治療和診斷年齡相關(guān)性黃斑變性的方法和試劑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及與AMD危險(xiǎn)提高或降低相關(guān)的因子H基因多態(tài)性和單元型。本發(fā)明提供了診斷和治療AMD的方法和試劑。
【專(zhuān)利說(shuō)明】治療和診斷年齡相關(guān)性黃斑變性的方法和試劑
[0001]本申請(qǐng)是發(fā)明人于2006年2月14日提交的題為“治療和診斷年齡相關(guān)性黃斑變性的方法和試劑”的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200680012494.9的分案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)文獻(xiàn)的交叉參考
[0003]本申請(qǐng)要求U.S.臨時(shí)申請(qǐng)N0.60/650, 078 (2005年2月14日提交)、60/717,861(2005 年 9 月 16 日提交)、60/715，503 (2005 年 9 月 9 日提交)和60/735，697 (2005年11月9日提交)的權(quán)益，所述文獻(xiàn)均以其全部?jī)?nèi)容引入本文為參考。
[0004]聯(lián)邦資助的研發(fā)中產(chǎn)生的發(fā)明的權(quán)利陳述
[0005]本申請(qǐng)所述工作部分由NIH眼科研究院基金EY11515資助。美國(guó)政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。 【背景技術(shù)】
[0006]年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是發(fā)達(dá)國(guó)家中引起不可逆失明的最主要原因(綜述參閱，Zarbin, 1998, 2004 ;Klein 等，2004 ；Ambati 等，2003 ；de Jong, 2004 ；van Leeuwen 等，
2003)，影響約15%的60歲以上個(gè)體。估計(jì)有6億個(gè)體在這一年齡統(tǒng)計(jì)范圍內(nèi)。AMD的患病數(shù)隨年齡提高，在75歲及以上的群體中，輕度或早期形式在近30%的個(gè)體中發(fā)生，高級(jí)形式在約7%的個(gè)體中發(fā)生(Klein等，1992 ;Vingerling等，1995a，1995b)。在臨床上，AMD的特征為由黃斑中發(fā)生的退化性變化引起的漸進(jìn)性中央視覺(jué)喪失，黃斑是視網(wǎng)膜神經(jīng)中的特化區(qū)域及其下層組織。在最嚴(yán)重或滲出性的疾病形式下，來(lái)自脈絡(luò)膜脈管系統(tǒng)的新生血管葉突破了 Bruch膜和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)，一般引起視網(wǎng)膜脫落和其后的變性。
[0007]AMD作為遲發(fā)性復(fù)合疾病，似乎由遺傳和環(huán)境因素的組合引起和/或調(diào)節(jié)(Seddon和Chen，2004 ;Tuo等，2004 ；Klein和Francis，2003)。家族性聚集研究估計(jì)遺傳組分主要參與了多達(dá)25%的疾病(Klaver等，1998a)。根據(jù)流行的假說(shuō)，多數(shù)AMD病例不是多種單基因病癥的集合，而是代表定量的表型、表示多種易患基因座的相互作用。所涉及的基因座數(shù)、所賦予的歸因危險(xiǎn)度和多個(gè)基因座之間的相互作用仍不清楚。
[0008]連鎖和候選基因篩選分析已經(jīng)對(duì)AMD的遺傳學(xué)提供了有限的了解。已經(jīng)報(bào)道了一個(gè)增加危險(xiǎn)的基因，ABCA4 (Allikmets等，1997)和一個(gè)降低危險(xiǎn)的基因，ApoE4 (Klaver等，1998b，Souied等，1998)對(duì)AMD的可靠關(guān)聯(lián)。，此外，一些小組報(bào)道了全基因組連鎖分析的結(jié)果(綜述于Tuo等，2004 ;Weeks等，2004)。已經(jīng)證明了一個(gè)有AMD表型的家族與特定染色體區(qū)域Iq25_q31 (ARMDl)的連鎖(Klein等，1998)。已經(jīng)提出HEMICENTIN-l基因?yàn)橹虏』?Schultz等，2003)，盡管其作用還沒(méi)有可靠地得到確認(rèn)。若干研究(Weeks等，2001 ;Iyengar等，2003 ;Weeks等，2004)中染色體Iq上重疊基因座的鑒定提示該基因座可能包含一個(gè)或多個(gè)AMD相關(guān)基因。
[0009]最近對(duì)玻璃疣(與AMD發(fā)病相關(guān)的特征性眼損傷)的研究已經(jīng)指出了炎癥和其他免疫介導(dǎo)過(guò)程(特別是補(bǔ)體活化)在AMD早期和晚期形式的病因?qū)W中的作用(Hageman等，1999,2001 ；Mullins 等，2000,2001 ;Russell 等，2000 ;Anderson 等，2002，2004 Johnson等,2000, 2001 ；Crabb 等,2002 ；Ambati 等,2003 ；Penfold 等,2001 ；Espinosa-Heidman 等，2003)。這些研究已經(jīng)揭示了沿著bruch膜(由彈性蛋白質(zhì)和膠原組成的分隔RPE和脈絡(luò)膜的細(xì)胞外層)的玻璃疣中和RPE細(xì)胞上的玻璃疣中的末端途徑補(bǔ)體組分(C5、C6、C7、C8和C9)和末端途徑的活化特異性補(bǔ)體蛋白質(zhì)片段(C3b、iC3b、C3dg和C5b-9)以及多種補(bǔ)體途徑調(diào)節(jié)子和抑制子(包括因子H、因子1、因子0、CD55和CD59) (Johnson等，2000，2001 ；Mullins等2000，2001 ;Crabb等，2002)。許多這些玻璃疣相關(guān)分子先前認(rèn)為是主要由肝合成的循環(huán)血漿蛋白質(zhì)。有趣的是，許多這些玻璃疣相關(guān)分子似乎還由RPE和/或脈絡(luò)膜細(xì)胞局部合成。
[0010]補(bǔ)體系統(tǒng)的活化在正常宿主的防御和損傷應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Kinoshita，1991)。這一系統(tǒng)的不適當(dāng)活化和/或控制(常由特異性補(bǔ)體相關(guān)基因的突變引起)可引起自身免疫后遺癥和局部組織破壞(Holers, 2003 ；Liszewski and Atkinson, 1991 ；Morganand Walport, 1991 ；Shen and Meri, 2003),就像動(dòng)脈粥樣硬化(Torzewski 等，1997 ；Niculescu等，1999)、阿爾茨海默病(Akiyama等,2000)和腎小球腎炎(Schwertz等,2001)中所顯示的那樣。
[0011]2型膜性增生性腎小球腎炎(MPGN II) 一種罕見(jiàn)疾病，與補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)旁路途徑的非受控系統(tǒng)性活化相關(guān)。該疾病的特征為腎小球基底膜中異常電子密度物質(zhì)的沉積，最終導(dǎo)致腎衰竭，其中所述異常電子密度物質(zhì)由補(bǔ)體旁路途徑中涉及的蛋白質(zhì)C3和C3c組成。有趣的是，許多MPGNII患者發(fā)生了斑狀玻璃疣、RPE脫離和脈絡(luò)膜新生血管膜，它們?cè)谂R床上和組成上均與AMD中形成的有所不同，盡管它們常在十至二十歲中檢測(cè)到(Mullins等，2001 ；0 ' Brien 等，1993 ；Huang 等，2003 ；Colville 等，2003 ；DuvalI — Young 等，1989a, 1989b ；Raines 等，1989 ；Leys 等，1990 ；McAvoy and Silvestri, 2004 ；Bennett 等，1989 ；0rth and Ri tz, 1998 ；Habib 等，1975)。
[0012]在多數(shù)MPGNII患者中，補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)失能是由針對(duì)C3bBb的自身抗體介導(dǎo)的。然而，其他MPGNII患者在因子H中存在突變(Ault等，1997 ;Dragon_Durey等，
2004)，因子H是旁路補(bǔ)體途徑的主要抑制子。因子H中的點(diǎn)突變(I1166R)在約克豬中引起MPGNII (Jansen等，1998)，因子H缺陷型小鼠發(fā)生嚴(yán)重腎小球腎炎(Pickering等，2002)。此外，一些患MPGNIII的擴(kuò)大家族(相關(guān)疾病)的患病個(gè)體顯示對(duì)染色體lq31_32的連鎖(Neary等，2002)，lq31_32是與在AMD的全基因組連鎖研究(見(jiàn)上文)中已經(jīng)鑒定的基因座重疊的區(qū)域。這一特定基因座包含大量補(bǔ)體途徑相關(guān)基因。這些基因的一個(gè)組稱為補(bǔ)體活化調(diào)節(jié)子(RCA)基因簇，含有編碼因子H、五種因子H相關(guān)基因(CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)和凝固因子X(jué)III β亞基的基因。補(bǔ)體途徑相關(guān)基因的第二個(gè)簇與lq25_31基因座毗鄰，包括 C4BPA、C4BPB、C4BPAL2、DAF(CD55) CR1、CR2、CRlL 和 MCP (CD46)。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明涉及補(bǔ)體因子H基因的多態(tài)性和單元型，所述基因與年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)和2型膜性增生性腎小球腎炎(MPGNII)的發(fā)生相關(guān)。本發(fā)明還涉及補(bǔ)體因子H相關(guān)5(CFHR5)基因的多態(tài)性和單元型，所述基因與AMD和MPGNII的發(fā)生相關(guān)。本發(fā)明提供診斷、監(jiān)測(cè)和治療這些以及其他疾病的方法。
[0015]在一方面中，本發(fā)明提供用于確定受試者發(fā)生年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的傾向的診斷方法，所述方法包括檢測(cè)因子H基因多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中變異的存在與否。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供診斷對(duì)發(fā)生AMD的易感性增加的方法，包括檢測(cè)個(gè)體中因子H基因多態(tài)性的存在與否。該方法可包括獲得來(lái)自個(gè)體的DNA和分析來(lái)自該個(gè)體的DNA以確定該DNA是否在因子H基因中含有多態(tài)性。某些多態(tài)性指示，該個(gè)體與對(duì)照群體相比發(fā)生AMD的易感性增加。某些多態(tài)性指示該個(gè)體發(fā)生AMD的可能性降低。某些多態(tài)性指示該個(gè)體發(fā)生AMD的可能性既沒(méi)有增加也沒(méi)有降低。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者發(fā)生年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的傾向的診斷方法包括獲得來(lái)自該受試者的DNA樣品和檢測(cè)該患者的DNA中是否存在與發(fā)生AMD相關(guān)的多態(tài)性，存在該多態(tài)性指示該受試者發(fā)生AMD的傾向提高，不存在該多態(tài)性指示該受試者發(fā)生AMD的傾向降低。
[0017]在相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供診斷對(duì)發(fā)生AMD的易感性的方法，包括確定個(gè)體的因子H單元型。該方法包括獲得來(lái)自個(gè)體的DNA和分析該個(gè)體的DNA以確定其因子H單元型。某些單元型(危險(xiǎn)單元型)指示該個(gè)體對(duì)發(fā)生AMD的易感性提高。某些單元型(保護(hù)性單元型)指示該個(gè)體對(duì)發(fā)生AMD的易感性降低。某些單元型(中性單元型)指示該個(gè)體對(duì)發(fā)生AMD的可能性既不提高也不降低。
[0018]在相關(guān)的實(shí)施方案中，通過(guò)分析該基因編碼的基因產(chǎn)物(如RNA或因子H蛋白質(zhì)(如蛋白質(zhì)同種型))來(lái)確定因子H基因的多態(tài)性位點(diǎn)中變異的存在與否。變體蛋白質(zhì)的表達(dá)指示因子H基因的變異，并可指示提高或降低的發(fā)生AMD的傾向?？梢允褂妹庖邷y(cè)定和其他方法檢測(cè)蛋白質(zhì)。[0019]在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)檢測(cè)個(gè)體生物樣品中的變體因子H多肽來(lái)診斷發(fā)生AMD或其他疾病的易感性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用基于抗體的測(cè)定診斷個(gè)體中的AMD或其他疾病，其中使該個(gè)體的生物樣品(如血清樣品)接觸抗體并檢測(cè)變體因子H多肽的存在與否。在實(shí)施方案中，該抗體與變體因子H多肽特異性表位(即在野生型因子H多肽中未發(fā)現(xiàn))特異性相互作用。在實(shí)施方案中，使用基于分離的測(cè)定(如PAGE)診斷個(gè)體中的AMD或其他疾病，其中檢測(cè)個(gè)體的生物樣品(如血清樣品)中變體因子H多肽的存在與否。
[0020]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供通過(guò)調(diào)節(jié)因子H的類(lèi)型和/或全身和/或眼水平的量來(lái)治療患AMD (如其中檢測(cè)到指示發(fā)生癥狀A(yù)MD的危險(xiǎn)提高的多態(tài)性或單元型的個(gè)體)或其他變體因子H基因相關(guān)疾病的個(gè)體的方法。該因子H多肽可以是野生型因子H多肽或變體因子H多肽。該因子H多肽可以是這樣的因子H多肽，即其具有中性或保護(hù)性等位基因而不是危險(xiǎn)單元型相關(guān)等位基因編碼的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)個(gè)體施用有效量的因子H多肽，以降低疾病癥狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)個(gè)體施用有效量的因子H多肽，以降低發(fā)生疾病癥狀的傾向并延緩疾病的發(fā)生和發(fā)展。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括施用包含因子H的血液。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括施用核酸(如轉(zhuǎn)基因)，所述核酸包含編碼因子H多肽的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括施用表達(dá)因子H多肽的細(xì)胞。
[0021]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供治療患AMD(如其中檢測(cè)到指示發(fā)生癥狀A(yù)MD的危險(xiǎn)提高的多態(tài)性或單元型的個(gè)體)或其他變體因子H基因相關(guān)疾病的個(gè)體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)患者施用有效量的降低變體因子H的量或編碼因子H的基因表達(dá)的物質(zhì)，以減少患者的疾病癥狀。在相關(guān)實(shí)施方案中，對(duì)個(gè)體施用治療量的變體因子H多肽抑制劑(如滅活劑)。[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中,對(duì)個(gè)體施用抑制性核酸(如與變體因子H多肽的核苷酸序列至少部分互補(bǔ)的RNA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用純化的反義RNA，其與編碼變體因子H多肽的RNA互補(bǔ)。
[0023]在另一實(shí)施方案中，對(duì)個(gè)體施用治療量的抗CFH抗體，所述抗體足以部分滅活變體因子H多肽。
[0024]在另一實(shí)施方案中，治療個(gè)體以從血中除去因子H的有害形式(如通過(guò)血漿去除術(shù)、抗體指導(dǎo)的血漿去除術(shù)或與因子H結(jié)合部分如肝素的復(fù)合)。
[0025]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供編碼變體因子H多肽的純化DNA、編碼變體因子H多肽的純化RNA，與編碼變體因子H多肽的RNA互補(bǔ)的純化反義RNA以及純化的變體因子H多肽。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供用于表達(dá)野生型或變體因子H多肽或因子H生物活性片段的核酸。
[0026]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包含編碼因子H多肽的核酸的基因治療載體。該載體可包括驅(qū)動(dòng)因子H基因在多種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)的啟動(dòng)子。備選地，該載體可包括驅(qū)動(dòng)因子H基因僅在特定細(xì)胞 類(lèi)型(如視網(wǎng)膜細(xì)胞或腎細(xì)胞)中表達(dá)的啟動(dòng)子。在一個(gè)方面中提供了含有編碼因子H蛋白質(zhì)的基因治療載體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含有病原體，并適于對(duì)人類(lèi)患者施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所編碼的因子H多肽為保護(hù)性變體。
[0027]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供含有重組或純化的因子H多肽的組合物，其中所述多肽為保護(hù)性多肽。
[0028]在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供含有重組或純化的因子H多肽和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中所述組合物不含有病原體，并適于對(duì)人類(lèi)患者施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼的因子H多肽具有野生型序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼的因子H多肽為保護(hù)性變體。
[0029]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供抗體，所述抗體與變體因子H多肽而不是野生型因子H多肽特異性相互作用。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，并可通過(guò)消減技術(shù)獲得。這些抗體足以滅活變體因子H多肽。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供含有抗因子H抗體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中所述組合物不含有病原體，并適于對(duì)人類(lèi)患者施用。
[0030]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供鑒定與發(fā)生AMD的危險(xiǎn)提高或降低相關(guān)的變體因子H蛋白質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定保護(hù)性因子H蛋白質(zhì)的方法，所述方法通過(guò)(a)鑒定具有保護(hù)性單元型的個(gè)體，和(b)確定在個(gè)體基因組中編碼的因子H的氨基酸序列，其中保護(hù)性因子H蛋白質(zhì)由具有保護(hù)性單元型的等位基因編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定中性因子H蛋白質(zhì)的方法，所述方法通過(guò)(a)鑒定具有中性單元型的個(gè)體，和(b)確定在個(gè)體基因組中編碼的因子H的氨基酸序列，其中中性因子H蛋白質(zhì)由具有中性單元型的等位基因編碼。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定與發(fā)生AMD的危險(xiǎn)降低相關(guān)的因子H變體形式的方法，包括(a)鑒定具有與發(fā)生AMD的危險(xiǎn)降低相關(guān)的單元型或二倍型(diplotype)的個(gè)體；(b)獲得來(lái)自個(gè)體的基因組DNA或RNA ;和(c)確定在個(gè)體基因組中編碼的因子H的氨基酸序列，其中保護(hù)性因子H蛋白質(zhì)由具有與發(fā)生AMD的危險(xiǎn)降低相關(guān)的等位基因編碼。在實(shí)施方案中，所述保護(hù)性或中性因子H蛋白質(zhì)不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。
[0031]在相關(guān)方法中，鑒定與發(fā)生AMD的危險(xiǎn)提高相關(guān)的因子H形式，是通過(guò)(a)鑒定具危險(xiǎn)單元型的個(gè)體；和(b)確定在個(gè)體基因組中編碼的因子H的氨基酸序列，其中危險(xiǎn)因子H蛋白質(zhì)由具危險(xiǎn)單元型的等位基因編碼。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定與發(fā)生AMD的危險(xiǎn)提高相關(guān)的因子H的變體形式的方法，包括(a)鑒定具有與發(fā)生AMD的危險(xiǎn)提高相關(guān)的單元型或二倍型的個(gè)體；(b)獲得來(lái)自該個(gè)體的基因組DNA或RNA ;和(c)確定在個(gè)體基因組中編碼的因子H的氨基酸序列，其中危險(xiǎn)因子H蛋白質(zhì)由具有與發(fā)生AMD的危險(xiǎn)提高相關(guān)的單元型的等位基因編碼。在實(shí)施方案中，所述危險(xiǎn)因子H蛋白質(zhì)不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。
[0032]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供診斷發(fā)生AMD或其他疾病的傾向或易感性的方法，所述方法通過(guò)檢測(cè)患者的生物樣品中全長(zhǎng)因子H與截短因子H的比值。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷受試者中發(fā)生AMD的傾向或易感性的方法包括獲得來(lái)自受試者的RNA樣品和檢測(cè)患者RNA中外顯子10(即全長(zhǎng)因子H)與外顯子10A(即截短的因子H)表達(dá)的比值，比值提高指示該受試者發(fā)生AMD的傾向或易感性提高，比值降低指示該受試者發(fā)生AMD的傾向或易感性降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷受試者中發(fā)生AMD的傾向或易感性的方法包括獲得來(lái)自受試者的蛋白質(zhì)樣品和檢測(cè)患者蛋白質(zhì)中全長(zhǎng)因子H與截短的因子H的表達(dá)比值，比值提高指示該受試者發(fā)生AMD的傾向或易感性提高，比值降低指示該受試者發(fā)生AMD的傾向或易感性降低。
[0033]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供細(xì)胞，所述細(xì)胞含有編碼因子H蛋白質(zhì)或其片段的重組或純化核酸，例如來(lái)自因子H基因的核酸。細(xì)胞可以為細(xì)菌或酵母或用于研究和藥物開(kāi)發(fā)的任何其他細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供表達(dá)重組變體人因子H的分離宿主細(xì)胞或細(xì)胞系。在實(shí)施方案中，變體是危險(xiǎn)變體且第402位氨基酸具有組氨酸。在實(shí)施方案中，變體是保護(hù)性變體且第62位氨基酸為異亮氨酸。在實(shí)施方案中，變體為中性變體。在實(shí)施方案中，所述危險(xiǎn)、保護(hù)性或中性變體因子H蛋白質(zhì)不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。 [0034]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其體細(xì)胞和生殖細(xì)胞含有編碼人變體因子H多肽的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用作AMD模型和用于篩選治療AMD的有用物質(zhì)。動(dòng)物可以是小鼠、蟲(chóng)或用于研究和藥物開(kāi)發(fā)(如重組產(chǎn)生因子H)的任何其他動(dòng)物。在實(shí)施方案中，該因子H為變體人因子H，其中所述變體的第62位氨基酸為異亮氨酸或第402位氨基酸為組氨酸。
[0035]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供篩選多態(tài)性位點(diǎn)的方法，所述多態(tài)性位點(diǎn)與表1A、1B和IC所述因子H基因中的多態(tài)性位點(diǎn)連鎖。這些方法包括鑒定基因中與因子H基因多態(tài)性位點(diǎn)連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)，其中因子H基因中多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性形式與AMD相關(guān)；確定個(gè)體群中的單元型，以指示該連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)是否具有與因子H基因的多態(tài)性形式平衡一不平衡的多態(tài)性形式，其中因子H基因的多態(tài)性形式與AMD表型相關(guān)。
[0036]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供MPGNII的診斷、治療和篩選方法，如上述對(duì)AMD進(jìn)行。
[0037]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于確定受試者發(fā)生AMD或MPGNII的傾向的方法，包括檢測(cè)CFHR5基因的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中是否存在一個(gè)或多個(gè)變異。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供診斷對(duì)發(fā)生AMD或MPGNII的易感性提高的方法，包括檢測(cè)個(gè)體CFHR5基因中是否存在多態(tài)性。該方法可包括獲得自個(gè)體的DNA和分析來(lái)自該個(gè)體的DNA以確定該DNA是否在CFHR5基因中含有多態(tài)性。某些多態(tài)性指示個(gè)體對(duì)發(fā)生AMD或MPGNII的易感性提高。某些多態(tài)性指示個(gè)體發(fā)生AMD或MPGNII的可能性降低。某些多態(tài)性指示個(gè)體發(fā)生AMD或MPGNII的可能性既不提高也不降低。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷受試者中發(fā)生AMD或MPGNII的傾向的方法包括從受試者獲得DNA樣品和檢測(cè)該患者的DNA中是否存在與發(fā)生AMD或MPGNII相關(guān)的多態(tài)性，存在該多態(tài)性指示該受試者發(fā)生AMD或MPGNII的傾向提高,不存在該多態(tài)性指示該受試者發(fā)生AMD或MPGNII的傾向降低。
[0039]在相關(guān)的實(shí)施方案中，通過(guò)分析基因產(chǎn)物(如RNA或該基因編碼的CFHR5蛋白質(zhì)(如蛋白質(zhì)同種型))確定CFHR5基因多態(tài)性位點(diǎn)處的變異存在與否。變體蛋白質(zhì)的表達(dá)指示CFHR5基因中的變異，并可指示發(fā)生AMD或MPGNII的傾向提高或降低。可以使用免疫測(cè)定和其他方法檢測(cè)蛋白質(zhì)。
[0040]在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供診斷對(duì)發(fā)生AMD或MPGNII的易感性的方法，包括確定個(gè)體的CFHR5單元型。該方法包括獲得來(lái)自個(gè)體的DNA和分析該個(gè)體的DNA以確定其CFHR5單元型。某些單元型(危險(xiǎn)單元型)指示個(gè)體具有比對(duì)照群提高的對(duì)發(fā)生AMD或MPGNII的易感性。某些單元型(保護(hù)性單元型)指示該個(gè)體具有降低的對(duì)發(fā)生AMD或MPGNII的易感性。某些單元型(中性單元型)指示該個(gè)體發(fā)生AMD或MPGNII的可能性既不提高也不降低。[0041]在另一相關(guān)方面中，本發(fā)明提供通過(guò)檢測(cè)個(gè)體的生物樣品中變體CFHR5多肽來(lái)診斷對(duì)發(fā)生AMD或MPGNII或其他疾病的易感性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用基于抗體的測(cè)定診斷個(gè)體中的AMD或MPGNII或其他疾病，其中通過(guò)使個(gè)體的生物樣品(如血清樣品)接觸該抗體并檢測(cè)是否存在該變體CFHR5多肽。在實(shí)施方案中，該抗體與變體CFHR5多肽特異性表位(即在野生型CFHR5多肽中未發(fā)現(xiàn)的)特異性相互作用。在實(shí)施方案中，使用基于分離的測(cè)定(如PAGE)診斷個(gè)體中的MPGNII或其他疾病，這是通過(guò)檢測(cè)該個(gè)體的生物樣品(如血清樣品)中是否存在該變體CFHR5多肽?？梢允褂枚喾N類(lèi)型的免疫測(cè)定形式來(lái)測(cè)定樣品中的CFH或CFHR5的多肽或蛋白質(zhì)。包括夾層ELISA、放射性免疫測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、免疫組織化學(xué)測(cè)定、點(diǎn)印跡、量桿(dip-stick)和Western印跡。
[0042]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供通過(guò)調(diào)節(jié)CFHR5的類(lèi)型和/或全身性和/或腎水平的量來(lái)治療個(gè)體的方法，所述個(gè)體患有AMD或MPGNII (如其中檢測(cè)到指示發(fā)生AMD或MPGNII癥狀的危險(xiǎn)提高的多態(tài)性或單元型的個(gè)體)或與變體CFHR5基因相關(guān)的其他疾病，或者有患病危險(xiǎn)。CFHR5多肽可以是中性或保護(hù)性等位基因而不是與危險(xiǎn)單元型相關(guān)的等位基因所編碼的CFHR5多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以有效降低疾病癥狀的量對(duì)個(gè)體施用CFHR5多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以有效降低發(fā)生疾病癥狀的傾向和延緩疾病的發(fā)生或發(fā)展的量對(duì)個(gè)體施用CFHR5多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括施用含有CFHR5的血。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括施用包含編碼CFHR5多肽的核苷酸序列的核酸(如轉(zhuǎn)基因)。
[0043]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供治療個(gè)體的方法，所述個(gè)體患有AMD或MPGNII (如檢測(cè)到指示發(fā)生AMD或MPGNII癥狀的危險(xiǎn)提高的多態(tài)性或單元型的個(gè)體)或與變體CFHR5基因相關(guān)的其他疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以有效降低患者中疾病癥狀的量對(duì)患者施用物質(zhì)，所述物質(zhì)降低變體CFHR5的量或編碼CFHR5的基因的表達(dá)。CFHR5多肽可以是野生型CFHR5多肽或變體CFHR5多肽。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)個(gè)體施用抑制性核酸(如與變體CFHR5多肽的核苷酸序列至少部分互補(bǔ)的RNA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用與編碼變體CFHR5多肽的RNA互補(bǔ)的純化的反義RNA。
[0045]在另一實(shí)施方案中，對(duì)個(gè)體施用治療量的抗CFHR5抗體，所述抗體足以使該變體CFHR5多肽部分失活。
[0046]在相關(guān)的實(shí)施方案中，對(duì)個(gè)體施用治療量的變體CFHR5多肽抑制劑(如滅活劑)。
[0047]在另一實(shí)施方案中，治療個(gè)體以從血中除去CFHR5的有害形式(如通過(guò)血漿去除術(shù)、抗體指導(dǎo)的血漿去除術(shù)或與CFHR5結(jié)合部分如肝素的復(fù)合)。
[0048]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供編碼變體CFHR5多肽的純化DNA、編碼變體CFHR5多肽的純化RNA、與編碼變體CFHR5多肽的RNA互補(bǔ)的純化的反義RNA以及純化的變體CFHR5多肽。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供用于表達(dá)野生型或變體CFHR5多肽或CFHR5的生物活性片段的核酸。
[0049]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包含編碼CFHR5多肽的核酸的基因治療載體。該載體可包括驅(qū)動(dòng)CFHR5基因在多種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)的啟動(dòng)子。備選地，該載體可包括驅(qū)動(dòng)CFHR5基因僅在特定細(xì)胞類(lèi)型(例如視網(wǎng)膜細(xì)胞或腎細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、足細(xì)胞))中表達(dá)的啟動(dòng)子。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供含有編碼CFHR5蛋白質(zhì)的基因治療載體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含病原體，并適于對(duì)人類(lèi)患者施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼的CFHR5多肽為保護(hù)性變體。
[0050]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供含有重組或純化的CFHR5多肽的組合物，其中該多肽為保護(hù)性變體。 [0051]在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供含有重組或純化的CFHR5多肽和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含病原體，并適于對(duì)人類(lèi)患者施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼的CFHR5多肽為野生型序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼的CFHR5多肽為保護(hù)性變體。
[0052]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供與變體CFHR5多肽特異性相互作用而不與野生型CFHR5多肽相互作用的抗體。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，并都可通過(guò)消減技術(shù)獲得。這些抗體可以足以滅活變體CFHR5多肽。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供含有抗CFHR5抗體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含病原體，并適于對(duì)人類(lèi)患者施用。
[0053]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供鑒定與發(fā)生AMD或MPGNII的危險(xiǎn)提高或降低相關(guān)的變體CFHR5蛋白質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定保護(hù)性CFHR5蛋白質(zhì)的方法，所述方法通過(guò)(a)鑒定具有保護(hù)性單元型的個(gè)體，和(b)確定在個(gè)體基因組中編碼的CFHR5氨基酸序列，其中保護(hù)性CFHR5蛋白質(zhì)由具有保護(hù)性單元型的等位基因編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定中性CFHR5蛋白質(zhì)的方法，所述方法通過(guò)(a)鑒定具有保護(hù)性單元型的個(gè)體，和(b)確定在個(gè)體基因組中編碼的CFHR5氨基酸序列，其中中性CFHR5蛋白質(zhì)由具有中性單元型的等位基因編碼。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定與發(fā)生AMD或MPGNII的危險(xiǎn)降低相關(guān)的CFHR5變體形式的方法，包括(a)鑒定具有與發(fā)生AMD或MPGNII的危險(xiǎn)降低相關(guān)的單元型或二倍型的個(gè)體；(b)獲得來(lái)自個(gè)體的基因組DNA或RNA;和(c)確定在個(gè)體基因組中編碼的CFHR5氨基酸序列，其中保護(hù)性CFHR5蛋白質(zhì)由具有與發(fā)生AMD或MPGNII的危險(xiǎn)降低的單元型的等位基因編碼。在實(shí)施方案中，保護(hù)性或中性CFHR5蛋白質(zhì)不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。
[0054]在相關(guān)方法中，鑒定了與發(fā)生AMD或MPGNII的危險(xiǎn)提高相關(guān)的CFHR5形式，所述鑒定通過(guò)(a)鑒定具危險(xiǎn)單元型的個(gè)體和(b)確定在個(gè)體基因組中編碼的CFHR5氨基酸序列，其中危險(xiǎn)CFHR5蛋白質(zhì)由具危險(xiǎn)單元型的等位基因編碼。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定與發(fā)生AMD或MPGNII的危險(xiǎn)提高相關(guān)的CFHR5變體形式，包括(a)鑒定具有與發(fā)生AMD或MPGNII的危險(xiǎn)提高相關(guān)的單元型或二倍型的個(gè)體；(b)獲得來(lái)自該個(gè)體的基因組DNA或RNA，和(c)確定在個(gè)體基因組中編碼的CFHR5氨基酸序列，其中危險(xiǎn)CFHR5蛋白質(zhì)由具有與發(fā)生AMD或MPGNII的危險(xiǎn)提高相關(guān)的單元型的等位基因編碼。在實(shí)施方案中，危險(xiǎn)CFHR5蛋白質(zhì)不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。
[0055]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供含有重組或純化的核酸的細(xì)胞，所述核酸來(lái)自CFHR5基因。該細(xì)胞可以為細(xì)菌或酵母，或用于研究和藥物開(kāi)發(fā)的任何其他細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供表達(dá)重組變體人CFHR5的分離的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系。在實(shí)施方案中，CFHR5變體為危險(xiǎn)變體，并且第46位氨基酸為絲氨酸。在實(shí)施方案中，CFHR5變體為中性變體。在實(shí)施方案中，危險(xiǎn)、保護(hù)性或中性變體CFHR5蛋白質(zhì)不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。
[0056]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其體細(xì)胞和生殖細(xì)胞含有編碼人變體CFHR5多肽的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用作AMD或MPGNII的模型，并用于篩選用于治療AMD或MPGNII的物質(zhì)。所述動(dòng)物可以為小鼠、蟲(chóng)或用于研究和藥物開(kāi)發(fā)(如重組產(chǎn)生CFHR5)的任何其他動(dòng)物。 在實(shí)施方案中，CFHR5為變體人CFHR5，其中所述CFHR5變體的第46位氨基酸為絲氨酸。
[0057]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供篩選與表14或表15中所述CFHR5基因多態(tài)性位點(diǎn)連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)的方法。這些方法包括鑒定與CFHR5基因多態(tài)性位點(diǎn)連鎖的基因中的多態(tài)性位點(diǎn)，其中CFHR5基因中多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性形式與AMD或MPGNII相關(guān)；以及測(cè)定個(gè)體群中的單元型，以指示連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)是否具有與AMD或MPGNII表型相關(guān)CFHR5基因的多態(tài)性形式平衡一不平衡的多態(tài)性形式。
[0058]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于分析因子H單元型的試劑盒。該試劑盒可用于診斷患者的AMD。該試劑盒可包括一個(gè)或多個(gè)因子H、因子H等位基因特異性寡核苷酸(如等位基因特異性引物或探針)或特異性識(shí)別因子H多肽的抗體。該因子H等位基因特異性寡核苷酸可包括來(lái)自因子H基因編碼(外顯子)或非編碼(啟動(dòng)子、5’未翻譯、內(nèi)含子或3’未翻譯)區(qū)的序列。該因子H特異性抗體可識(shí)別正常或野生型H多肽或變體因子H多肽，其中在該因子H編碼區(qū)中存在一個(gè)或多個(gè)非同義單核苷酸多態(tài)性(SNP)。該試劑盒可用于診斷AMD以及與因子H基因SNP相關(guān)的其他疾病，如MPGNII。作為替代或補(bǔ)充，該試劑盒可包括一個(gè)或多個(gè)因子H相關(guān)5(CFHR5)等位基因特異性寡核苷酸(如引物或探針)或特異性識(shí)別CFHR5多肽的抗體。CFHR5等位基因特異性引物和因子H相關(guān)5等位基因特異性寡核苷酸可包括來(lái)自因子H相關(guān)5基因的編碼(外顯子)或非編碼(啟動(dòng)子、5’未翻譯、內(nèi)含子或3’未翻譯)區(qū)的序列。因子H相關(guān)5特異性抗體可識(shí)別正?；蛞吧虷多肽或變體因子H相關(guān)5多肽，其中在該因子H相關(guān)5編碼區(qū)中存在一個(gè)或多個(gè)非同義單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
[0059]在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包含探針或引物，它們可以在表1A、表1B和/或表IC中列出的多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因。在實(shí)施方案中，該探針為用于核酸擴(kuò)增的引物，所述擴(kuò)增為擴(kuò)增跨越表1A、表1B和/或表1C中列出因子H基因多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域。在實(shí)施方案中，該試劑盒具有探針或引物，它們?cè)诒?A、表1B和/或表1C中列出的一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因。在實(shí)施方案中，該試劑盒具有在一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點(diǎn)包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ； (c)rs3766404 ；
(d)rsl061147 ； (e)rsl061170 ； (f)rs203674 ； (g)rs529825 和 rs800292 中至少一個(gè)；(h)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一個(gè)；(i)rs529825 和 rs800292 中至少一個(gè)，以及 rs3766404 ;以及 rsl061147, rsl061170 和 rs203674 中至少一個(gè)；或者 j)rs529825,rs800292, rs3766404, rsl061170 和 rs203674 中至少一個(gè)。
[0060]在相關(guān)實(shí)施方案中，試劑盒具有在一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點(diǎn)包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ； (c)內(nèi)含子2 (IVS2或insTT) (d)rs3766404 ； (e)rsl061147 ； (f)rsl061170 ； (g)外顯子 IOA ； (h)rs203674 ； (i)rs375046 ；j)rs529825 和 rs800292 ； (k)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少兩個(gè)或三個(gè)；(I)rs529825 和 rs800292 中至少一個(gè);和內(nèi)含子 2 ;和 rs3766404 ;和 rsl061147、rsl061170 和rs203674 中至少一個(gè)；和外顯子 IOA ;和 rs375046 ； (m)至少 rs529825 ；rs800292 ;內(nèi)含子2 ；rs3766404 ；rsl061170 ;外顯子 IOA ；rs203674 ;和 rs375046 ； (n) rs529825、rs800292、內(nèi)含子2 ;rs3766404、rsl061170、外顯子10A、rs203674和rs375046中至少兩個(gè)，或至少三個(gè)或至少四個(gè)；(ο)外顯子22 (1210);或(P)外顯子22(1210)與任意前述變異或一組變異(a-o)組合。在實(shí)施方案中，試劑盒具有在rs460897和rs460184中一處或兩處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實(shí)施方案中，該試劑盒具有在一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點(diǎn)選自(a)rs3753394 ； (b)rs529825 ； (c)rs800292 ； (d)內(nèi)含子 2(IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ； (g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ； (j)rs3753396 ;和(k)rs1065489?[0061]在一個(gè)實(shí)施方案中，作為上述探針的替代或補(bǔ)充，試劑盒含有區(qū)分CFHR5基因中多態(tài)性位點(diǎn)的探針、引物、抗體等。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供基于CFHR5基因變異的診斷患者AMD或MPGNII的試劑盒。試劑盒可包括一種或多種CFHR5特異性探針或CFHR5等位基因特異性寡核苷酸，或特異性識(shí)別CFHR5多肽的抗體。CFHR5特異性引物和CFHR5等位基因特異性寡核苷酸可包括來(lái)自CFHR5基因編碼(外顯子)或非編碼(啟動(dòng)子、5’未翻譯、內(nèi)含子或3’未翻譯)區(qū)的序列。CFHR5特異性抗體可識(shí)別正?；蛞吧虲FHR5多肽或變體CFHR5多肽，其中在CFHR5編碼區(qū)中存在一個(gè)或多個(gè)非同義單核苷酸多態(tài)性(SNP)。該試劑盒可用于診斷AMD或MPGNII以及與CFHR5基因中SNP相關(guān)的其他疾病。
[0062]在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒含有在表14或表15中列出的多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實(shí)施方案中，探針為用于核酸擴(kuò)增的引物，其中擴(kuò)增是擴(kuò)增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域。在實(shí)施方案中，該試劑盒具有在表14或表15中列出的一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實(shí)施方案中，該試劑盒包含在一個(gè)、兩個(gè)或全部以下多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物:rs9427661( —249T>C) ；rs9427662( — 20T>C)和 rsl2097550(P46S)。
[0063]在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒含有在CFH基因中的多態(tài)性位點(diǎn)和CFHR基因(如CFHR5)的多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物。
[0064]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于確定受試者單元型的裝置。該裝置可用于例如診斷患者的AMD或其他疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，該裝置含有在表1A、IB和/或IC中列出的多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實(shí)施方案中，探針為用于核酸擴(kuò)增的引物，其中擴(kuò)增是擴(kuò)增跨越表1A、1B和/或IC中列出的因子H基因多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域。在實(shí)施方案中，該裝置具有在表1A、1B和/或IC中列出的一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實(shí)施方案中，該裝置具有在一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點(diǎn)包括(a)rs529825 ； (b)rs800292 ； (c)rs3766404 ； (d)rsl061147 ；
(e)rsl061170 ;(f)rs203674 ;(g)rs529825 和 rs800292 中至少一個(gè)；(h)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一個(gè);(i) rs529825 和 rs800292 中至少一個(gè)；和 rs3766404 ；以及 rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一個(gè)；或者 j)至少 rs529825、rs800292、rs3766404、rsl061170 和 rs203674。
[0065]上述試劑盒及其內(nèi)含物還可用于為任何目的而鑒定發(fā)生MPGNII的傾向或確定因子H單元型。
[0066]在相關(guān)實(shí)施方案中，該裝置具有在一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點(diǎn)包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ；(c)內(nèi)含子2(IVS2或insTT) ； (d)rs3766404 ； (e)rsl061147 ； (f)rsl061170 ； (g)外顯子 IOA ； (h)rs203674 ； (i)rs375046 ； (j)rs529825 和 rs800292 ； (k)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少兩個(gè)或三個(gè)；(l)rs529825 和 rs800292 中至少一個(gè)；和內(nèi)含子 2 ;和 rs3766404 ;和 rsl061147,rsl061170 和 rs203674 中至少一個(gè)；和外顯子 IOA ;和 rs375046 ； (m)至少 rs529825 ；rs800292 ;內(nèi)含子 2 ；rs3766404 ；rsl061170 ;外顯子 IOA ；rs203674 ；和 rs375046 ； (η)rs529825、rs800292、內(nèi)含子 2、rs3766404、rsl061170、外顯子 10A、rs203674 和 rs375046中至少兩個(gè)，或至少三個(gè)或至少四個(gè)；(o)外顯子22 (1210);或(P)外顯子22 (1210)與任意前述變異或一組變異(a- o)組合。在實(shí)施方案中，裝置具有在rs460897和rs460184中一個(gè)或兩個(gè)處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實(shí)施方案中，裝置具有在一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點(diǎn)選自(a)rs3753394 ;(b)rs529825 ;(c)rs800292 ； (d)內(nèi)含子 2 (IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ； (g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ; (j) rs3753396 和(k) rsl065489。在實(shí)施方案中，裝置具有在一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點(diǎn)選自(a)rs3753394 ；(b)rs529825 ； (c)rs800292 ； (d)內(nèi)含子 2(IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ；(g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ； (j)rs3753396 和(k)rs1065489?
[0067]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于診斷患者的AMD或MPGNII的裝置。在一個(gè)實(shí)施方案中，該裝置含有在表14和表15列出的多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實(shí)施方案中，探針為用于核酸擴(kuò)增的引物，其中擴(kuò)增是擴(kuò)增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域。在實(shí)施方案中，該裝置具有在表14或表15中列出的一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物。本發(fā)明的裝置可含有區(qū)分因子H和CHFR5變體的探針或引物，包括上文及本文公開(kāi)內(nèi)容中其他處所述的位點(diǎn)的任何組合。
[0068]上文所述裝置及其內(nèi)含物還可用于為任何目的而鑒定發(fā)生MPGNII的傾向或確定因子H單元型。
[0069]在一個(gè)實(shí)施方案中，作為上述探針或引物的替代或補(bǔ)充，該裝置含有區(qū)分CFHR5基因中多態(tài)性位點(diǎn)的探針、引物、抗體等。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供基于CFHR5基因變異診斷患者的AMD或MPGNII的裝置。該裝置可包括一種或多種CFHR5特異性探針或CFHR5等位基因特異性寡核苷酸或特異性識(shí)別CFHR5多肽的抗體。CFHR5特異性引物和CFHR5等位基因特異性寡核苷酸可包括來(lái)自CFHR5基因編碼(外顯子)或非編碼(啟動(dòng)子、5’未翻譯、內(nèi)含子或3’未翻譯)區(qū)的序列。該CFHR5特異性抗體可識(shí)別正?；蛞吧虲FHR5多肽或變體CFHR5多肽，其中在該CFHR5編碼區(qū)中存在一個(gè)或多個(gè)非同義單核苷酸多態(tài)性(SNP)。該裝置可用于診斷AMD或MPGNII以及與CFHR5基因SNP相關(guān)的其他疾病。
[0070] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該裝置含有在表14或表15中列出的多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實(shí)施方案中，該探針為用于核酸擴(kuò)增的引物，其中擴(kuò)增是擴(kuò)增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域。在實(shí)施方案中，該裝置具有在表14或表15中列出的一個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實(shí)施方案中，該試劑盒具有在一個(gè)、兩個(gè)或全部以下多態(tài)性位點(diǎn)處區(qū)分等位基因的探針或引物:rs9427661( —249T>C) ；rs9427662( — 20T>C)和 rsl2097550(P46S)。
[0071]在一個(gè)實(shí)施方案中，該裝置含有在CFH基因中的多態(tài)性位點(diǎn)和CFHR基因(如CFHR5)的多態(tài)性位點(diǎn)區(qū)分等位基因的探針或引物。
[0072]在閱讀全部公開(kāi)內(nèi)容后，本發(fā)明的其他方面將是顯而易見(jiàn)的。
[0073]附圖簡(jiǎn)述
[0074]圖1A-1L顯示人視網(wǎng)膜色素上皮中因子H(圖1A-1H)和末端互補(bǔ)復(fù)合物(C5b_9)(圖11-1L)的免疫定位。縮寫(xiě):(RPE) —脈絡(luò)膜(Chor)復(fù)合物；Bruch膜(BM);視網(wǎng)膜(Ret);玻璃疣(Dr)。
[0075]圖2顯示使用來(lái)自人眼的RNA提取物對(duì)因子H基因表達(dá)((FH和截短形式HFL1)的RT-PCR分析。
[0076]圖3是人因子H基因的簡(jiǎn)圖，顯示本分析中使用的12個(gè)SNP、因子H基因的22個(gè)外顯子、20個(gè)短共有重復(fù)序列(SCR)、病原體和其他底物的結(jié)合位點(diǎn)以及連鎖不平衡(LD)節(jié)段的大概位置。顯示CHl所有22個(gè)外顯子(但無(wú)內(nèi)含子)的簡(jiǎn)圖未按比例拉伸。
[0077]圖4是人因子H基因SNP的單元型網(wǎng)狀圖，顯示危險(xiǎn)(實(shí)心圓)、保護(hù)性(劃線圓)、中性(空心圓)和始祖(標(biāo)出)單元型的關(guān)系以及單元型的相對(duì)頻率，以圓的大小和位置表示。
[0078]圖5顯示人因子H基因單元型和二倍型的相關(guān)分析。在AMD病例和對(duì)照中分析了8個(gè)信息化SNP的配對(duì)連鎖不平衡。顯示了在編碼鏈上標(biāo)出的多態(tài)性位點(diǎn)處的核苷酸，除了IYS1，顯示了其非編碼鏈上的核苷酸。
[0079]圖6顯示人因子H cDNA參照形式的3926堿基核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)Y00716[SEQ ID N0:1])。ATG起始密碼子開(kāi)始于第74位核苷酸，TAG終止密碼子終止于第3769位核苷酸。
[0080]圖7 顯示 SEQ ID NO:1 編碼的多肽序列(GenBank登錄號(hào) Y00716 [SEQ ID NO:2]) ?1231個(gè)氨基酸的因子H多肽包括18個(gè)氨基酸的N端信號(hào)肽。
[0081]圖8顯示HFLl——人因子H截短形式的參照形式的1658堿基核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)X07523 [SEQ ID NO:3])。ATG起始密碼子開(kāi)始于第74位核苷酸，TGA終止密碼子終止于第1423位核苷酸。
[0082]圖9顯示SEQ ID NO:3編碼的HFLl參照形式的多肽序列(GenBank登錄號(hào)X07523[SEQ ID NO:4])。449個(gè)氨基酸的HFLl多肽包括18個(gè)氨基酸的N端信號(hào)肽。
[0083]圖10顯示示例性人因子H保護(hù)性變體的多肽序列[SEQ ID NO:5]。這種保護(hù)性變體因子H多肽的第62位氨基酸為異亮氨酸，第402位氨基酸為酪氨酸(以粗體標(biāo)出)。
[0084]圖11顯示示例性HFLl保護(hù)性變體——人因子H的截短形式的多肽序列(SEQ IDNO:6)。這種保護(hù)性變體截短的因子H多肽的第62位氨基酸為異亮氨酸，第402位氨基酸為酪氨酸(以粗體標(biāo)出)。
[0085]圖12顯示如(A)光學(xué)顯微鏡和(B)電子顯微鏡所見(jiàn)，具有密集膜內(nèi)沉積的顯著的腎小球細(xì)胞增多，其在MPGNII患者中引起毛細(xì)血管壁增厚。沉積可在腎小球基底膜(GBM)的致密板中形成分節(jié)的、間斷或彌散模式。通過(guò)光學(xué)顯微鏡可見(jiàn)，它們是嗜酸性并為折射體，用過(guò)碘酸希夫明亮染色并為高滲的，這解釋了其電子密度外觀(A)。甚至通過(guò)電子顯微鏡可見(jiàn)，沉積缺乏亞結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為非常暗的均勻斑點(diǎn)(B)。致密沉積的準(zhǔn)確組成仍然未知(條帶，5 μ m)。
[0086]圖13是顯示補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)旁路途徑的激活和調(diào)節(jié)的圖，所述補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)在AMD和MPGNII患者中系統(tǒng)性高水平激活。補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的旁路途徑在MPGNII/DDD患者中系統(tǒng)性高水平激活。正常情況下，自發(fā)的水解(稱為tick-over)過(guò)程低水平地持續(xù)激活C3。C3水解與圖上部顯示的大的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化相關(guān)。該構(gòu)象變化使C3 (H20)與C3b(C3的切割產(chǎn)物)類(lèi)似。起始轉(zhuǎn)化酶C3 (H20)Bb激活C3以形成C3b。盡管C3b具有短暫的半衰期，如果其與IgG、細(xì)胞或基底膜結(jié)合，則可被保護(hù)免于立即失活。(C3b)2-1gG復(fù)合物在流體相中形成，并與備解素(P)結(jié)合，這促進(jìn)了因子B的結(jié)合和C3bBb的產(chǎn)生，C3bBb為旁路途徑的轉(zhuǎn)化酶，其在此處顯示為Bb(C3b)2-1gG-備解素復(fù)合物。擴(kuò)增環(huán)以箭頭顯示。C3NeF延長(zhǎng)了 C3轉(zhuǎn)化酶的半衰期，在插圖中顯示。降解C3轉(zhuǎn)化酶的一種機(jī)制是通過(guò)其與補(bǔ)體因子H(CFH)的相互作用，在底部右側(cè)顯示為fH。因子H的缺乏和突變與MPGN II/DDD相關(guān)。
[0087]圖14為顯示補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)子(RCA)基因簇在染色體lq32上的組構(gòu)以及已知為補(bǔ)體因子 H (CFH)、因子 H 樣 I (CFHLl)和因子 H 相關(guān) 1、2、3、4 和 5 (CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)中短共有重復(fù)序列(SCR)的約60個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域的排列的圖。CFH具有20個(gè)SCR。已經(jīng)確定了這些SCR中一些的相互作用配偶體，在右上方顯示(CRP - C反應(yīng)蛋白質(zhì)；Hep，肝素)。補(bǔ)體因子H樣I(CFHLl)是CFH的剪接異構(gòu)體，而補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白質(zhì)1-5 (CFHR1-5)各由單獨(dú)的基因編碼(CFHR1-5)。CFHR1-5的SCR與CFH中的一些SCR相似，以橢圓中的數(shù)字顯示。例如，CFHR5具有9個(gè)SCR，前兩個(gè)與因子H的SCR6和7相似，因此具有CRP和肝素結(jié)合特性。CFHR5的SCR5-7在相應(yīng)橢圓中具有數(shù)字12 — 14，因?yàn)檫@些SCR與因子H的SCR12 - 14相似，并具有C3b和肝素結(jié)合特性。
[0088]圖15顯示連鎖不平衡曲線，表明A307A和Y402H在因子H中連鎖不平衡，一 249T>C和-20T>C在CFHR5中連鎖不平衡。
[0089]圖16顯示人CFHR5參照形式的2821個(gè)堿基的核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)AF295327[SEQ ID N0:7])。ATG起始密碼子開(kāi)始于第94位核苷酸，TGA終止密碼子終止于第1803位核苷酸。
[0090]圖17 顯示 SEQ ID NO:7 編碼的多肽序列(GenBank 登錄號(hào) AAK15619 [SEQ ID NO:8])。569個(gè)氨基酸的CFHR5多肽包括18個(gè)氨基酸的N端信號(hào)肽。
[0091]圖18顯不CFH和 因子H相關(guān)蛋白質(zhì)的基因中的基因組復(fù)制。外顯子以垂直線標(biāo)出。以相同字母標(biāo)出的區(qū)域(如A，A’和A")具有基本相同的序列。
[0092]發(fā)明詳述[0093]1.引言
[0094]本發(fā)明提供由因子H基因中和因子H相關(guān)基因如因子H相關(guān)5基因中多種變異組成的多態(tài)性和單元型的集合。這些多態(tài)性和單元型與年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)和其他因子H相關(guān)病癥相關(guān)。這些多態(tài)性和單元型中的某些導(dǎo)致變體因子H多肽。對(duì)這些和其他多態(tài)性和多態(tài)性組(如單元型)的檢測(cè)可用于設(shè)計(jì)和進(jìn)行AMD的診斷測(cè)定?？梢酝ㄟ^(guò)核酸分析、通過(guò)因子H編碼序列所編碼的多肽(包括剪接變體編碼的多肽)的分析或通過(guò)本領(lǐng)域已知的其他方法檢測(cè)多態(tài)性和多態(tài)性組。分析這類(lèi)多態(tài)性和單元型也可用于設(shè)計(jì)AMD的預(yù)防和治療方案。
[0095]因 子H是多功能蛋白質(zhì)，發(fā)揮補(bǔ)體系統(tǒng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)子的功能。參閱Zipfel，2001, " Factor H and disease:a complement regulator affects vital bodyfunctions" Semin Thromb Hemost.27:191-9。因子 H 蛋白質(zhì)活性包括:(I)與 C 反應(yīng)蛋白質(zhì)(CRP)結(jié)合，⑵與C3b結(jié)合，(3)與肝素結(jié)合，⑷與唾液酸結(jié)合，(5)與內(nèi)皮細(xì)胞表面結(jié)合，(6)與細(xì)胞整聯(lián)蛋白質(zhì)受體結(jié)合，(7)與病原體(包括微生物)結(jié)合(見(jiàn)圖3)和(8)C3b輔因子活性。因子H基因稱為HFl、Cra和HF，位于人染色體1，位置lq32。lq32特定基因座含有大量補(bǔ)體途徑相關(guān)基因。這些基因中的一組稱為補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)子(RCA)基因簇，含有編碼因子H、五種因子H—相關(guān)基因(分別為FHR — 1、FHR — 2、FHR — 3、FHR-4和FHR - 5或者CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)的基因，以及編碼凝結(jié)因子X(jué)III β亞基的基因。因子H和因子H相關(guān)基因幾乎完全由短共有重復(fù)序列(SCR)組成。因子H和FHLl 分別由 SCRl — 20 和 I — 7 組成。FHR — 1、FHR — 2、FHR — 3、FHR-4 和 FHR — 5 分別由5、4、5、5和8個(gè)SCR組成(見(jiàn)圖14)。基因的順序從著絲粒到端粒為FH/FHL1、FHR_3、FHR — 1、FHR-4、FHR — 2 和 FHR — 5。
[0096]因子H基因
[0097]已經(jīng)確定了人因子H cDNA的參照形式(SEQ ID NO:1)(參閱Ripoche等，1988，Biochem J249:593 — 602)和基因組序列。因子H cDNA編碼表觀分子量155kDa的長(zhǎng)度為1231個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO:2)。存在稱為FHL — I (也稱為HFLl或CFHT)的因子H替代性剪接形式。FHL — I (SEQ ID NO:3)基本對(duì)應(yīng)于因子H的外顯子I至9 (參閱Ripoche 等，1988，Biochem J249:593 — 602)。FHLIcDNA 編碼表觀分子量 45 — 50kDA 的長(zhǎng)度為449個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO:4)。Hll和FHLl的前445個(gè)氨基酸相同，F(xiàn)HLl具有獨(dú)特的C端4個(gè)氨基酸(外顯子10A)。替代外顯子IOA位于外顯子9與外顯子10之間的內(nèi)含子中。人因子H和FHLl的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)分別以登錄號(hào)Y00716和X07523見(jiàn)于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。人因子H cDNA參照形式的3926堿基的核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)Y00716[SEQ ID NO:1])示于圖6，SEQ ID NO:1編碼的多肽序列(GenBank登錄號(hào)Y00716[SEQ ID NO:2])示于圖7。人因子H的截短形式——HFLl參照形式的1658個(gè)堿基的核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)X07523 [SEQ ID NO:3])示于圖8，SEQ ID NO:3編碼的多肽序列(GenBank登錄號(hào)X07523 [SEQ ID NO:4])示于圖9。因子H基因序列(長(zhǎng)度為150626個(gè)堿基)以GenBank登錄號(hào)AL049744可見(jiàn)。因子H啟動(dòng)子位于因子H基因編碼區(qū)的5’。
[0098]FHR — I 基因
[0099]FHR-1 基因也稱為 CHFR1、CFHL1、CFHL、FHR1 和 HFL1。已經(jīng)確定了人 HFR — IcDNA的參照形式(參閱 Estaller 等，1991，J Immunol.146:3190 — 3196)和基因組序列。FHR —IcDNA編碼長(zhǎng)度為330個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)計(jì)分子量為39kDa。人FHR — I的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)以登錄號(hào)M65292見(jiàn)于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。FHR — I基因序列以GenBank登錄號(hào)AL049741可見(jiàn)。
[0100]FHR—2 基因
[0101]FHR - 2 基因也稱為 CHFR2、CFHL2、FHR2 和 HFL3。已經(jīng)確定了人 HFR — 2cDNA 的參照形式(參閱 Strausberg 等，Proc.Natl.Acad.Sci 美國(guó) 99: 16899 一 16903)和基因組序列。FHR - 2cDNA編碼長(zhǎng)度為270個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)計(jì)分子量為31kDa。人FHR-2的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)以登錄號(hào)BC022283見(jiàn)于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。FHR — 2基因序列以GenBank登錄號(hào)AL139418可見(jiàn)。
[0102]FHR—3 基因
[0103]FHR - 3 基因也稱為 CHFR3、CFHL3、FHR3 和 HFL4。已經(jīng)確定了人 HFR — 3cDNA 的參照形式(參閱 Strausberg 等，Proc.Natl.Acad.Sci 美國(guó) 99: 16899 一 16903)和基因組序列。FHR - 3cDNA編碼長(zhǎng)度為330個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)計(jì)分子量為38kDa。人FHR-3的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)以登錄號(hào)BC058009見(jiàn)于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。FHR — 3基因序列以GenBank登錄號(hào)AL049741可見(jiàn)。
[0104]H1R-4 基因
[0105]FHR-4基因也稱為CHFR4、CFHL4和FHR4。已經(jīng)測(cè)定了人HFR_4cDNA的參照形式(參閱 Skerka 等，1991，J.Biol.Chem.272:5627 — 5634)和基因組序列。FHR_4cDNA 編碼長(zhǎng)度為331個(gè)氨基酸的 多肽，預(yù)計(jì)分子量為38kDa。人FHR-4的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)以登錄號(hào)X98337見(jiàn)于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。FHR-4基因序列以GenBank登錄號(hào)AF190816 (5，末端)、AL139418(3’ 末端)和 BX248415 可見(jiàn)。
[0106]H1R-5 基因
[0107]FHR-5基因也稱為CHFR5、CFHL5和FHR5。已經(jīng)確定了人CHFR_5cDNA的參照形式(SEQ ID NO:83)(參閱 McRae 等，2001，J.Biol.Chem.276:6747 — 6754)和基因組序列。CFHR5cDNA編碼長(zhǎng)度為569個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO:8)，表觀分子量為65kDa。人CFHR5的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)以登錄號(hào)AF295327見(jiàn)于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。人CFHR5參照形式的2821堿基的核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)AF295327 [SEQ ID NO:7])示于圖16，SEQID NO:7 編碼的多肽序列(GenBank 登錄號(hào) AAK15619[SEQ ID NO:8])示于圖 17。CFHR-5基因序列以GenBank登錄號(hào)AL139418 (5，末端)、AL353809 (3，末端)可見(jiàn)。FHR-5啟動(dòng)子位于CFHR5基因編碼區(qū)的5’。
[0108]I1.定義
[0109]提供以下定義以幫助理解本發(fā)明。除非另外指明，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)、注釋和其他科學(xué)或醫(yī)學(xué)術(shù)語(yǔ)或命名法具有醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的意義。在一些情況下，為了清楚和/或易于參考起見(jiàn)，本文定義了具有普遍理解意義的術(shù)語(yǔ)，不應(yīng)假定本文中這些定義的內(nèi)容代表與本領(lǐng)域一般理解相比存在的顯著差異。
[0110]“核酸”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”是任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合形式，可以是DNA或RNA，并且可以是單鏈或雙鏈。核酸可包括啟動(dòng)子或其他調(diào)節(jié)序列。寡核苷酸基本通過(guò)合成的手段制備。核酸包括跨越任一多態(tài)性位點(diǎn)或位于其側(cè)翼的DNA節(jié)段或其互補(bǔ)序列，所示多態(tài)性位點(diǎn)示于表1A、表1B和/或1C，或者已知在因子H基因中。節(jié)段通常在5至100個(gè)連續(xù)堿基之間，范圍經(jīng)常從下限5、10、12、15、20或25個(gè)核苷酸至上限10、15、20、25、30、50或 100 個(gè)核苷酸(其中上限大于下限)。5-10、5-20、10-20、12 — 30、15-30、10-50、20-50或20-100之間的核酸是常見(jiàn)的。多態(tài)性位點(diǎn)可以在節(jié)段內(nèi)的任何位置出現(xiàn)。提到雙鏈核酸中的一條鏈的序列也定義了其互補(bǔ)鏈，除非本文中另外明確說(shuō)明，提到核酸的一條鏈也指其互補(bǔ)物。對(duì)于某些應(yīng)用，可以修飾核酸(如RNA)以提高胞內(nèi)穩(wěn)定性和半衰期?？赡艿男揎棸ǖ粌H限于在分子骨架中使用硫代磷酸酯或2’ -O -甲基而不是磷酸二酯酶鍵。修飾的核酸包括肽核酸(PNA)和具有內(nèi)源性內(nèi)切核酸酶不易識(shí)別的非常規(guī)堿基如肌苷、queosine和wybutosine以及腺嘌呤、胞嘧唳、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧唳和尿嘧唳的乙?；?、甲基一、硫代一及類(lèi)似修飾形式的核酸。
[0111]“雜交探針”是能以堿基特異性方式與核酸互補(bǔ)鏈結(jié)合的核酸。此類(lèi)探針包括核酸和肽核酸(Nielsen等，1991)?？梢栽诒绢I(lǐng)域已知的嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。例如，參閱如 Berger 和 Kimmel (1987)Methods In Enzymology, 152 卷:Guide To Molecular CloningTechniques,San Diego:Academic Press,Inc.;Sambrook 等，(1989)Molecular Cloning:Aaboratory Manual,第 2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory ;Sambook(2001)第 3版；Rychlik，W.和 Rhoads，R.E.，1989，Nucl.Acids Res.17,8543 ；Mueller,P.R.等(1993)In Current Protocols in Molecular Biologyl5.5, Greene Publishing Associates,Inc.和 John Wiley 和 Sons, New York ;以及 Anderson 和 Young, Quantitative FilterHybridization in Nucleic Acid Hybridization (1985))。本文使用的術(shù)語(yǔ)“探針”包括引物。探針和引物有時(shí)指“寡核苷酸”。
[0112]術(shù)語(yǔ)“引物”指能在適當(dāng)條件下、在適當(dāng)?shù)木彌_液和適當(dāng)?shù)臏囟认伦鳛槟０逯笇?dǎo)的DNA合成的起始點(diǎn)的單鏈寡核苷酸。引物的適當(dāng)長(zhǎng)度取決于引物的預(yù)期用途，但范圍一般從15至30個(gè)核苷酸。引物序列不需要與模板精確互補(bǔ)，但必須充分互補(bǔ)以與模板雜交。術(shù)語(yǔ)“引物位點(diǎn)”指靶DNA中 與引物雜交的區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“引物對(duì)”指一組引物，包括與待擴(kuò)增DNA序列的5’末端雜交的5’上游引物以及與待擴(kuò)增序列3’末端互補(bǔ)序列雜交的3’下游引物。
[0113]用于短探針和引物的示例性雜交條件為所計(jì)算的Tm下約5至12°C。計(jì)算Tm的公式是已知的，包括對(duì)于小于14個(gè)堿基的寡聚物并假定反應(yīng)在50mM —價(jià)陽(yáng)離子存在下進(jìn)行時(shí)的Tm = 4 0C X (引物中的G和C數(shù))+2°C X (引物中的A和T數(shù))。對(duì)于較長(zhǎng)的寡聚物，可以使用以下公式:Tm = 64.9°C +41°C X (引物中的G和C數(shù)一16.4)/N，其中N為引物長(zhǎng)度。另一普遍使用的公式考慮了反應(yīng)的鹽濃度(Rychlik,同上，Sambrook,同上，Mueller,同上):Tm = 81.5°C +16.6°C X (logl0[Na+] + [K+])+0.41°C X (% GC) — 675/N，其中 N 為寡聚物中的核苷酸數(shù)。上述公式提供了某些應(yīng)用的起點(diǎn)，然而，特定探針和引物的設(shè)可以考慮其他或不同的因素。設(shè)計(jì)用于本發(fā)明方法的探針和引物的方法為本領(lǐng)域所熟知。
[0114]術(shù)語(yǔ)“危險(xiǎn)”、“保護(hù)性”和“中性”用于描述變異、SNP、單元型、二倍型和特征為這些變異模式的基因所編碼的群體中的蛋白質(zhì)。危險(xiǎn)單元型是基因(本文中為因子H或因子H相關(guān)基因)的等位基因形式，其包含至少一個(gè)與發(fā)生AMD的危險(xiǎn)提高相關(guān)的變體多態(tài)性，優(yōu)選一組變體多態(tài)性。涉及因子H或因子H相關(guān)基因使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“變體”指核苷酸序列，其中該序列與種群(本文中為美國(guó)歐裔血統(tǒng)的人)中最常見(jiàn)的序列不同。變體多態(tài)性可以在基因的編碼或非編碼部分中。危險(xiǎn)因子H單元型的實(shí)例為編碼氨基酸402處的組氨酸和/或氨基酸1210處的半胱氨酸的因子H基因等位基因。危險(xiǎn)單元型可以是天然存在的，或者通過(guò)重組技術(shù)合成。保護(hù)性單元型是基因(本文中為因子H或因子H相關(guān)基因)的等位基因形式，其包含至少一個(gè)與發(fā)生AMD的危險(xiǎn)降低相關(guān)的變體多態(tài)性，優(yōu)選一組多態(tài)性。例如，一種保護(hù)性因子H單元型具有編碼氨基酸62處為異亮氨酸的因子H基因。保護(hù)性單元型可以是天然存在的，或者通過(guò)重組技術(shù)合成。中性單元型是基因(本文中為因子H或因子H相關(guān)基因)的等位基因形式，其不包含種群或人種群中與發(fā)生AMD的危險(xiǎn)提高或降低相關(guān)的變體多態(tài)性。從以下的討論中顯然可見(jiàn)，當(dāng)施用于需要治療或預(yù)防AMD或其他病癥的患者時(shí)，“中性”單元型編碼的蛋白質(zhì)可以是保護(hù)性的。即施用于例如患AMD或有發(fā)生AMD的受試者時(shí)，CFH或CFHR5的“中性”和“保護(hù)性”形式可提供治療益處，從而“保護(hù)”受試者免于疾病。
[0115]術(shù)語(yǔ)“野生型”指核酸或多肽，其中序列為種群(本文中為歐洲一美洲血統(tǒng)的人)中的普及形式(約40%普及，見(jiàn)圖5)。就本文公開(kāi)內(nèi)容的目的而言，“野生型”因子H蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO: 2的序列(圖7)，只是第402位氨基酸為酪氨酸(Y ; [SEQ ID NO:337])。就本文公開(kāi)內(nèi)容的目的而言，編碼野生型因子H蛋白質(zhì)的因子H基因具有SEQ ID N0:1的序列(圖6)，只是開(kāi)始于堿基1277的密碼子(對(duì)應(yīng)于第402位氨基酸)編碼酪氨酸(TAT [SEQID NO:336])。
[0116]涉及因子H或因子H相關(guān)多肽時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)“變體”指多肽，其中序列在改變所編碼多肽的氨基酸序列的位置上不同于正?；蛞吧托蛄?。例如，因子H基因核苷酸序列中的一些變異或取代改變密碼子，從而編碼不同的氨基酸(例如但不僅限于在一個(gè)或多個(gè)I62V、Y402H、D936E中的替代等位基因)，導(dǎo)致變體多肽。變體多肽可與危險(xiǎn)相關(guān)(如第402位為組氨酸)、與保護(hù)相 關(guān)(如第62位為異亮氨酸)，或者可以由中性單元型編碼(如936位為天冬氨酸)。變體CFHR5多肽可與危險(xiǎn)相關(guān)(如第46位為絲氨酸)、與保護(hù)相關(guān)，或者可以是中性的。
[0117]涉及因子H多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“參照”指氨基酸序列與Ripoche等人，1988, BiochemJ.249 =593-602 所述的全長(zhǎng) O7Hl，SEQ ID NO:2)或截短(FHL1，SEQ ID NO:4)人因子 H 序列相同的多肽。涉及CFHR5多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“參照”指氨基酸序列與McRae等人，2001，J.Biol.Chem.276:6747-6754所述全長(zhǎng)人CFHR5 (SEQ ID NO:8)的序列相同的多肽。任意地將第一種鑒定的等位基因形式稱為參照形式或等位基因；其他等位基因形式稱為替代或變體等位基因。野生型和變體形式可以與參照形式具有實(shí)質(zhì)的序列同一性(例如，野生型或變體形式可以在至少90%的野生型或變體中氨基酸位置上與參照形式相同，有時(shí)在至少95%的位置、有時(shí)至少98%或99%的位置上與參照形式相同)。變體可以由于移碼突變或剪接變異而在某些蛋白質(zhì)區(qū)域中與參照形式不同。
[0118]術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性”指種群中存在兩種或更多遺傳確定的替代序列或等位基因?！岸鄳B(tài)性位點(diǎn)”是發(fā)生序列趨異的基因座。多態(tài)性位點(diǎn)具有至少兩種等位基因。雙等位基因多態(tài)性具有兩種等位基因。三等位基因多態(tài)性具有三種等位基因。二倍體生物的等位基因形式可以是純合或雜合的。多態(tài)性位點(diǎn)可以小至一個(gè)堿基對(duì)。多態(tài)性位點(diǎn)的實(shí)例包括:限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP);可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR);高變區(qū)；小衛(wèi)星；雙核苷酸重復(fù)；三核苷酸重復(fù)；四核苷酸重復(fù)和簡(jiǎn)單序列重復(fù)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性”可包括一組多態(tài)性(即單元型)。[0119]“單核苷酸多態(tài)性(SNP) ”在單核苷酸占據(jù)的多態(tài)性位點(diǎn)發(fā)生，所述位點(diǎn)是等位基因序列之間的變異位點(diǎn)。該序列之前和之后一般為高度保守的等位基因序列。SNP通常由于多態(tài)性位點(diǎn)處一個(gè)核苷酸取代另一個(gè)而產(chǎn)生。用一個(gè)嘌呤取代另一個(gè)嘌呤或者用一個(gè)嘧啶取代另一個(gè)嘧啶稱為轉(zhuǎn)換(transition)。用嘧啶取代嘌呤或相反稱為顛換(transversion)。同義SNP指編碼區(qū)中用一個(gè)核苷酸取代另一個(gè)而不改變所編碼多肽氨基酸序列。非同義SNP指編碼區(qū)中用一個(gè)核苷酸取代另一個(gè)而改變所編碼多肽氨基酸序列。SNP還可以由相對(duì)于參照等位基因的核苷酸缺失或插入而產(chǎn)生。
[0120]一“組”多態(tài)性指多于一種多態(tài)性，如表1A、表1B和/或表1C中所示或已知在因子H基因或其他基因中的至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或多于6種多態(tài)性。
[0121]術(shù)語(yǔ)“單元型”指?jìng)€(gè)體基因中一組多態(tài)性或多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因的命名。例如，“112”因子H單元型指該因子H基因在前兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)處均包含等位基因I，在第三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)處包含等位基因2?！岸缎汀睘閱卧蛯?duì)。
[0122]“分離的”核酸指是組合物中存在的優(yōu)勢(shì)種的核酸種類(lèi)。分離的指核酸從至少一種與其天然相關(guān)的化合物分離。純化的核酸包含(基于摩爾)至少約50%、80%或90%的所存在的所有大分子種類(lèi)。[0123]當(dāng)兩氨基酸序列至少約80%—致、優(yōu)選至少約90%—致、更優(yōu)選至少約95%、至少約98%—致或至少約99%—致時(shí)，認(rèn)為其具有“實(shí)質(zhì)的同一性”。一般通過(guò)確定兩序列間的最佳比對(duì)和比較兩序列來(lái)計(jì)算序列同一性百分比。可以通過(guò)觀察，或使用Smith和Waterman, 1981, Adv.App1.Math.2:482 的局部同源性算法、使用 Needleman 和 Wunsch,1970, J.Mol.Biol.48:443 的同源性比對(duì)算法、使用 Pearson 和 Lipman, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.85:2444的相似性搜索方法，通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)化的實(shí)施(例如Wisconsin Genetics 軟件包中，Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison,Wis.)使用用于氨基酸比較的默認(rèn)參數(shù)(例如用于缺口評(píng)分等)來(lái)進(jìn)行序列的最適比對(duì)。有的時(shí)候需要描述兩個(gè)序列之間關(guān)于具體長(zhǎng)度或區(qū)域的序列同一性(例如兩個(gè)序列可以被描述為在至少500堿基對(duì)的長(zhǎng)度上具有至少95%的同一性)。通常所述長(zhǎng)度可以是至少約50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個(gè)氨基酸，或是參照蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)。如果兩個(gè)氨基酸序列有1、2或3個(gè)殘基，或2-20個(gè)殘基、2-10個(gè)殘基、3_20個(gè)殘基或3 —10個(gè)殘基不同，則也認(rèn)為它們具有實(shí)質(zhì)的同一性。
[0124]“連鎖”描述了基因、等位基因、基因座或遺傳標(biāo)記由于其位于相同染色體上，所以被一起遺傳的趨勢(shì)。連鎖可通過(guò)兩個(gè)基因、等位基因、基因座或遺傳標(biāo)記之間的重組百分比測(cè)量。通常，以彼此間50厘摩(CM)以內(nèi)的距離存在的基因座是連鎖的。連鎖的標(biāo)記可存在于相同的基因或基因簇內(nèi)。“連鎖不平衡”或“等位基因關(guān)聯(lián)”是指具體的等位基因或遺傳標(biāo)記與位于鄰近染色體位點(diǎn)上特定的等位基因或遺傳標(biāo)記，以比群體中對(duì)任何具體等位基因可能估計(jì)的頻率更頻繁地優(yōu)先關(guān)聯(lián)。連鎖不平衡的標(biāo)記特別適用于檢測(cè)對(duì)疾病的易感性，即使標(biāo)記本身不引起所述疾病。
[0125]術(shù)語(yǔ)“診斷”是指確定個(gè)體是否具有發(fā)生疾病的傾向(包括有無(wú)體征或癥狀)的能力。診斷發(fā)生疾病的傾向還可被稱為“篩選”，在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)診斷和篩選可交換使用。應(yīng)當(dāng)明白具有提高的或降低的發(fā)生病癥的傾向是指相對(duì)于未患有所述病癥的群體中的個(gè)體，發(fā)生所述病癥的可能性。
[0126]II1.表格
[0127]本文涉及到的某些表格在下文實(shí)施例之后提供。提供以下描述以幫助閱讀者:
[0128]表1A-1C顯示人因子H基因多態(tài)性及其與年齡相關(guān)性黃斑變性的關(guān)聯(lián)。(IA)顯示人因子H基因中dbSNP號(hào)、定位、跨越多態(tài)性的編碼(頂部，5’到3’方向)和非編碼(底部)鏈的序列、氨基酸改變、對(duì)照和AMD病例的等位基因頻率，和ISNP的X 2與P —值。(IB)顯示人因子H基因中dbSNP號(hào)、被查詢的序列、黑猩猩因子H基因中相應(yīng)的核苷酸、定位、氨基酸改變以及引物與探針組。(IC)顯示在dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有找到的人因子H基因中定位、跨越多態(tài)性的序列、氨基酸位置和14SNP的氨基酸改變(如果有的話)。
[0129]表2顯示一組AMD病例和對(duì)照中人因子H基因中八個(gè)SNP的單元型分析。
[0130]表3顯示人因子H基因中六個(gè)SNP的單元型分析以及它們與AMD的關(guān)聯(lián)。
[0131]表4顯示11個(gè)人因子H基因SNP與年齡相關(guān)性黃斑變性的關(guān)聯(lián)。
[0132]表5顯示用于人因子H的SSCP、DHPLC和DNA測(cè)序分析的引物。
[0133]表6顯示AMD患者和對(duì)照的基因分型數(shù)據(jù)。
[0134]表7顯示多個(gè)人種群中危險(xiǎn)單元型的頻率。
[0135]表8顯示若干 種因子H的二倍型。指出了普遍危險(xiǎn)和保護(hù)性二倍型。
[0136]表9顯示用于擴(kuò)增因子H編碼序列的引物序列。
[0137]表10顯示用于擴(kuò)增CFHR5編碼序列的引物序列。
[0138]表11顯示22個(gè)MPGNII患者中因子H SNP分析。
[0139]表12顯示22個(gè)MPGNII患者和AMD —陰性的、人種相匹配的對(duì)照中因子H SNP頻率的比較。
[0140]表13列出與MPGNII相關(guān)聯(lián)的因子H SNP及其相關(guān)的SCR。
[0141]表14顯示22個(gè)MPGNII患者中CFHR5SNP的分析。
[0142]表15顯示22個(gè)MPGNII患者和AMD —陰性的、人種相匹配的對(duì)照中CFHR5SNP頻率的比較。
[0143]表16顯示用于檢測(cè)因子H基因中多態(tài)性的示例性的等位基因特異的探針(16A)和引物(16B)。
[0144]IV.補(bǔ)體因子H多態(tài)性
[0145]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供與下述發(fā)現(xiàn)相關(guān)的新的診斷、治療和藥物篩選方法，所述發(fā)現(xiàn)為:補(bǔ)體因子H(HFl)基因中的多態(tài)位點(diǎn)與對(duì)AMD的易感性和AMD的發(fā)展有關(guān)。
[0146]與AMD相關(guān)的因子H多態(tài)性如實(shí)施例1所述被鑒定，其根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案使用SSCP分析、DHPLC分析和直接測(cè)序法檢查因子H(包括外顯子10A，其被轉(zhuǎn)錄為因子H的同種型FHLI)的編碼區(qū)和鄰近內(nèi)含子區(qū)域的變體。剩余的多態(tài)性通過(guò)5’核酸酶(Taqman，ABI)方法分型。如所述的進(jìn)行Taqman基因分型和關(guān)聯(lián)分析(Gold等,2004)。使用Mac Vector軟件設(shè)計(jì)用于SSCP和DNA測(cè)序分析的引物，以擴(kuò)增各外顯子及其鄰近的內(nèi)含子區(qū)域。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案通過(guò)SSCP和DHPLC，針對(duì)序列變異篩選PCR得到的擴(kuò)增子。通過(guò)SSCP和DHPLC檢測(cè)到的所有改變根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案通過(guò)雙向測(cè)序證實(shí)。使用X方(X2)和Fisher' s精確檢測(cè)(P值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0147]使用兩組獨(dú)立的AMD病例和年齡匹配的對(duì)照。所有參與的個(gè)體都是美國(guó)歐裔血統(tǒng)、大于60歲年齡并依照知情同意在IRB-批準(zhǔn)的方案下招募。這些組由以下組成:來(lái)自The University of 1wa的352名患有臨床上被證明的AMD的無(wú)關(guān)聯(lián)的患者(平均年齡79.5±7.8歲)和113名無(wú)關(guān)聯(lián)的對(duì)照患者(平均年齡78.4±7.4歲；通過(guò)年齡和人種匹配)，和來(lái)自Columbia University的550名患有臨床上被證明的AMD的無(wú)關(guān)聯(lián)的患者(平均年齡71.32±8.9)和275名無(wú)關(guān)聯(lián)的、通過(guò)年齡和人種匹配的對(duì)照(平均年齡68.84±8.6歲)。由視網(wǎng)膜研究員訓(xùn)練的眼科醫(yī)師通過(guò)間接檢眼鏡檢查法和裂隙燈顯微鏡檢查法來(lái)檢查患者。
[0148]Fundas照片根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的、國(guó)際分類(lèi)體系(Bird等，1995)分級(jí)。如果對(duì)照患者未顯示任何可辨別的黃斑疾病體征或不具有已知的AMD家族史，則將他們選擇并包括。AMD患者根據(jù)他們參與研究時(shí)最嚴(yán)重的眼分類(lèi)被細(xì)分為表型類(lèi)別:早期AMD (ARM)、地圖樣萎縮(GA)和滲出性(CNV) AMD。The University of 1wa的ARM和GA病例被進(jìn)一步細(xì)分為不同的表型(單獨(dú)的RPE改變、>10的斑狀硬玻璃疣、斑狀軟玻璃疣、BB (表皮)玻璃疣、PED、“Cherokee”萎縮、半島狀地圖樣萎縮(peninsular geographic atrophy)和框式地圖樣萎縮(pattern geographic atrophy))。所有病例的最早的可被證明的表型也被記錄并用于分析。
[0149]如表1A中所示，在兩個(gè)獨(dú)立組的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)因子H基因多態(tài)位點(diǎn)與AMD的高度顯著的關(guān)聯(lián)，所述兩個(gè)獨(dú)立組一共包括約900個(gè)AMD病例和400個(gè)匹配的對(duì)照。表1A-1B中列出十六(16)個(gè)因子H基因中的多態(tài)性。其中有十二(12)個(gè)在SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP)中發(fā)現(xiàn)，所述數(shù)據(jù)庫(kù)可在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)找到。dbSNP是人因子H基因中SNP的集合，所述SNP分散于因子H基因的22個(gè)編碼外顯子中，分散于因子H基因的啟動(dòng)子、5’未翻譯區(qū)、內(nèi)含子和3’未翻譯區(qū)中。以下列出在dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中找到的人因子H基因中379個(gè)SNP的登錄號(hào)。這些SNP可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0150]表A
【權(quán)利要求】
1.分離的補(bǔ)體因子H多肽在制備預(yù)防或治療年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的用途，其中所述補(bǔ)體因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位殘基對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的酪氨酸。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述補(bǔ)體因子H多肽包含SEQID NO:2第62位殘基對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的異亮氨酸。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述補(bǔ)體因子H多肽用于通過(guò)眼內(nèi)注射施用。
4.表達(dá)補(bǔ)體因子H多肽的分離的細(xì)胞在制備預(yù)防或治療年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的用途，其中所述補(bǔ)體因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位殘基對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的酪氨酸。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述補(bǔ)體因子H多肽包含SEQID NO: 2第62位殘基對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的異亮氨酸。
6.分離的多核苷酸在制備預(yù)防或治療年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的用途，所述多核苷酸包含編碼補(bǔ)體因子H多肽的序列，所述序列與啟動(dòng)子有效連接，其中所述補(bǔ)體因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位殘基對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的酪氨酸。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述補(bǔ)體因子H多肽包含SEQID NO: 2第62位殘基對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的異亮氨酸。
8.權(quán)利要求6或7的用途，其中所述啟動(dòng)子對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮具有特異性。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的用途，其中所述補(bǔ)體因子H多肽的氨基酸序列是SEQIDNO:2，或是由SEQ ID NO:2經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的序列，且該序列具有與補(bǔ)體因子H多肽相同的功能，前提是第402位對(duì)應(yīng)的殘基是酪氨酸。
10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的用途，其中所述補(bǔ)體因子H多肽包含SEQID NO: 5或SEQID NO:6的殘基19之前的氨基酸序列。
11.與補(bǔ)體因子H多肽的至少一部分核苷酸序列互補(bǔ)的分離的反義RNA、核酶或短干擾RNA在制備治療或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的用途。
12.單克隆抗體在制備治療或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的用途，所述單克隆抗體與第402位為組氨酸的補(bǔ)體因子H多肽結(jié)合，但不與第402位為酪氨酸的補(bǔ)體因子H多肽結(jié)合。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物給予診斷患有年齡相關(guān)性黃斑變性的患者，或給予鑒定具有與年齡相關(guān)性黃斑變性危險(xiǎn)相關(guān)的補(bǔ)體因子H基因單元型的患者。
14.藥物組合物，其包含重組補(bǔ)體因子H多肽和可藥用賦形劑，其中重組補(bǔ)體因子H多肽包含第62位的異亮氨酸和第402位的酪氨酸，并且其中所述組合物不含病原體，并且適于對(duì)人類(lèi)患者施用。
15.藥物組合物，其包含重組補(bǔ)體因子H多肽和可藥用賦形劑，其中所述補(bǔ)體因子H多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:2，或是由SEQ ID NO:2經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的序列，且該序列具有與補(bǔ)體因子H多肽相同的功能，前提是第402位對(duì)應(yīng)的殘基是酪氨酸且第62位對(duì)應(yīng)的殘基是異亮氨酸，并且其中所述組合物不含病原體，并且適于對(duì)人類(lèi)患者施用。
16.包含抗體的藥物組合物，所述抗體與第402位為組氨酸的補(bǔ)體因子H蛋白質(zhì)結(jié)合，但不與第402位為酪氨酸的補(bǔ)體因子H蛋白質(zhì)結(jié)合。
17.藥物組合物，其包含編碼補(bǔ)體因子H多肽的基因治療載體和可藥用賦形劑，其中所述補(bǔ)體因子 H多肽包含第62位的異亮氨酸和第402位的酪氨酸。
18.表達(dá)重組人補(bǔ)體因子H的分離的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中所述重組人補(bǔ)體因子H包含第62位的異亮氨酸和第402位的酪氨酸。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103920142SQ201410180974
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2005年2月14日
【發(fā)明者】G·S·哈格曼, R·J·史密斯 申請(qǐng)人:愛(ài)荷華大學(xué)研究基金會(huì)