一種海洋微生物來源的低溫偏甘油酯脂肪酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種海洋微生物來源的低溫偏甘油酯脂肪酶及其應(yīng)用，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。編碼上述偏甘油酯脂肪酶的基因序列如SEQID?NO:1所示。本發(fā)明獲得中性脂肪酶，在pH7.0具有最適酶活性，其對橄欖油的水解反應(yīng)中，最適溫度為40℃；對大豆卵磷脂為底物的水解反應(yīng)中，最適反應(yīng)溫度為30℃。MAJ1對茶油的水解反應(yīng)表明其是一個1,3位選擇性的偏甘油酯脂肪酶。同時該脂肪酶在20℃～30℃處理3小時仍然具有大于95％的酶相對剩余活性，可以應(yīng)用于去除油脂中偏甘油酯。
【專利說明】一種海洋微生物來源的低溫偏甘油酯脂肪酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體的說，涉及一種海洋微生物來源的低溫偏甘油酯脂肪酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(E.C.3.1.1.3)，也稱為三?；视王；饷福軌虼呋视腿ニ?，生成的產(chǎn)物包括甘油二酯、甘油單酯、脂肪酸和甘油。偏甘油酯脂肪酶是指對?；视吞兼湐?shù)量具有催化選擇性的一類脂肪酶，它們對甘油三酯并沒有催化水解活力，僅對甘油二酯和/或甘油單酯具有活力。偏甘油酯脂肪酶主要有兩類:甘油單酯-甘油二酯脂肪酶和甘油單酯脂肪酶。偏甘油酯脂肪酶在飼料添加劑、食品與營養(yǎng)，農(nóng)業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)都展現(xiàn)出誘人的應(yīng)用前景。在油脂加工領(lǐng)域，偏甘油酯脂肪酶可用于制備高純度的甘油酯產(chǎn)品。因此，新型偏甘油酯脂肪酶的開發(fā)為高效制備甘油二酯和開發(fā)高純度的甘油二酯生產(chǎn)工藝提供現(xiàn)實意義。
[0003]目前已知微生物來源的偏甘油酯脂肪酶非常有限。另外，國內(nèi)開發(fā)的脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)并不能適應(yīng)新的使用需求。目前使用的脂肪酶大多都是中溫酶(其最適溫度基本都在50°C左右)，而在食品、洗滌、制藥、脂類加工、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域中，卻需要低溫脂肪酶的參與來進(jìn)行。因此，開發(fā)低溫酶獲得新型有工業(yè)價值的偏甘油酯脂肪酶有潛在的需要。利用生活在高鹽度、高壓、低營養(yǎng)和低溫等的所謂生命極限環(huán)境下的微生物，篩選新型低溫酶成為尋找符合工業(yè)化要求的脂肪酶的主要途徑之一。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種對偏甘油酯水解活性高的海洋微生物來源的低溫偏甘油酯脂肪酶，可以應(yīng)用于選擇性去除油脂產(chǎn)品中的偏甘油酯，以使其滿足工業(yè)上的需要。
[0005]本發(fā)明的第一個方面公開了一種來自海洋微生物的新型偏甘油酯脂肪酶。
[0006]本發(fā)明的另一個方面，提供了一種編碼上述脂肪酶的優(yōu)化的核酸分子，獲得在畢赤酵母高表達(dá)的偏甘油酯脂肪酶。
[0007]本發(fā)明的第三個方面，提供了一種載體，其包含上述多核苷酸。
[0008]本發(fā)明的第四個方面，提供了一種細(xì)胞，其包含上述載體，或其基因組中整合有上述多核苷酸。
[0009]本發(fā)明的第五個方面，提供了上述脂肪酶的用途，用于催化偏甘油酯水解反應(yīng)。
[0010]本發(fā)明的第六個方面，提供了一種生產(chǎn)上述脂肪酶的方法。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下:
[0012]一種海洋微生物來源的低溫偏甘油酯脂肪酶，該酶是對兩面神菌(Janibactersp.HTCC2649)偏甘油酯脂肪酶基因序列進(jìn)行優(yōu)化得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所
/Jn ο
[0013]一種偏甘油酯脂肪酶基因，序列如SEQ ID NO:1所示。[0014]—種包含上述基因的表達(dá)載體。
[0015]一種細(xì)胞，包含上述表達(dá)載體，或其基因組中整合有上述脂肪酶基因。
[0016]一種生產(chǎn)上述脂肪酶的方法，包括:培養(yǎng)上述細(xì)胞，從培養(yǎng)物中分離出表達(dá)產(chǎn)物。
[0017]一種偏甘油酯脂肪酶重組菌株的制備方法，包括如下步驟:
[0018](I)制備偏甘油酯脂肪酶表達(dá)質(zhì)粒:
[0019]a.人工合成權(quán)利要求2的基因序列；
[0020]b.將上述擴增基因PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化后，限制性內(nèi)切酶Kpn I和SalI分別對純化的基因片段和質(zhì)粒PGAPZaA進(jìn)行雙酶切消化，連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，得到脂肪酶表達(dá)質(zhì)粒； [0021](2)利用表達(dá)質(zhì)粒制備重組菌株:
[0022]a.將步驟⑴的脂肪酶表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bln I線性化后，電轉(zhuǎn)至宿主細(xì)胞；
[0023]b.將轉(zhuǎn)化液涂布于含有100mg/ml Zeocin的YPD平板中，30°C培養(yǎng)3天后，平板上長出酵母單菌落為重組菌株。
[0024]步驟⑴所述PCR的引物序列如下:
[0025]MAJl For 5’ -TACTGGTACCGCCACCGTCGCTGCTGATCCC-3’
[0026]MAJl Rev 5， -AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3，。
[0027]步驟(2)所述宿主細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)。
[0028]上述脂肪酶用于催化甘油酯的水解或合成甘油二酯，或用于植物油精煉過程中的酶法脫膠。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0030](I)本發(fā)明獲得中性脂肪酶，在pH7.0具有最適酶活性，其對橄欖油的水解反應(yīng)中，最適溫度為40°C;對大豆卵磷脂為底物的水解反應(yīng)中，最適反應(yīng)溫度為30°C。同時該脂肪酶在20°C~30°C處理3小時仍然具有大于95%的酶相對剩余活性。因此，可以通過溫度來調(diào)節(jié)其脂肪酶和磷脂酶活性。
[0031](2)本發(fā)明所得畢赤酵母表達(dá)菌株具有良好的偏甘油酯水解活性，也是首個海洋微生物來源的低溫偏甘油酯脂肪酶，同時該酶的脂肪酶和磷脂酶活性相當(dāng)，因此，可應(yīng)用于植物油精煉過程中的酶法脫膠，也可應(yīng)用于去除油脂中的偏甘油酯。同時，作為一種低溫酶，可廣泛運用于食品、洗滌、制藥、脂類加工、環(huán)境修復(fù)等需要低溫脂肪酶參與的領(lǐng)域中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為來自兩面神菌HTCC2649的編碼脂肪酶的核酸序列MAJl及其優(yōu)化后的編碼脂肪酶的核酸序列MAJl-optimum(SEQ ID NO:1)。
[0033]圖2為兩面神菌HTCC2649來源的脂肪酶MAJl在質(zhì)粒pGAPZ a A上的重組子結(jié)構(gòu)圖。
[0034]圖3為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達(dá)兩面神菌HTCC2649來源的脂肪酶的最適反應(yīng)溫度，以溫度對相對酶活力(％)作圖。
[0035]圖4為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達(dá)兩面神菌HTCC2649來源的脂肪酶的最適反應(yīng)pH,以pH對相對酶活力(％ )作圖。[0036]圖5為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達(dá)兩面神菌HTCC2649來源的脂肪酶的熱穩(wěn)定性，以溫度對殘余酶活力(％)作圖。
[0037]圖6為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達(dá)兩面神菌HTCC2649來源的脂肪酶的pH穩(wěn)定性，以pH對殘余酶活力(％ )作圖。
[0038]圖7為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達(dá)兩面神菌HTCC2649來源的脂肪酶的溫度對脂肪酶酶活的影響。
[0039]圖8為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達(dá)兩面神菌HTCC2649來源的脂肪酶的PH對脂肪酶酶活的影響。
[0040]圖9為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達(dá)兩面神菌HTCC2649來源的脂肪酶的溫度對磷脂酶酶活的影響。
[0041]圖10為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達(dá)兩面神菌HTCC2649來源的脂肪酶的PH對磷脂酶酶活的影響。
[0042]圖11為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達(dá)兩面神菌HTCC2649來源的脂肪酶純化后樣品的SDS-PAGE電泳圖。泳道一是蛋白分子量marker，泳道二是純化后的MAJl。
[0043]圖12為脂肪酶的脂肪酸底物鏈長選擇性圖。
[0044]圖13為 脂肪酶的催化植物油水解反應(yīng)隨時間變化的圖，A為富含甘油三酯的茶油水解反應(yīng)后的各脂類組成，B為富含甘油二酯的油脂水解反應(yīng)后的各脂類組成，C為富含甘油二酯:單甘油酯(l:lv/v)的油脂水解反應(yīng)后的各脂類組成。
[0045]圖14為脂肪酶催化植物油水解的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。
【具體實施方式】
[0046]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
[0047]實施例1
[0048]偏甘油酯脂肪酶MAJl畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
[0049]根據(jù)Genbank的兩面神菌HTCC2649偏甘油脂肪酶majl基因(GenBank登錄號:WP_009776835)，委托上海生工生物工程公司利用人工合成的方法，并根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性對序列進(jìn)行優(yōu)化(序列SEQ ID NO:1)。基因合成后，利用下面引物擴增成熟肽序列，
[0050]MAJl For 5’ -TACTGGTACCGCCACCGTCGCTGCTGATCCCGTTG-3’
[0051](SEQ ID NO:3)
[0052]MAJl Rev 5’ -AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3’
[0053](SEQ ID NO:4)
[0054]PCR擴增條件-MV 5min ；94°C 20s, 53°C 30s, 72°C 80s, 25 個循環(huán)；72°C 7min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后，限制性內(nèi)切酶KpnI和Sal I分別對純化的基因片段和質(zhì)粒pGAPZ a A(購自Invitrogen)進(jìn)行雙酶切消化,連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。涂布于LB (含25ug/mlZeOCin)平板。挑取陽性克隆通過Kpn I和Sal I雙酶切鑒定及基因測序，結(jié)果表明獲得了 pGAPZ a A-MAJl表達(dá)質(zhì)粒。
[0055]實施例2[0056]脂肪酶MAJl的重組表達(dá)及純化
[0057] 將脂肪酶MAJl表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bln I線性化后，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X_33(購自Invitrogen)感受態(tài)態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化液涂布于YPD (lOOug/mLZeocin)平板，30°C培養(yǎng)3天后，挑取平板上單菌落于IOOmL YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵72小時后，離心并濃縮發(fā)酵液進(jìn)行SDS-PAGE檢測，獲得能夠表達(dá)脂肪酶MAJl陽性重組菌株。
[0058]將重組菌株接種至IOOmL YPD培養(yǎng)基中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)48-72小時后，收集發(fā)酵上清液(10, OOOrpm,離心20min,4°C )。
[0059]將MAJl重組菌株的發(fā)酵上清液用0.45 μ m的濾膜抽濾。后用IOkD膜胞(Vivaf low200, Sartorius, Germany)將發(fā)酵液置換成20mM pH7.4含30mM咪唑的憐酸鹽緩沖液，并將發(fā)酵液濃縮到大約30mL。濃縮發(fā)酵上清利用鎳金屬螯合親和層析柱(HisTrap HPcolumn, GE Healthcare),流速lmL/min,最后用20mM pH7.4含500mM咪唑的磷酸鹽緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白。利用SDS-PAGE電泳對純化的重組蛋白進(jìn)行純度鑒定(見圖11)。
[0060]實施例3
[0061]最適溫度及溫度穩(wěn)定性
[0062]溫度對MAJl脂肪酶酶活的影響:在不同溫度(5°C -50°C )條件下，采用比色法測定MAJl酶活。反應(yīng)體系包括IOOmM Na2HPO4-NaH2PO4 (pH7.0)，ImM對硝基苯酚辛酸酯(p-nitrophenol caprylate, p-NPc), 10 μ L 酶液,各溫度下反應(yīng) 5min,測定 405nm 處的吸光值0D4(i5。溫度對MAJl酶活的影響用相對酶活表示,測定的最大酶活定為100%。所有實驗重復(fù)三次。結(jié)果表明MAJl的最適反應(yīng)溫度是30°C，在25°C達(dá)到了 80%的相對酶活(見圖3)。
[0063]測定MAJl在不同溫度條件下的穩(wěn)定性時，首先將MAJl在不同的溫度(20°C、30°C和40°C )條件下溫育，分別在0.5h、lh、l.5h、2h和3h取樣，采用比色法測定其剩余酶活。溫度對MAJl穩(wěn)定性的影響用相對酶活表示，測定的最大酶活定為100%。所有實驗重復(fù)三次。結(jié)果表明MAJl在20°C -30°C處理3h后，MAJl能保持95%以上的脂肪酶酶活力。表明MAJl是一個低溫穩(wěn)定脂肪酶(見圖5)。
[0064]實施例4
[0065]最適pH及pH穩(wěn)定性
[0066]pH對MAJl酶活的影響:在不同ρΗ(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)條件下，采用比色法測定MAJl酶活。酶活測定反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考實施例3。使用的各種pH溶液為:IOOmM NaAc-HAc 溶液(ρΗ3.0、ρΗ4.0、ρΗ5.0)，IOOmMNa2HPO4-NaH2PO4 溶液(ρΗ6.0, ρΗ7.0)，50mM Tris-HCl溶液(pH8.0)。pH對MAJl酶活的影響用相對酶活來表示，測定的最大酶活定為100%。所有實驗重復(fù)三次。結(jié)果表明MAJl的最適pH值是7.0 (見圖4)。
[0067]測定MAJl在不同pH條件下的穩(wěn)定性時，首先將MASl在不同的ρΗ(3.0、4.0、5.0、
6.0,7.0,8.0和9.0)條件下放置12h，測定MAJl的剩余酶活力。酶活測定反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考實施例3。pH對MAJl穩(wěn)定性的影響用相對酶活表示，測定的最大酶活定為100%。所有實驗重復(fù)三次。結(jié)果表明MAJl在PH3.0-9.0處理2h后，MAJl在pH6.0-9.0保持90%以上的脂肪酶酶活。表明MAJl是一個偏堿性的脂肪酶(見圖6)。
[0068]實施例5
[0069]橄欖油乳化法測定脂肪酶酶活[0070]在對照組和實驗組的IOOmL三角瓶中，各加底物溶液(4% PVA溶液:橄欖油，3:1)4.0OmL和相應(yīng)pH值緩沖液5.0OmL,對照組中加入95%乙醇15.0OmL,在特定溫度下水浴預(yù)熱5min，然后，在兩瓶中各加待測酶液1.0OmL,在特定溫度水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)15min，在實驗組中立即補加95%乙醇15.0OmL終止反應(yīng)，取出。對照組和實驗組溶液在自動滴定儀下用0.05mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以滴定曲線的拐點為滴定終點，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，按下式計算酶活力。
[0071 ] X= (V — VO) X 1/15XηXc/0.05X50 = 200X (V - VO) XnXc/33-1
[0072]其中:X為樣品的酶活力(U/mL)；
[0073]V為滴定樣品時消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；
[0074]VO為滴定空白時消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；
[0075]c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mol/L)；
[0076]0.05為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù)；
[0077]50為0.5mol/LNa0H標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0OmL相當(dāng)于脂肪酸50 μ mo I ；
[0078]15為反應(yīng)時間(min)；
[0079]η為稀釋倍數(shù)。 [0080]脂肪酶活力的定義為:lmL酶液于特定溫度與pH值的條件下，水解脂肪每分鐘產(chǎn)生I微摩爾(ymol)的脂肪酸所需的酶量即為I個脂肪酶單位，以U/mL表示。
[0081]結(jié)果表明MAJl在以橄欖油為底物的反應(yīng)中的最適溫度為40°C，最適pH值是7.0(見圖7和圖8)。
[0082]實施例6
[0083]大豆卵磷脂法測定磷脂酶酶活
[0084]在對照組和實驗組的IOOmL三角瓶中，各加底物溶液(4 %無油磷脂溶于0.5 %PVA) 25.0OmL，對照組中加入95%乙醇15.00mL，在特定溫度下水浴預(yù)熱5min，然后，在兩瓶中各加待測酶液1.00mL，在特定溫度水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)15min，在實驗組中立即補加95%乙醇15.0OmL終止反應(yīng)，取出?？瞻缀蜆悠啡芤涸谧詣拥味▋x下用0.05mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以滴定曲線的拐點為滴定終點，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，按下式計算酶活力。
[0085]計算公式X = (V — V0) *c*50*n/ (0.05*t) = 103* (V — V0) *c*n/t 式 2-1
[0086]其中:X —樣品的酶活力，U/mL ；
[0087]V 一滴定樣品時消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml ；
[0088]VO 一滴定空白時消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml ；
[0089]c - NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L ；
[0090]50 - 0.05mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.0Oml 相當(dāng)于脂肪酸 50 μ mo I ；
[0091]η 一酶液樣品的稀釋倍數(shù)；
[0092]t 一測定酶活時的反應(yīng)時間。
[0093]磷脂酶酶活力定義為:在特定條件下Imin水解磷脂產(chǎn)生I微摩爾(μ mol)量游離脂肪酸所需的酶量即為一個磷脂酶活力單位(U)。Lecitase? Ultra為液體酶制劑,其磷脂酶活力表示為每mL酶液所測得的磷脂酶活力單位，即U/mL。
[0094]結(jié)果表明MAJl在以大豆卵磷脂為底物的反應(yīng)中的最適溫度為30°C,最適pH值是
7.0(見圖9和圖10)。[0095]實施例7
[0096]MAJl的脂肪酸底物鏈長選擇性
[0097]不同脂肪酸鏈長的ImM對硝基苯酚酯作為底物，采用比色法測定歐Jl酶活。酶活測定反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考實施例3。不同鏈長底物對MAJl酶活的影響用相對酶活表示，測定的最大酶活定為100%。所有實驗重復(fù)三次。結(jié)果表明MAJl對ClO底物的水解活性最大(見圖12)。
[0098]實施例8
[0099]偏甘油酯對TAG、DAG和MAG的水解
[0100]在25mL具塞三角瓶中加入3mL的茶油底物和來源于茶油的甘油二酯，單甘油酯(純度達(dá)到96%以上)，加入經(jīng)純化后的MAJl，加酶量為100U/mL(U/v，相對于油脂體積)酶液，酶液利用20mM pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至lmL，混合均勻后預(yù)熱20min。反應(yīng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm,反應(yīng)過程中分別在0.5h, lh, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 8h及12h進(jìn)行取樣。將所取10 μ L樣品溶于ImL的流動相中，流動相的比例為:正己烷/異丙醇/甲酸=15:1:0.003 (體積比)，震蕩均勻后，于10，OOOrpm下離心5min，除去下層水相，將上層有機相用0.45 μ m的有機相濾膜過濾后，取10 μ L進(jìn)行HPLC分析。
[0101]HPLC 檢測的條件為:色譜柱為 Luna5u SilicalOOA, 250X4.60mm(phenomenex),流動相為正己烷:異丙醇:甲酸=15:1:0.003(體積比)；流動相流速為1.0mL/min，柱溫保持30°C;進(jìn)樣量為10 μ L，每個樣品檢測時間約為30min，數(shù)據(jù)處理軟件為Breeze工作站。脂肪酶MAJl對不同底物進(jìn)行水解反應(yīng)后各脂類組分含量的變化(見圖13)。在脂肪酶MAJl催化的水解甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)反應(yīng)中，甘油三酯的含量沒有變化，表明脂肪酶MAJl不能催化水解TAG。在脂肪酶MAJl催化的水解甘油二酯(Diacylglycerol，DAG)和甘油二酯:單甘油酯(monoacylglycerol，MAG) (1:1，v/v)的反應(yīng)中，MAJl傾向于水解
I,3位甘油二酯生成I位或者3位單甘油酯(1/3-monoacylglycerol, 1/3-MAG)及自由脂肪酸(free fatty acids, FFAs)。表明脂肪酶MAJl是一個1，3位特異性偏甘油酯脂肪酶,可應(yīng)用于特異性的出除位于I或者3位甘油酯上的脂肪酸。
[0102] 總之，MAJl作為一個低溫偏甘油酯脂肪酶，同時具有相當(dāng)?shù)牧字该富?，可?yīng)用于植物油精煉過程中的酶法脫膠和去除偏甘油酯，用于制備高純度的甘油三酯。同時，也可應(yīng)用于油脂改性。
【權(quán)利要求】
1.一種海洋微生物來源的低溫偏甘油酯脂肪酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
2.一種偏甘油酯脂肪酶基因，其特征在于，基因序列如SEQ ID N0:1所示。
3.包含權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)載體。
4.一種細(xì)胞，其特征在于，包含權(quán)利要求3所述的載體，或其基因組中整合有權(quán)利要求2所述的脂肪酶基因。
5.一種偏甘油酯脂肪酶重組菌株的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)制備偏甘油酯脂肪酶表達(dá)質(zhì)粒: a.人工合成權(quán)利要求2的基因序列； b.將上述擴增基因PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化后，限制性內(nèi)切酶KpnI和SalI分別對純化的基因片段和質(zhì)粒PGAPZaA進(jìn)行雙酶切消化，連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，得到脂肪酶表達(dá)質(zhì)粒； (2)利用表達(dá)質(zhì)粒制備重組菌株: a.將步驟(1)的脂肪酶表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BlnI線性化后，電轉(zhuǎn)至宿主細(xì)胞； b.將轉(zhuǎn)化液涂布于含有100mg/mlZeocin的YPD平板中，30°C培養(yǎng)3天后，平板上長出酵母單菌落為重組菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述PCR的引物序列如下:
MAJl For 5’ -TACTGGTACCGCCACCGTCGCTGCTGATCCC-3’
MAJl Rev 5’ -AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述宿主細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母 X_33 (Pichia pastoris)。
8.權(quán)利要求5或6或7所述的方法制備的重組菌株。
9.權(quán)利要求1所述脂肪酶的應(yīng)用，其特征在于，該脂肪酶用于催化甘油酯的水解或合成甘油二酯，或用于植物油精煉過程中的酶法脫膠。
10.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的方法，其特征在于，包括:培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞，從培養(yǎng)物中分離出表達(dá)產(chǎn)物。
【文檔編號】C12N1/19GK103966187SQ201410182887
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】王永華, 元冬娟, 藍(lán)東明, 王方華, 楊博 申請人:華南理工大學(xué)