一種人染色體基因il28b位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和用途，其試劑盒含有以下a、b和c三組中至少一組的引物和探針，所述引物和探針?lè)謩e為：a：860L1、860L2、860R、860P；b：275L1、275L2、275R、275P；c：917L1、917L2、917R、917P；其中860P、275P和917P的5’端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記DACYL。還保護(hù)了該試劑盒的檢測(cè)方法和用途。該方法更簡(jiǎn)便快捷，易于實(shí)現(xiàn)全程自動(dòng)化；避免PCR產(chǎn)物的二次操作，減少污染；成本更低，更經(jīng)濟(jì)；可以利用目前市場(chǎng)普及的設(shè)備，不必新增投資。
【專利說(shuō)明】一種人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及體外診斷試劑，具體的涉及一種人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]宿主IL28B基因多態(tài)性，其密切關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)主要有位于染色體(19ql3) IL28B 基因上游的 rsl2979860、rsl2980275、rs8099917。
[0003]目前對(duì)IL28B位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)方法主要有基因測(cè)序法(比如201210234084.6用于檢測(cè)丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多態(tài)性的試劑盒)及反向雜交法(比如201010019477.5丙型肝炎病毒基因分型及IL28位點(diǎn)多態(tài)性)。這兩種方法都要先進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物二次檢測(cè)，所以操作復(fù)雜。同時(shí)，基因擴(kuò)增產(chǎn)物比模板在數(shù)量上放大了億倍以上，很容易造成實(shí)驗(yàn)室污染，影響檢測(cè)結(jié)果?，F(xiàn)行的基因測(cè)序法或反向雜交法由于要求兩次操作，所以很難實(shí)現(xiàn)全程自動(dòng)化。
[0004]專利ZL201110263288.8( — 種快速檢測(cè) IL28B SNP rsl2979860 多態(tài)性的試劑盒)是根據(jù)PCR擴(kuò)增片段大小進(jìn)行結(jié)果判斷。專利申請(qǐng)201210353290.9(檢測(cè)IL28B(rs8099917)和ITPA(rsl 127354)的突變的方法)是通過(guò)基于包含IL28B基因多態(tài)性的rs8099917的特定區(qū)域以及包含ITPA基因多態(tài)性的rsll27354的特定區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)探針，使用該探針，來(lái)通過(guò)檢測(cè)基于與靶標(biāo)核酸形成雜交體和/或雜交體解離的信號(hào)，來(lái)檢測(cè)所述的突變。
[0005]以上現(xiàn)有技術(shù)均存在檢測(cè)結(jié)果有不確定性，同時(shí)只能檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)信息不充分，檢測(cè)過(guò)程操作復(fù)雜，具有局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確、快捷、低廉的IL28B基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于，含有以下a、b和c三組中至少一組的引物和探針，所述引物和探針?lè)謩e為:
[0008]a:860L1:AGCTCCCCGAAGGAGC(SEQ ID NO: I)
[0009]860L2:AGCTCCCCGAAGGAGT(SEQ ID NO:2)
[0010]860R:AGGCTCAGGGTCAATCACAG (SEQ ID NO:3)
[0011 ]860P:TTGAATTGCACTCCGCGCTC (SEQ ID NO:4)，其 5 ’ 端標(biāo)記 FAM，3，端標(biāo)記 DACYL ；
[0012]b:275L1:CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAACCA(SEQ ID NO:5)
[0013]275L2:CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAACCG(SEQ ID NO:6)
[0014]275R:TTGCTACATTGTTCGGCAAG(SEQ ID NO:7)
[0015]275P:AATATTTGCCGGGGTAGCGG (SEQ ID NO:8)，其 5 ’ 端標(biāo)記 FAM，3 ’ 端標(biāo)記 DACYL ；
[0016] c:917L1:TGTTTTCCTTTCTGTGAGCACTT(SEQ ID NO:9)[0017]917L2:TGTTTTCCTTTCTGTGAGCACTG(SEQ ID NO:10)
[0018]917R:TGCTGGGCCCTAACTGATAC(SEQ ID NO: 11)
[0019]917P:TCACCCAAATTGGAACCATGC (SEQ ID NO:12)，其 5’端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記DACYL。
[0020]一種人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法，包括使用權(quán)利要求1試劑盒中的引物和探針的步驟。其步驟為:
[0021]DNA提取:采用磁性納米顆粒固相吸附法提取全血基因組DNA ；
[0022]PCR擴(kuò)增:使用權(quán)利要求1所述的引物和探針對(duì)提取的全血基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0023]結(jié)果判斷。
[0024]所述DNA提取步驟為:
[0025]裂解:取待測(cè)病人乙二胺四乙酸(EDTA)三鉀鹽或枸椽酸鈉抗凝全血標(biāo)本加入到裂解緩沖液中，所述裂解緩沖液為3M異硫氰酸瓜、IOmM EDTAU % Triton-X100、20mMTris-HCl pH6 ;再加入蛋白酶K，混均55°C加熱IOmin ；
[0026]磁吸附:加入10 μ I磁性納米顆粒，混勻靜置lOmin，置于磁力架上進(jìn)行磁分離，棄
廢液。
[0027]洗滌:加入洗滌液，所述洗滌液成分為1.5MNaCl、0.5% Triton-XlOOUOmM EDTA,20mM Tris-HCl pH6，振搖混勻，置磁吸附架上，固化磁性顆粒，吸凈廢液；
[0028]洗脫:加入洗脫液，65°C加熱lOmin，期間振搖2次，磁性分離磁珠，上清即為全血基因組DNA ;所述洗脫液成分為ImM EDTAUOmM Tris-HCl pH8。
[0029]所述PCR擴(kuò)增的步驟中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:
【權(quán)利要求】
1.一種人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于，含有以下a、b和C三組中至少一組的引物和探針，所述引物和探針?lè)謩e為:
a:860L1:AGCTCCCCGAAGGAGC(SEQ ID NO:1)
860L2:AGCTCCCCGAAGGAGT(SEQ ID NO:2)
860R:AGGCTCAGGGTCAATCACAG(SEQ ID NO:3)
860P:TTGAATTGCACTCCGCGCTC(SEQ ID NO:4)，其 5’ 端標(biāo)記 FAM，3’ 端標(biāo)記 DACYL ；
b:275L1:CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAACCA(SEQ ID NO:5)
275L2:CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAACCG(SEQ IDNO:6)
275R:TTGCTACATTGTTCGGCAAG(SEQ ID NO:7)
275P:AATATTTGCCGGGGTAGCGG(SEQ ID NO:8)，其 5’ 端標(biāo)記 FAM，3’ 端標(biāo)記 DACYL ；
c:917L1:TGTTTTCCTTTCTGTGAGCACTT(SEQ ID NO:9)
917L2:TGTTTTCCTT TCTGTGAGCACTG(SEQ ID NO:10)
917R:TGCTGGGCCCTAACTGATAC(SEQ ID NO:11)
917P:TCACCCAAATTGGAACCATGC(SEQ ID NO:12)，其 5’ 端標(biāo)記 FAM，3’ 端標(biāo)記 DACYL。
2.一種人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法，包括使用權(quán)利要求1試劑盒中的引物和探針的步驟。
3.權(quán)利要求2的人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法，其步驟為: DNA提取:采用磁性納米顆粒固相吸附法提取全血基因組DNA ； PCR擴(kuò)增:使用權(quán)利要求1所述的引物和探針對(duì)提取的全血基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 結(jié)果判斷。
4.權(quán)利要求3的人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，所述DNA提取步驟為: 裂解:取待測(cè)病人乙二胺四乙酸(EDTA)三鉀鹽或枸椽酸鈉抗凝全血標(biāo)本加入到裂解緩沖液中，所述裂解緩沖液為3M異硫氰酸瓜、IOmM EDTAU % Triton-XlOO,20mM Tris-HClPH6 ;再加入蛋白酶K，混均55°C加熱IOmin ； 磁吸附:加入10 μ I磁性納米顆粒，混勻靜置lOmin，置于磁力架上進(jìn)行磁分離，棄廢液。 洗滌:加入洗滌液，所述洗滌液成分為1.5MNaCl、0.5 % Triton-XlOOUOmM EDTA,20mMTris-HCl pH6，振搖混勻，置磁吸附架上，固化磁性顆粒，吸凈廢液； 洗脫:加入洗脫液，65°C加熱lOmin，期間振搖2次，磁性分離磁珠，上清即為全血基因組 DNA ;所述洗脫液成分為 ImM EDTA, IOmM Tris-HCl pH8。
5.權(quán)利要求3的人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的 步驟中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:全I(xiàn)fc基園組DNA15μΙTaq DNA 聚合_2μΙ 特異性引物和探計(jì)3μ11X1.67反應(yīng)緩沖液30μ1所述 1X1.67 反應(yīng)緩沖液為 33.4mM Tris-HCl ρΗ9.0,83.5mM KC1、8.4mM 二硫蘇糖醇、.2.5mMMgCl2、0.17%小牛血清白蛋白； 任選的，上述各成分混勻后12000rpm離心10秒鐘后再開始擴(kuò)增； 所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?95°C 5min
6.權(quán)利要求3的人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，所述結(jié)果判斷為同一位點(diǎn)的兩個(gè)特異性檢測(cè)管如果一個(gè)Ct值在25-30之間，另一個(gè)Ct值大于38，則是對(duì)應(yīng)Ct值小的基因型純合子；如果兩個(gè)特異性檢測(cè)管Ct值相等均在25-30之間則是雜合子；如果兩個(gè)特異性檢測(cè)管Ct值均大于38，說(shuō)明檢測(cè)出現(xiàn)假陰性需重新檢測(cè)。
7.權(quán)利要求1的人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)人染色體基因IL28B位點(diǎn)多態(tài)性的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103993076SQ201410180391
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】魏超, 魏劭 申請(qǐng)人:廈門安普利生物工程有限公司