣椒紅素主鏈，更特別地是d-和β-胡蘿卜素、葉黃質(zhì)、番茄紅素、百合黃素、辣椒紅素、玉米黃素、堇黃素(violaxanthin)、蟲下青素、角黃素(canthaxanthin)、黃黃素(Iuteoxanthin)、新黃素和各自的脫-類胡蘿卜素。
[0138]本發(fā)明方法的優(yōu)選食品是從小麥面粉和/或來自其他谷物來源面粉烘焙的面包和其他烘焙產(chǎn)品。例如，對于烘焙的食品面包而言，中間體形式包括例如小麥面粉，其與其他面包成分如水、鹽、酵母和面包改良組合物的原始混合物，混合的生面團(tuán)，揉過的生面團(tuán)，發(fā)酵的生面團(tuán)和部分烘焙的生面團(tuán)。如果酶能夠轉(zhuǎn)化β_胡蘿卜素，則將酶以下述用量加入小麥面粉和/或來自其他谷物來源的面粉或加入與其他面包成分的任何原始混合物中，所述用量給予每千克面粉I和5000之間Zorn單位，優(yōu)選地每千克面粉5和1000之間Zorn單位，更優(yōu)選地每千克面粉10和500之間Zorn單位，最優(yōu)選地每千克面粉25和250之間Zorn單位。所述酶也可以與面包改良混合物一起或作為其中的部分被添加，所述混合物是與其他生面團(tuán)和/或本領(lǐng)域已知的面包改良操作助劑的混合物，所述面包改良操作助劑例如是本領(lǐng)域已知的一種或多種酶，例如淀粉酶如d-淀粉酶、β -淀粉酶、淀粉葡萄糖酶、防腐麥芽糖d-淀粉酶，脂肪分解酶如脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂肪酶，氧化酶如葡萄糖氧化酶、已糖氧化酶、漆酶、吡喃糖氧化酶、碳水化合物氧化酶，半纖維素酶如木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶，纖維素分解酶如內(nèi)葡聚糖酶(如纖維素酶)、纖維二糖水解酶，蛋白酶和/或本領(lǐng)域已知的化學(xué)操作助劑如還原和氧化劑(例如脫落酸、谷胱甘肽)、乳化劑Uf^BDATEM)
坐坐寸寸ο[0139]在一些類型的面條中，白色產(chǎn)物是人們所期望的。例如對面粉而言，中間體形式包括例如小麥面粉，其與水、鹽和其他面條成分的原始混合物，混合的生面團(tuán)和最終面條產(chǎn)物，所述最終面條產(chǎn)物可以是新鮮的、干的、煮好的、蒸好的和/或油炸的。
[0140]食品也可以是乳制品。乳制品是指以干燥固體計(jì)含有至少10wt%，優(yōu)選地至少30wt%,更優(yōu)選地至少50wt%,進(jìn)一步更優(yōu)選地至少70wt%或最優(yōu)選至少80wt%的來源于乳的成分，優(yōu)選牛乳。來源于乳的成分為例如脂肪、蛋白質(zhì)例如乳清干酪凝乳和酪蛋白等。乳(特別是牛乳)可天然地含有有色化合物，如類胡蘿卜素，例如β胡蘿卜素。
[0141]白度對例如乳酪、黃油、乳粉或乳清產(chǎn)物具有重要的作用。例如對于乳酪如Feta、Mozzarella、Ricotta 和藍(lán)乳酪(例如 Danish Blue、Roquefort 或 Gorgonzola)而言，白度被認(rèn)為是所期望的。在山羊或綿羊乳至少部分地被牛乳取代的乳酪中，乳酪的白度會(huì)成為問題，因?yàn)榕Ｈ橹写嬖讦?-胡蘿卜素。
[0142]對于一些乳酪而言，天然有色劑如胭脂樹紅或β_胡蘿卜素被用作食物著色劑。然而，該著色劑也會(huì)存在于乳清中。當(dāng)乳清被進(jìn)一步加工為例如嬰兒配方時(shí)，乳清產(chǎn)品的顏色是不期望的。對于食品軟乳酪而言，中間體產(chǎn)物包括例如乳和乳酪凝乳。 [0143]可通過視覺或通過例如掃描的反射測定法來完成產(chǎn)物白度的測量。在反射測定法中，顏色用三個(gè)參數(shù)來定量:L-因子(黑=0到白=100)、a-因子(綠=-60到紅=+60)和b-因子(藍(lán)=-60到黃=+60)。如果是類胡蘿卜素，則所生產(chǎn)的產(chǎn)物的b-因子優(yōu)選地盡可能接近0，優(yōu)選地在10和O之間，更優(yōu)選地在5和O之間，進(jìn)一步更優(yōu)選地低于1，最優(yōu)選地低于0.5。另一方面，本發(fā)明提供可通過前文所述的本發(fā)明方法獲得的食品。這些食品特征在于與通過下述生產(chǎn)方法獲得的食品相比至少部分具有顯著提高的白度，所述方法不包括添加一種或多種能夠轉(zhuǎn)化中間體產(chǎn)物中色素的酶。
[0144]另一方面，本發(fā)明提供能夠轉(zhuǎn)化色素的酶用于漂白食品(例如基于面粉或來自乳的產(chǎn)物)的用途。令人驚奇的是發(fā)現(xiàn)這些酶可有利地用作家居去污劑中的污潰去除劑。特別地，所述酶被證明對去除棉和合成(例如聚酯)織物上的有色污潰(例如草潰、咖啡和茶潰)非常有效。另外，所述酶還可用于酶石漂白方法中，例如將藍(lán)色牛仔的錠藍(lán)染料漂白至所期望的水平。
[0145]材料和方法
[0146]測量β -胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化
[0147]根據(jù)Aziz測量β -胡蘿卜素降解
[0148]可根據(jù)A.Ben Aziz (1971)，PhytochemistrylO, 1445 將酶活性測定為 β -胡蘿卜素轉(zhuǎn)化活性。一個(gè)酶單位定義為每分鐘轉(zhuǎn)化I微克β -胡蘿卜素的酶量(也稱作Aziz單位)。
[0149]根據(jù)Zorn測量β -胡蘿卜素降解
[0150]也可根據(jù)Zorn et al (2003)，Appl.Microbiol.Biotechnol.62:331-336 將酶活性測定為β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化活性。一個(gè)酶單位定義為每分鐘轉(zhuǎn)化I微摩爾β-胡蘿卜素的酶量(也稱作Zorn單位)。如下進(jìn)行測定:將1.5ml含酶樣品在樣品池中27°C下預(yù)孵育5分鐘，然后加入100 μ I β -胡蘿卜素儲(chǔ)存溶液(參閱下文)。必要時(shí)，用檸檬酸/磷酸鹽緩沖液ρΗ5.5 (該緩沖液通過將43ml0.1M檸檬酸與56ml0.2M Na2PO4溶液混合制備)稀釋濃縮的培養(yǎng)上清液。使用分光光度計(jì)在溫度受控的試池架(cell holder)中在450nm和27°C下監(jiān)控吸光度在15分鐘內(nèi)的降低。檢查曲線的線性，用曲線的線性部分根據(jù)以下等式計(jì)算酶活性:
[0151]酶活性[mU/ml]= (ΔΕχ Vt)xl06/ (Vsx d x ε )
[0152]其中U =上文定義的酶活性；ΔΕ = 450nm下每分鐘吸光度的降低；Vt =樣品池中的總體積(ml) ；Vs =樣品池中的樣品體積(ml) ; ε = β -胡蘿卜素的消光系數(shù)，其為95，OOOM-1CnT1 ；d =樣品池厚度(cm)]
[0153]可以通過將Aziz單位除以β-胡蘿卜素的分子量(=536.85)將Aziz酶單位轉(zhuǎn)化為Zorn單位。
[0154]制備β -胡蘿卜素儲(chǔ)存溶液
[0155]如下制備β -胡蘿卜素儲(chǔ)存溶液:將5mg@ -胡蘿卜素和500mg Tween-80溶解于50ml 二氯甲烷中。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在40°C和SOOmbar下將二氯甲烷蒸發(fā)。當(dāng)幾乎所有二氯甲烷被蒸發(fā)時(shí)，加入30ml水，殘余的二氯甲烷在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中、最后在氮?dú)饬髦信懦?。過濾得到的溶液并用水在有刻度的燒瓶中補(bǔ)充至50ml。溶液在冷藏(冰箱)中保存，僅穩(wěn)定
若干天。
[0156]漂白食品
[0157]如Gelinas, Cereal Chem.75,810-184(1998)所述從碎屑或生面團(tuán)中抽提類胡蘿卜素后測定漂白。如Gelinas(1998)所述通過從面包屑中抽提總脂質(zhì)測定類胡蘿卜素。
[0158]食品白度可通過視覺測定或通過反射測定法測定。視覺檢查可通過將添加了漂白酶的食品與未添加漂白酶的對照比較來進(jìn)行。反射測定法可通過在彩色掃描儀(HewlettPackard ScanJet ADF)上掃描食品來進(jìn)行。這些數(shù)據(jù)可使用 LabSMART (LabSMART, LLC, LoganUtah, USA)程序分析。
[0159]實(shí)施例1
[0160] 得自Marasmius scorodonius的β -胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶的培養(yǎng)及活性測定
[0161]如Zorn et al.(2003)所述培養(yǎng)得自 Marasmius scorodonius 的 β _ 胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶caroase-Ι和caroase_2并測定其活性。為此，使用來自Marasmius scorodonius培養(yǎng)物的菌絲體(得自 Centraal Bureau voor Schimmelcultures-Utrecht,荷蘭，保藏號(hào)CBS137.83)接種補(bǔ)充有乳化的β_胡蘿卜素的瓊脂平板。將平板在24°C下孵育14天。用菌絲體接種含100mL標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)溶液(SNL，含有30g/升葡萄糖.Η20 ；4.5g/升天冬酰胺.Η20 ；
1.5g/升KH2PO4 ；0.5g/升MgSO4 ；3.0g/升酵母提取物；lml/升滅菌的微量元素溶液，其含有5mg/l CuS04*5aq、80mg/l FeCl3*6aq、90mg/l ZnS04*7aq、30mg/l MnS04*laq 和 40mg/l EDTA ；滅菌前用IN NaOH將pH調(diào)節(jié)至6.0)的300ml燒瓶，在150rpm的搖床中于24°C下孵育7天。檢查預(yù)培養(yǎng)物不含細(xì)菌污染物，通過Ultra Turrax勻化并用于接種主要培養(yǎng)物(500mlErlenmeyer燒瓶中250ml)。第二天起每天取出2ml樣品，離心去除菌絲體,在分光光度計(jì)測定法中測量活性。培養(yǎng)4天后，每升無細(xì)胞上清液的β_降解活性大約為0.3Zorn單位。
[0162]實(shí)施例2
[0163]H2O2 對得自 M.scorodonius 的 β -胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶 caroase-Ι 和 caroase-2 活性的影響
[0164]如上所述在體外β-胡蘿卜素降解試驗(yàn)中測定10微升20mM過氧化氫(H2O2)的影響。使用含有caroase-Ι和caroase-2的M.scorodonius濃縮培養(yǎng)上清液。存在H2O2時(shí)β-胡蘿卜素降解活性從4.3提高至10.9mU。使用熱滅活酶時(shí)，完全沒有觀察到β -胡蘿卜素降解。這清楚地說明H2O2刺激β -胡蘿卜素降解酶的β -胡蘿卜素降解活性。
[0165]實(shí)施例3
[0166]Aspergillus niger 葡萄糖氧化酶(GOX)對得自 M.scorodonius 的 caroase-Ι 和caroase-2活性的影響
[0167]將50微升濃縮的M.scorodonius培養(yǎng)上清液與1290微升50mM醋酸鈉緩沖液(pH5.5)混合。加入160微升500mM的葡萄糖溶液，將混合物在27°C調(diào)節(jié)5分鐘。Aspergillus niger葡萄糖氧化酶得自Fluka。通過添加0_2微升的葡萄糖氧化酶儲(chǔ)存液(100U/ml，對應(yīng)于0-200mU GOX的活性)和100微升β -胡蘿卜素溶液(如上文“材料和方法”中所述制備)起始反應(yīng)。在27°C下記錄10分鐘450nm處吸光度降低(表1)。
[0168]表1:在存在50mM葡萄糖和多種劑量GOX時(shí)使用濃縮的M.scorodonius培養(yǎng)上清液降解β_胡蘿卜素
[0169]
【權(quán)利要求】
1.一種經(jīng)分離的多肽，其具有漂白活性和選自以下的一種或多種特征: a.根據(jù)SEQID NO:08-12任一的經(jīng)分離的多肽或其任一的功能等價(jià)物； b.經(jīng)分離的多肽,其可通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞例如Aspergillusniger中表達(dá)下述物質(zhì)獲得:根據(jù)SEQ ID NO:01-07任一的多核苷酸，或其任一的功能等價(jià)物，或包含所述多核苷酸或其任一功能等價(jià)物的載體，和 c.多肽，其至少包含SEQIDNO:13-17之一。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的根據(jù)SEQID NO:08-12的經(jīng)分離多肽或其任一的功能等價(jià)物，所述功能等價(jià)物與SEQ IDNO:08-12至少55%同源。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的根據(jù)SEQID NO:08-12的經(jīng)分離多肽或其任一的功能等價(jià)物，所述功能等價(jià)物與SEQ IDNO:08-12至少65%同源。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的經(jīng)分離多肽，所述多肽可得自Marasmiusscorodoniuso
5.一種經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸能夠與根據(jù)SEQ ID NO:01-07的多核苷酸或其功能等價(jià)物雜交。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的經(jīng)分離寡核苷酸，所述寡核苷酸在高嚴(yán)格度條件下能夠與根據(jù)SEQ ID NO:01-07的多核苷酸或其功能等價(jià)物雜交。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的經(jīng)分離多核苷酸，所述多核苷酸可得自真菌，優(yōu)選地得自絲狀真菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的經(jīng)分離多核苷酸，所述多核苷酸可得自Marasmius，優(yōu)選地得自M.scorodonius。
9.一種經(jīng)分離的多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。
10.一種經(jīng)分離的多核苷酸，其編碼根據(jù)SEQ ID NO:08-12的多肽或其功能等價(jià)物的至少一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。
11.一種經(jīng)分離的多核苷酸，其包含根據(jù)SEQ ID NO:01-07的核苷酸序列或其功能等價(jià)物。
12.根據(jù)SEQID NO:01-07的經(jīng)分離的多核苷酸。
13.—種載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求5到12中任一項(xiàng)的多核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的載體，其中根據(jù)權(quán)利要求5到12中任一項(xiàng)的所述多核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列可操作地連接，所述調(diào)節(jié)序列適用于所述多核苷酸序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的載體，其中所述合適的宿主細(xì)胞是絲狀真菌或細(xì)菌。
16.一種用于制造根據(jù)權(quán)利要求5到12任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求13到15任一項(xiàng)的載體的方法，包括步驟:培養(yǎng)用所述多核苷酸或所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，從所述宿主細(xì)胞分離所述多核苷酸或所述載體。
17.—種經(jīng)分離的多肽，所述多肽能夠通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求5-12中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的載體來獲得。
18.一種重組的漂白酶，其包含caroase01-05多肽的功能結(jié)構(gòu)域。
19.一種用于制造根據(jù)權(quán)利要求1到4或17任一項(xiàng)的多肽的方法，包括步驟:用根據(jù)權(quán)利要求5到12任一項(xiàng)的經(jīng)分離多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求13到15任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，在允許所述多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，和可選地從所述細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化所編碼的多肽。
20.一種重組的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求5到12中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求13到15中任一項(xiàng)的載體。
21.—種重組的宿主細(xì)胞,其表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1到4或17中任一項(xiàng)的多核苷酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求1到4或17中任一項(xiàng)的多肽的用途，用于與未使用多肽的食品相比提高食品的至少一部分的白度。
23.一種用于生產(chǎn)食品的方法，其中所述食品的中間體形式包含色素，所述方法包括以下述用量添加根據(jù)權(quán)利要求1到4或17中任一項(xiàng)的至少一種多肽，所述用量有效地將所述色素直接轉(zhuǎn)化為下述形式，所述形式導(dǎo)致與其生產(chǎn)時(shí)未添加所述多肽的食品相比，食品的至少一部分的白度提聞。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述食品由面粉制成，優(yōu)選地由小麥面粉制成。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中食品是乳制品。
26.根據(jù)權(quán)利要求23到25中任一項(xiàng)的方法，其中色素是類胡蘿卜素。
27.根據(jù)權(quán)利要求23到26中任一項(xiàng)的方法，其中添加酶，所述酶是來自微生物的酶制劑或由能夠生產(chǎn)所述酶的微生物原位生產(chǎn)的酶制劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中添加酶，所述酶是來自細(xì)菌、真菌或酵母或由它們原位生產(chǎn)的酶制劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法,其中所述真菌屬于Marasmius屬,優(yōu)選地屬于Marasmiusscorodonius。
30.根據(jù)權(quán)利要求23-29中任一項(xiàng)的方法，其中在生產(chǎn)食品時(shí)還額外地添加氧化還原酶。
31.能夠通過根據(jù)權(quán)利要求23到30中任一項(xiàng)的方法獲得的食品。
32.根據(jù)權(quán)利要求1到4或17中任一項(xiàng)的多肽直接將色素轉(zhuǎn)化為下述形式的用途，所述形式導(dǎo)致食品的至少一部分的白度提高。
33.根據(jù)權(quán)利要求1到4或17中任一項(xiàng)的多肽用于去污劑或酶石漂白過程的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104017782SQ201410177825
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2006年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2005年7月12日
【發(fā)明者】霍爾格·佐恩, 馬諾拉·希爾本恩, 巴貝爾·胡爾斯旦, 拉夫·干特爾·貝爾格, 萊克斯·博爾德, 羅埃爾弗·伯恩哈德·梅瑪 申請人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司