一種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法
【專利摘要】一種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法，包括酒精工業(yè)黃水的收集處理、枯草芽孢桿菌在酒精工業(yè)黃水中的培養(yǎng)以及枯草芽孢桿菌的收取和制備。本發(fā)明所提供的利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的方法，既能充分利用酒精工業(yè)黃水，降低黃水的處理成本，優(yōu)化黃水的綜合利用，改善生態(tài)環(huán)境，又能擴(kuò)大現(xiàn)有枯草芽孢桿菌制劑生產(chǎn)中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的來(lái)源，降低生產(chǎn)成本，擴(kuò)大枯草芽孢桿菌的應(yīng)用范圍。
【專利說(shuō)明】一種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酒精工業(yè)黃水的綜合利用領(lǐng)域以及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其是利用酒精工業(yè)中的黃水進(jìn)行微生物發(fā)酵。
【背景技術(shù)】
[0002]酒精工業(yè)是我國(guó)一項(xiàng)重要的能源產(chǎn)業(yè)，但在酒精生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生巨大的副產(chǎn)物，其中酒糟等固體成分和部分黃水一起可繼續(xù)生產(chǎn)DDGS等飼料原料而被再次利用，而絕大部分的黃水卻沒(méi)有得到很好的利用。黃水是在生產(chǎn)酒精過(guò)程中排出的富含多種營(yíng)養(yǎng)成分的液體物質(zhì)，黃水中含豐富的有機(jī)酸(尤其是乳酸、丁酸、己酸、乙酸等羧酸含量最多)、醇、醛、酯等呈香味物質(zhì)，同時(shí)還含有氨基酸、糖類、酒精、腐殖質(zhì)、酵母菌體自溶物、微生物菌體以及活細(xì)胞等，由于其營(yíng)養(yǎng)豐富，直接排入環(huán)境中往往會(huì)造成嚴(yán)重的水體富營(yíng)養(yǎng)化的污染，為此，國(guó)家規(guī)定酒精企業(yè)排放的廢水必須經(jīng)過(guò)前期處理，并達(dá)到4級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)后方可排放，這樣一來(lái)，除了黃水中的營(yíng)養(yǎng)成分被浪費(fèi)外，酒精企業(yè)往往增加較多的費(fèi)用用于黃水的處理，而且，目前我國(guó)大部分酒廠對(duì)黃水的處理都是將其用于拌糟回窖發(fā)酵或養(yǎng)窖、培養(yǎng)人工窖泥等方面，不僅不能有效利用資源，而且無(wú)法從根本上解決發(fā)酵黃水的最終去路問(wèn)題。因此如何綜合利用黃水資源，如何能夠變廢為寶，徹底解決黃水的去路問(wèn)題顯得尤為重要，如若能將黃水變廢為寶，充分利用起來(lái)，將降低企業(yè)的成本投入，同時(shí)也符合生態(tài)環(huán)境建設(shè)的需要。
[0003]枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，屬革蘭氏陽(yáng)性菌，在特殊條件下可形成0.6^0.9X1.(Tl.5--m的芽孢?？莶菅挎邨U菌在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，尚能合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，此外，枯草芽孢桿菌活菌制劑進(jìn)入腸道后可奪取腸道游離氧，從而改善腸道微生態(tài)環(huán)境。目前枯草芽孢桿菌已形成工業(yè)生產(chǎn)，其成品已在醫(yī)藥保健、食品、飼料等行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。然而，現(xiàn)行枯草芽孢桿菌制劑的生產(chǎn)方法多采用人為加入大量?jī)?yōu)質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為原料進(jìn)行生產(chǎn)，其生產(chǎn)成本較高，進(jìn)而影響枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，以及增加以枯草芽孢桿菌為原料的相關(guān)產(chǎn)品的成本。
[0004]由于酒精工業(yè)黃水中富含多種可溶態(tài)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此，如果能夠利用酒精工業(yè)黃水進(jìn)行枯草芽孢桿菌制劑的生產(chǎn)，既能解決酒精工業(yè)黃水的綜合利用問(wèn)題，變廢為寶，又能降低目前枯草芽孢桿菌制劑生產(chǎn)成本，進(jìn)一步擴(kuò)大枯草芽孢桿菌的應(yīng)用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的技術(shù)方法，一方面減少酒精工業(yè)中黃水處理的環(huán)節(jié)和費(fèi)用，提高酒精工業(yè)黃水的綜合利用率，另一方面降低枯草芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)的成本。
[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是:一種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法，具體步驟如下:(1)從板框壓濾機(jī)的板框直接收集酒精工業(yè)黃水，迅速放入密封的容器中，然后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)、纖維素、氨基酸、有機(jī)酸、礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定，并根據(jù)實(shí)際測(cè)定值和枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)需要，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分補(bǔ)充；
(2)將步驟(1)中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)后的酒精工業(yè)黃水在高壓滅菌鍋中121°C條件下滅菌15^20min,冷卻，經(jīng)過(guò)滅菌后的酒精工業(yè)黃水pH為3.2^3.5，不適合枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖，然后利用氫氧化鈉、碳酸氫鈉將其PH調(diào)節(jié)至7.2^7.5 ；
(3)將枯草芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定生產(chǎn)期，檢測(cè)活菌數(shù)不低于I X IO9 cfu/mL即可作為種子菌液，備用，其中，所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配比為:牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL，并將其pH調(diào)節(jié)至7.2~7.5 ；
(4)將步驟(3)中所得到種子菌液按照6%~8%(v/v)的比例接種于經(jīng)步驟(2)處理后的酒精工業(yè)黃水中，并在36°C~36.5°C的溫度下，置于20(T220r/min的恒溫振蕩器上培養(yǎng)16~18h，得到枯草芽孢桿菌菌液，備用；
(5)在步驟(4)中得到的枯草芽孢桿菌菌液中添加氯化鈣，其添加的量按照重量體積t匕(w/v)為0.05%~0.08%，然后在60°C水浴中加熱10mirT20min，再轉(zhuǎn)入80°C水浴中加熱5mirTl0min，得到含有芽胞的菌液，該方法處理的枯草芽孢桿菌芽孢形成率89.Ρ/-92.6% ；
(6)將步驟(5)中含有芽孢的菌液用大容量離心機(jī)于350(T4000r/min離心l(Tl5min，棄去上清液，獲得枯草芽孢桿菌固體物；
(7)按照步驟(6)所得的枯草芽孢桿菌固體物與載體1:4飛的重量比，加入碳酸鈣粉載體，混合均勻，制成枯草芽孢桿菌固體混合物；
(8)將步驟(7)所得的枯草芽孢桿菌固體混合物在無(wú)菌、60°C~65°C條件下烘干，研磨成干粉，干粉中有效枯草芽孢桿菌數(shù)為20 X 109^30 X IO9個(gè)/g，有效枯草芽孢桿菌數(shù)指的是枯草芽孢桿菌活菌數(shù)和形成芽孢的枯草芽孢桿菌數(shù)之和；
(9)在步驟(8)所得到的枯草芽孢桿菌干粉中按照重量比加入4%的乳糖、20%的可溶性淀粉作為賦形劑，并混合均勻，制成枯草芽孢桿菌制劑，其中有效枯草芽孢桿菌數(shù)> 50億個(gè)/克，然后用復(fù)合薄膜對(duì)地衣芽孢桿菌制劑，進(jìn)行真空包裝，真空度為0.085~0.095Mpa。
[0007]本發(fā)明中所用的枯草芽孢桿菌購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，保藏于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，其保藏編號(hào)為ATCC 6633，購(gòu)買日期為2013年11月20日。
[0008]本發(fā)明具有以下有益效果:
第一，與目前枯草芽孢桿菌制劑生產(chǎn)的原料和營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)相比，本發(fā)明采用酒精工業(yè)黃水作為培養(yǎng)原料和基質(zhì)，充分利用了酒精工業(yè)廢水，提高了酒精工業(yè)黃水的綜合利用價(jià)值，改善了生態(tài)環(huán)境，擴(kuò)大了枯草芽孢桿菌制劑生產(chǎn)所需營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的來(lái)源，降低了枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)成本；
第二，經(jīng)枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，酒精工業(yè)黃水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被枯草芽孢桿菌充分利用，含量有效降低，基本達(dá)到酒精廢水的排放標(biāo)準(zhǔn)，不會(huì)造成水體的富營(yíng)養(yǎng)化，并且省去了企業(yè)處理酒精工業(yè)黃水的環(huán)節(jié)以及相關(guān)投入，降低了相關(guān)企業(yè)的生產(chǎn)成本；
第三，本發(fā)明是從板框壓濾機(jī)的板框直接采集酒精工業(yè)黃水的，這是因?yàn)榫凭I(yè)黃水的收集點(diǎn)較為重要，從板框壓濾機(jī)的板框直接收集的黃水營(yíng)養(yǎng)成分較排水口收集的黃水營(yíng)養(yǎng)成分豐富，更加適合作為培養(yǎng)基質(zhì)；
第四，本發(fā)明在測(cè)定酒精工業(yè)黃水營(yíng)養(yǎng)含量的前提下，根據(jù)測(cè)定結(jié)果有針對(duì)性的對(duì)黃水進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充，以更加適合枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和繁殖，進(jìn)一步提高了枯草芽孢桿菌在酒精工業(yè)黃水中的產(chǎn)量；
第五，針對(duì)酒精工業(yè)黃水的特有的化學(xué)組成，進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚砗筒糠只瘜W(xué)性質(zhì)的改變，使其更適合枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和繁殖，提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量；
第六，針對(duì)酒精工業(yè)黃水的特有化學(xué)組成和性質(zhì)，提供了適當(dāng)?shù)挠糜谂囵B(yǎng)枯草芽孢桿菌的操作參數(shù)，包括枯草芽孢桿菌接種量、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速以及培養(yǎng)時(shí)間等；
第七，在枯草芽孢桿菌培養(yǎng)結(jié)束后，利用本發(fā)明提供的收取及制備方法可使得枯草芽孢桿菌制劑的有效菌數(shù)≥50億個(gè)/克，芽孢形成率達(dá)到89.1%~92.6%。
[0009]因此，本發(fā)明所提供的利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的方法，既能充分利用酒精工業(yè)黃水，降低黃水的處理成本，優(yōu)化黃水的綜合利用，改善生態(tài)環(huán)境，又能擴(kuò)大現(xiàn)有枯草芽孢桿菌生產(chǎn)中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的來(lái)源，降低生產(chǎn)成本，擴(kuò)大枯草芽孢桿菌的應(yīng)用范圍。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1是酒精工業(yè)黃水中各種營(yíng)養(yǎng)成分的含量。
[0011]圖2是不同培養(yǎng)溫度對(duì)有效枯草芽孢桿菌數(shù)的影響。
[0012]圖3是不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)有效枯草芽孢桿菌數(shù)的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0014]實(shí)施例1:一種 利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法，本方法采用的是玉米為原料生產(chǎn)酒精的 黃水，具體步驟如下:
(1)從板框壓濾機(jī)的板框直接收集酒精工業(yè)黃水，迅速放入密封的容器中，然后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)、纖維素、氨基酸、有機(jī)酸、礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定，得到酒精工業(yè)黃水中各種營(yíng)養(yǎng)成分的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)附圖1，并根據(jù)實(shí)際測(cè)定值和枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)需要，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分補(bǔ)充，具體營(yíng)養(yǎng)成分補(bǔ)充種類和數(shù)量為:每升上述的酒精工業(yè)黃水中添加尿素5g、葡萄糖2g、氯化鈉2g和玉米粉3g ；
(2)將步驟(1)中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)后的酒精工業(yè)黃水在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌15~20min，冷卻，然后利用氫氧化鈉、碳酸氫鈉將其pH調(diào)節(jié)至7.2~7.5 ；
(3)將枯草芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定生產(chǎn)期，檢測(cè)活菌數(shù)不低于I X IO9 cfu/mL即可作為種子菌液，備用，其中，所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配比為:牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL，并將其pH調(diào)節(jié)至7.2~7.5 ；
(4)將步驟(3)中所得到種子菌液按照6%(v/v)的比例接種于經(jīng)步驟(2)處理后的酒精工業(yè)黃水中，并在36°C的溫度下，置于20(T220r/min的恒溫振蕩器上培養(yǎng)16h，得到枯草芽孢桿菌菌液，備用；
(5)在步驟(4)中得到的枯草芽孢桿菌菌液中添加氯化鈣，其添加的量按照重量體積比(w/v)為0.05%，然后在60°C水浴中加熱lOmin，再轉(zhuǎn)入80°C水浴中加熱5min，得到含有芽胞的菌液；
(6)將步驟(5)中含有芽孢的菌液用大容量離心機(jī)于350(T4000r/min離心l(Tl5min，棄去上清液，獲得枯草芽孢桿菌固體物；(7)按照步驟(6)所得的枯草芽孢桿菌固體物與載體1:4的重量比，加入碳酸鈣粉載體，混合均勻，制成枯草芽孢桿菌固體混合物；
(8)將步驟(7)所得的枯草芽孢桿菌固體混合物在無(wú)菌、60°C~65°C條件下烘干，研磨成干粉；
(9)在步驟(8)得到的枯草芽孢桿菌干粉中按照重量比加入4%的乳糖、20%的可溶性淀粉作為賦形劑，并混合均勻，制成枯草芽孢桿菌制劑，然后用復(fù)合薄膜對(duì)枯草芽孢桿菌制劑進(jìn)行真空包裝，真空度為0.085~0.095Mpa。
[0015]經(jīng)測(cè)定，采用本實(shí)施例中的方法所得枯草芽孢桿菌制劑中有效枯草芽孢桿菌數(shù)為(50.3±7.I) XlO90
[0016]實(shí)施例2:—種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法，本方法采用的是玉米為原料生產(chǎn)酒精的黃水，具體步驟如下:
(1)從板框壓濾機(jī)的板框直接收集酒精工業(yè)黃水，迅速放入密封的容器中，然后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)、纖維素、氨基酸、有機(jī)酸、礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定，得到酒精工業(yè)黃水中各種營(yíng)養(yǎng)成分的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)附圖1，并根據(jù)實(shí)際測(cè)定值和枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)需要，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分補(bǔ)充，具體營(yíng)養(yǎng)成分補(bǔ)充種類和數(shù)量為:每升上述的酒精工業(yè)黃水中添加尿素5g、葡萄糖2g、氯化鈉2g和玉米粉3g ；
(2)將步驟(1)中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)后的酒精工業(yè)黃水在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌15~20min，冷卻，然后利用氫氧化鈉、碳酸氫鈉將其pH調(diào)節(jié)至7.2~?.5 ；
(3)將枯草芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定生產(chǎn)期，檢測(cè)活菌數(shù)不低于I X IO9 cfu/mL即可作為種子菌液，備用，其中，所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配比為:牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水lOOOmL，并將其pH調(diào)節(jié)至7.2~7.5 ；
(4)將步驟(3)中所得到種子菌液按照8%(v/v)的比例接種于經(jīng)步驟(2)處理后的酒精工業(yè)黃水中，并在36.5°C的溫度下，置于20(T220r/min的恒溫振蕩器上培養(yǎng)18h，得到枯草芽孢桿菌菌液，備用；
(5)在步驟(4)中得到的枯草芽孢桿菌菌液中添加氯化鈣，其添加的量按照重量體積比(w/v)為0.08%，然后在60°C水浴中加熱20min，再轉(zhuǎn)入80°C水浴中加熱lOmin，得到含有芽胞的菌液；
(6)將步驟(5)中含有芽孢的菌液用大容量離心機(jī)于350(T4000r/min離心l(Tl5min，棄去上清液，獲得枯草芽孢桿菌固體物；
(7)按照步驟(6)所得的枯草芽孢桿菌固體物與載體1:6的重量比，加入碳酸鈣粉載體，并混合均勻，制成枯草芽孢桿菌固體混合物；
(8)將步驟(7)所得的枯草芽孢桿菌固體混合物在無(wú)菌、60°C~65°C條件下烘干，研磨成干粉；
(9)在步驟(8)得到的枯草芽孢桿菌干粉中按照重量比加入4%的乳糖、20%的可溶性淀粉作為賦形劑，并混合均勻，制成枯草芽孢桿菌制劑，然后用復(fù)合薄膜對(duì)枯草芽孢桿菌制劑進(jìn)行真空包裝，真空度為0.085~0.095Mpa。
[0017]經(jīng)測(cè)定，采用本 實(shí)施例中的方法所得枯草芽孢桿菌制劑中有效枯草芽孢桿菌數(shù)為(56±6.3) XlO90
[0018]實(shí)施例3:—種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法，本方法采用的是玉米為原料生產(chǎn)酒精的黃水，具體步驟如下:
(1)從板框壓濾機(jī)的板框直接收集酒精工業(yè)黃水，迅速放入密封的容器中，然后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)、纖維素、氨基酸、有機(jī)酸、礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定，得到酒精工業(yè)黃水中各種營(yíng)養(yǎng)成分的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)附圖1，并根據(jù)實(shí)際測(cè)定值和枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)需要，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分補(bǔ)充，具體營(yíng)養(yǎng)成分補(bǔ)充種類和數(shù)量為:每升上述的酒精工業(yè)黃水中添加尿素5g、葡萄糖2g、氯化鈉2g和玉米粉3g ；
(2)將步驟(1)中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)后的酒精工業(yè)黃水在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌15~20min，冷卻，然后利用氫氧化鈉、碳酸氫鈉將其pH調(diào)節(jié)至7.2~?.5 ；
(3)將枯草芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定生產(chǎn)期，檢測(cè)活菌數(shù)不低于I X IO9 cfu/mL即可作為種子菌液，備用，其中，所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配比為:牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL，并將其pH調(diào)節(jié)至7.2~7.5 ；
(4)將步驟(3)中所得到種子菌液按照7%(v/v)的比例接種于經(jīng)步驟(2)處理后的酒精工業(yè)黃水中，并在36.2°C的溫度下，置于20(T220r/min的恒溫振蕩器上培養(yǎng)17h，得到枯草芽孢桿菌菌液，備用；
(5)在步驟(4)中得到的枯草芽孢桿菌菌液中添加氯化鈣，其添加的量按照重量體積比(w/v)為0.07%，然后在60°C水浴中加熱15min，再轉(zhuǎn)入80°C水浴中加熱8min，得到含有芽胞的菌液；
(6)將步驟(5)中含有芽孢的菌液用大容量離心機(jī)于350(T4000r/min離心l(Tl5min，棄去上清液，獲得枯草芽孢 桿菌固體物；
(7)按照步驟(6)所得的枯草芽孢桿菌固體物與載體1:5的重量比，加入碳酸鈣粉載體，混合均勻，制成枯草芽孢桿菌固體混合物；
(8)將步驟(7)所得的枯草芽孢桿菌固體混合物在無(wú)菌、60°C~65°C條件下烘干，研磨成干粉；
(9)在步驟(8)得到的枯草芽孢桿菌干粉中按照重量比加入4%的乳糖、20%的可溶性淀粉作為賦形劑，混合均勻，制成枯草芽孢桿菌制劑，然后用復(fù)合薄膜對(duì)枯草芽孢桿菌制劑進(jìn)行真空包裝，真空度為0.085~0.095Mpa。
[0019]經(jīng)測(cè)定，采用本實(shí)施例中的方法所得枯草芽孢桿菌制劑中有效枯草芽孢桿菌數(shù)為(51.6±4.2) XlO90
[0020]下面結(jié)合試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0021]試驗(yàn)例1:探討采用本發(fā)明所提供的方法進(jìn)行枯草芽孢桿菌培養(yǎng)，不同培養(yǎng)溫度對(duì)最終枯草芽孢桿菌成品中有效枯草芽孢桿菌數(shù)的影響，并找出最適宜的培養(yǎng)溫度。
[0022]在微生物的培養(yǎng)中，溫度的影響至關(guān)重要，直接影響到微生物培養(yǎng)的成功與否，以及最終的菌落數(shù)量是否合乎要求。依照本發(fā)明提供的方法，采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為35°C、35.5°C、36°C、36.5°C、37°C、37.5°C和39°C的不同溫度梯度，進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖2。
[0023]由附圖2中可以看出，按照本發(fā)明的方法進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)溫度在36°C至36.5°C時(shí)，枯草芽孢桿菌制劑中有效枯草芽孢桿菌數(shù)較高，尤其是36.5°C時(shí)候，有效枯草芽孢桿菌數(shù)最高，因此，36.5°C是采用本發(fā)明的方法培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的最適宜的培養(yǎng)溫度。[0024]試驗(yàn)例2:探討采用本發(fā)明所提供的方法進(jìn)行枯草芽孢桿菌培養(yǎng)，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)最終枯草芽孢桿菌制劑中有效枯草芽孢桿菌數(shù)的影響，并找出最適宜的培養(yǎng)時(shí)間。
[0025]微生物培養(yǎng)中，時(shí)間過(guò)短可能會(huì)得不到有效數(shù)量的菌落，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)被雜菌污染，因此，培養(yǎng)時(shí)間至關(guān)重要。依照本發(fā)明的方法，采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置為12h、16h、18h、24h、36h和48h，進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖3。
[0026]從附圖3中可以看出，培養(yǎng)時(shí)間為16~18h時(shí)，枯草芽孢桿菌制劑中有效菌數(shù)量較多，尤其當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為18h時(shí)，枯草芽孢 桿菌有效菌數(shù)達(dá)到最高，因此依照本發(fā)明的方法，最適宜的培養(yǎng)時(shí)間是18h。
【權(quán)利要求】
1.一種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將收集到的酒精工業(yè)黃水放入密封的容器中,取樣進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定,并根據(jù)測(cè)定值對(duì)所收集的酒精工業(yè)黃水進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分補(bǔ)充，備用； (2)對(duì)經(jīng)步驟(1)營(yíng)養(yǎng)成分補(bǔ)充后所得的酒精工業(yè)黃水進(jìn)行滅菌，并將滅菌后的酒精工業(yè)黃水的PH調(diào)節(jié)至7.2~?.5，備用； (3)將枯草芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定生產(chǎn)期，檢測(cè)活菌數(shù)不低于I X IO9 cfu/mL作為種子菌液，備用； (4)將步驟(3)中所得到種子菌液按照6%~8%(v/v)的比例接種于步驟(2)處理所得的酒精工業(yè)黃水中，并于36°C ^36.5°C的培養(yǎng)溫度下，在恒溫振蕩器上培養(yǎng)16tTl8h，得到枯草芽孢桿菌菌液，備用； (5)在步驟(4)中得到的枯草芽孢桿菌菌液中添加氯化鈣，其添加的量按照重量體積比(w/v)為0.05%~0.08%，然后在60°C水浴中加熱15mirT20min，再轉(zhuǎn)入80°C水浴加熱5mirTl0min，得到含有芽胞的菌液； (6)將步驟(5)中含有芽孢的菌液用離心機(jī)進(jìn)行離心處理，棄去上清液，獲得枯草芽孢桿菌固體物； (7)按照步驟(6)所得的枯草芽孢桿菌固體物與載體1:4飛的重量比例，添加碳酸鈣粉載體，并混合均勻，制成枯草芽孢桿菌固體混合物； (8)將步驟(7)中得到的枯草芽孢桿菌固體混合物在無(wú)菌條件下烘干，其烘干溫度為600C~65°C，然后將烘干后的枯草芽孢桿菌固體混合物研磨成干粉； (9)在步驟(8)得到的干粉中加入賦形劑，混合均勻，制成枯草芽孢桿菌制劑，并真空包裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的滅菌在高壓滅菌鍋中進(jìn)行，滅菌條件為在121°C溫度下滅菌15~20mino
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法，其特征在于:所述步驟(3)中的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配方是:牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL,其pH為7.2~?.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法，其特征在于:所述步驟(4)中的恒溫振蕩器的振動(dòng)頻率為20(T220r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法，其特征在于:所述步驟(6)中離心處理中所用離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為350(T4000r/min,離心時(shí)間10~15min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酒精工業(yè)黃水生產(chǎn)枯草芽孢桿菌制劑的方法，其特征在于:所述步驟(9)中所用的賦形劑為乳糖和可溶性淀粉，并根據(jù)與所述干粉的重量比，其添加量為4%的乳糖和20%的可溶性淀粉。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104004676SQ201410183956
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】何萬(wàn)領(lǐng), 丁軻, 李曉麗, 李旺, 李元曉, 張廣勤 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)