一種雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單克隆抗體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開(kāi)了一種單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單克隆抗體和應(yīng)用。本發(fā)明所述單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞保藏編號(hào)為CGMCC?NO.9153。本發(fā)明以經(jīng)過(guò)優(yōu)化的PDI家族成員蛋白為抗原蛋白，制備了單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其分泌產(chǎn)生的單克隆抗體，該雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定產(chǎn)生抗SEQ?ID?NO:1所示氨基酸序列蛋白單克隆抗體，該單克隆抗體具有雙向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反應(yīng)，可應(yīng)用于治療血栓性疾病和凝血性疾病的藥物制備中。
【專利說(shuō)明】一種雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單克隆抗體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單克隆抗體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]血栓是指血液成分在血液流動(dòng)過(guò)程中，在血管或心臟內(nèi)膜表面形成的一種半凝塊狀物質(zhì)。血栓由不溶性纖維蛋白、沉積的血小板、積聚的白細(xì)胞和陷入的紅細(xì)胞組成。血栓形成是一種涉及許多彼此相互作用的遺傳和環(huán)境因素的多因素變化的過(guò)程。在臨床上常見(jiàn)到血栓性疾病,如冠脈綜合征、深靜脈血栓等。血栓性疾病屬于心腦血管疾病,全球每年因心腦血管疾病死亡人數(shù)達(dá)1200萬(wàn)，相當(dāng)于世界總死亡人數(shù)的1/4，已成為人類生命的頭號(hào)殺手。
[0003]彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)又稱消耗性凝血病、去纖維蛋白綜合征。DIC是一種影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見(jiàn)和嚴(yán)重的凝血疾病。常見(jiàn)病因有嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、產(chǎn)科和血管病急癥、癌癥、非細(xì)菌性血栓性心腦膜炎、蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦腫瘤、腦血管畸形，心、肝、腎功能衰竭和免疫性疾病等。在各種致病因素的作用下，血循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)局限的或彌漫性的凝血促動(dòng)，凝血瀑布被激活，產(chǎn)生過(guò)量的凝血酶。凝血系統(tǒng)進(jìn)一步被激活，使血液凝固性增高，破壞了體內(nèi)凝血和抗凝過(guò)程的平衡，易引起腦組織缺血、缺氧和缺血性梗死。
[0004]針對(duì)血栓和DIC兩種疾病，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)研究和開(kāi)發(fā)了很多藥物。主要包括兩大類藥物，如抗凝血藥物肝素、華法林、Fondaparinux、水蛭素等，以及抗血小板藥物磷酸二酯酶抑制劑、阿西匹林、ADP受體抑制劑、GPIIb/IIIa受體抑制劑等。以上藥物的缺陷在于它們的作用只限于單一祀點(diǎn)。而蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)家族成員可以調(diào)控不同底 物蛋白的二硫鍵狀態(tài)，能作用于多個(gè)靶點(diǎn)。但是，目前鮮有針對(duì)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)家族成員用于預(yù)防和治療血栓性疾病和彌散性血管內(nèi)凝血的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供抗一種雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單克隆抗體，使所產(chǎn)生的單克隆抗體具有防治血栓形成和抑制凝血酶的作用，可以應(yīng)用于治療血栓性疾病和如彌散性血管內(nèi)凝血這種凝血性疾病的藥物制備中。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0007]一種雜交瘤細(xì)胞，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9153。
[0008]本發(fā)明所述單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞由以下方法制備獲得:
[0009]SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的蛋白免疫BALB/C小鼠，3天后取BALB/C小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按照5: I~10: I的比例混合，利用PEG進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后進(jìn)行HAT培養(yǎng)，然后吸取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞用有限稀釋法克隆至能穩(wěn)定分泌抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白單克隆抗體，獲得所述單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。[0010]其中，所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白免疫BALB/C小鼠具體為:
[0011]取SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白100 μ g加等質(zhì)量福氏完全佐劑對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第一次皮下注射，21天后取SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白300 μ g加等質(zhì)量福氏不完全佐劑對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第二次皮下注射，10天后尾部采血并用ELISA間接法測(cè)定抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白的鼠血清效價(jià)，選擇效價(jià)高的BALB/C小鼠用SEQID NO:1所示氨基酸序列的蛋白IOOyg進(jìn)行免疫。
[0012]本發(fā)明所用抗原蛋白選自蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfideisomerase, PDI)家族,通過(guò)優(yōu)化編碼基因表達(dá)所述抗原蛋白，以其實(shí)現(xiàn)所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體具有雙向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反應(yīng)。所述抗原蛋白可由試劑公司進(jìn)行全合成，或參照SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列進(jìn)行常規(guī)表達(dá)獲得。
[0013]經(jīng)過(guò)上述方法制備后，最終篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為Duln，并于2014年4月29日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9153。
[0014]此外，本發(fā)明還提供一種抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白單克隆抗體(以下簡(jiǎn)稱DuIn抗體)，由保藏編號(hào)為CGMCC N0.9153的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生。 [0015]制備DuIn抗體可采用本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)方法，如用雜交瘤細(xì)胞株誘導(dǎo)小鼠腹水，本發(fā)明優(yōu)選為:
[0016]步驟1、用不完全佐劑免疫BALB/C小鼠I~2周后，分別往小鼠腹腔注射IXlO6個(gè)保藏編號(hào)為CGMCC N0.9153的雜交瘤細(xì)胞，接種所述雜交瘤細(xì)胞7~10天后產(chǎn)生腹水；
[0017]步驟2、從所述BALB/C小鼠腹腔抽取腹水，置于15ml離心管中，2000rpm離心IOmin,以沉淀血細(xì)胞及其它雜質(zhì)，將上清轉(zhuǎn)移入新的離心管中，放入_80°C冰箱保存，純化前，使用0.1M的PBS溶液按1:3的比例稀釋腹水；
[0018]取0.5ml Protein G裝入吸附柱中，加入20倍柱體積的0.1M的PBS緩沖液平衡柱子，以備上樣；
[0019]取稀釋的腹水，加入純化柱中，每次2_3ml，腹水循環(huán)過(guò)柱3遍；
[0020]步驟3、待腹水循環(huán)過(guò)柱3遍后，加上30倍柱體積的0.1M的PBS緩沖液充分洗滌柱子，洗掉雜蛋白；
[0021]洗滌完畢后，加0.1Μ、ρΗ值為2.8的Gly洗脫液洗脫結(jié)合的抗體，預(yù)先在收集管中加入25ullM、pH值8.9的Tris-Hcl，每管收集500ul的洗脫液，連續(xù)收集10管;
[0022]使用顯色液測(cè)定每管收集液是否含有蛋白質(zhì)，取蛋白含量最多的收集液進(jìn)行透析，透析后獲得DuIn抗體。
[0023]本發(fā)明制備的DuIn抗體具有雙向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反應(yīng)。如抑制血小板聚集、抑制血小板表面整合素a IIbP 3的活化、抑制血小板表面p-selectin的表達(dá)、明顯抑制血栓形成、明顯抑制體內(nèi)血小板積聚和纖維蛋白形成、體外明顯抑制凝血酶生成。
[0024]基于此，本發(fā)明提供所述單克隆抗體在制備治療血栓性疾病或凝血性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0025]其中作為優(yōu)選，所述血栓性疾病為冠脈綜合征或深靜脈血栓；所述凝血性疾病為彌散性血管內(nèi)凝血病。
[0026]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明以經(jīng)過(guò)優(yōu)化的PDI家族成員蛋白為抗原蛋白，制備了單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其分泌產(chǎn)生的單克隆抗體，該雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定產(chǎn)生DuIn抗體，該單克隆抗體具有雙向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反應(yīng)，可應(yīng)用于治療血栓性疾病和凝血性疾病的藥物制備中。
[0027]生物保藏信息說(shuō)明
[0028]抗ERp57單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞于2014年4月29日保藏在保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9153。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1所示為DuIn抗體特異性檢測(cè)的聚集曲線圖，其中，曲線I為ERp57fl/fl小鼠血小板經(jīng)DuIn抗體60 μ g/mL孵育后的聚集曲線，曲線2為ERp57fl/fl小鼠血小板經(jīng)DuIn抗體30 μ g/mL孵育后的聚集曲線，曲線3為ERp57fl/fl小鼠血小板經(jīng)DuIn抗體15 μ g/mL孵育后的聚集曲線，曲線4為ERp57fl/fl小鼠血小板經(jīng)IgG2a60l.! g/mL孵育后的聚集曲線；橫坐標(biāo)為時(shí)間min,對(duì)應(yīng)時(shí)間為lmin、2min、3min、4min,縱坐標(biāo)為透光度％ ； [0030]圖2所示為DuIn抗體特異性檢測(cè)的聚集曲線圖，其中，曲線I為PF4_Cre/ERp57fl/fl小鼠血小板經(jīng)DuIn抗體60 μ g/mL孵育后的聚集曲線，曲線2為PF4_Cre/ERp57f 1/f I小鼠血小板經(jīng)DuIn抗體30 μ g/mL孵育后的聚集曲線，曲線3為PF4_Cre/ERp57fl/fl小鼠血小板經(jīng)DuIn抗體15 μ g/mL孵育后的聚集曲線，曲線4為PF4_Cre/ERp57fl/fl小鼠血小板經(jīng)IgG2a60 μ g/mL孵育后的聚集曲線；橫坐標(biāo)為時(shí)間min，對(duì)應(yīng)時(shí)間為lmin、2min、3min、4min,縱坐標(biāo)為透光度％ ；
[0031]圖3所示為DuIn抗體抑制血小板聚集試驗(yàn)的聚集曲線圖，其中，曲線I為人來(lái)源血小板經(jīng)DuIn抗體60 μ g/mL孵育后的聚集曲線，曲線2為人來(lái)源血小板經(jīng)DuIn抗體30 μ g/mL孵育后的聚集曲線，曲線3為人來(lái)源血小板經(jīng)DuIn抗體15 μ g/mL孵育后的聚集曲線，曲線4為人來(lái)源血小板經(jīng)IgG2a 60 μ g/mL孵育后的聚集曲線；橫坐標(biāo)為時(shí)間min，對(duì)應(yīng)時(shí)間為lmin、2min、3min、4min,縱坐標(biāo)為透光度％ ；
[0032]圖4所示為DuIn抗體抑制血小板表面整合素a IIb β 3的活化的柱形圖，其中，柱形I為對(duì)照抗體鼠IgG2a組柱形，柱形2為DuIn抗體組柱形，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度％ ；
[0033]圖5所示為DuIn抗體抑制血小板表面p-selectin的表達(dá)的柱形圖，其中，柱形I為對(duì)照抗體鼠IgG2a組柱形，柱形2為DuIn抗體組柱形，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度％ ；
[0034]圖6所示DuIn抗體抑制小鼠體內(nèi)血栓形成的柱形圖，其中，柱形I為對(duì)照抗體鼠IgG2a組柱形，柱形2為DuIn抗體組柱形，縱坐標(biāo)為血管阻塞時(shí)間min ；
[0035]圖7所示DuIn抗體體內(nèi)抑制血小板積聚的曲線圖，其中，曲線I為對(duì)照抗體鼠IgG組曲線，曲線2為DuIn抗體組曲線，縱坐標(biāo)為血小板的熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為時(shí)間s ；
[0036]圖8所示DuIn抗體體內(nèi)抑制纖維蛋白形成的曲線圖，其中，曲線I為對(duì)照抗體鼠IgG組曲線，曲線2為DuIn抗體組曲線，縱坐標(biāo)為纖維蛋白熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為時(shí)間s ；
[0037]圖9所示為DuIn抗體抑制凝血酶形成的曲線圖，其中，曲線I為對(duì)照抗體鼠IgG組曲線，曲線2為DuIn抗體組曲線,縱坐標(biāo)為凝血酶生成量,橫坐標(biāo)為時(shí)間min?！揪唧w實(shí)施方式】:
[0038]本發(fā)明公開(kāi)了一種雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單克隆抗體和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0039]下面就本發(fā)明提供的一種雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單克隆抗體和應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0040]實(shí)施例1:單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備
[0041]1、材料
[0042]抗原:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白，試劑公司全合成；
[0043]試驗(yàn)動(dòng)物:8-10周齡、17g左右BALB/C小鼠；
[0044]試劑:福氏完全佐劑和不完全佐劑(購(gòu)自Promega公司)；
[0045]骨髓瘤細(xì)胞:SP2/0細(xì)胞(由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供);
[0046]培養(yǎng)基:HAT選擇性培養(yǎng)基(購(gòu)自Sigma公司)；
[0047]2、方法
[0048]取SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白100 μ g加等質(zhì)量福氏完全佐劑對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第一次皮下注射，21天后取SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白300 μ g加等質(zhì)量福氏不完全佐劑對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第二次皮下注射，10天后尾部采血并用ELISA間接法測(cè)定抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白的鼠血清效價(jià)，選擇效價(jià)高的BALB/C小鼠用SEQID NO:1所示氨基酸序列的蛋白IOOyg進(jìn)行免疫，腹腔注射后3天準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞融合。 [0049]腹腔注射3天后，取BALB/C小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按照5: I~10: I的比例混合，利用PEG進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后進(jìn)行HAT培養(yǎng)，然后吸取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞用有限稀釋法克隆至能穩(wěn)定分泌抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白單克隆抗體，獲得所述單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。
[0050]實(shí)施例2:分泌產(chǎn)生DuIn抗體
[0051]用不完全佐劑免疫BALB/C小鼠I~2周后，分別往小鼠腹腔注射I X IO6個(gè)保藏編號(hào)為CGMCC N0.9153的雜交瘤細(xì)胞，接種所述雜交瘤細(xì)胞7~10天后產(chǎn)生腹水；
[0052]從所述BALB/C小鼠腹腔抽取腹水，置于15ml離心管中，2000rpm離心10min，以沉淀血細(xì)胞及其它雜質(zhì)，將上清轉(zhuǎn)移入新的離心管中，放入_80°C冰箱保存，純化前，使用
0.1M的PBS溶液按1:3的比例稀釋腹水；
[0053]取0.5ml Protein G裝入吸附柱中，加入20倍柱體積的0.1M的PBS緩沖液平衡柱子，以備上樣；
[0054]取稀釋的腹水，加入純化柱中，每次2_3ml，腹水循環(huán)過(guò)柱3遍；
[0055]待腹水循環(huán)過(guò)柱3遍后，加上30倍柱體積的0.1M的PBS緩沖液充分洗滌柱子，洗掉雜蛋白；
[0056]洗滌完畢后，加0.1Μ、ρΗ值為2.8的Gly洗脫液洗脫結(jié)合的抗體，預(yù)先在收集管中加入25ullM、pH值8.9的Tris-Hcl，每管收集500ul的洗脫液，連續(xù)收集10管;
[0057]使用顯色液測(cè)定每管收集液是否含有蛋白質(zhì)，取蛋白含量最多的收集液進(jìn)行透析，透析后獲得DuIn抗體。
[0058] 實(shí)施例3 =DuIn抗體特異性檢測(cè)
[0059]分別取ERp57fl/fl (對(duì)照小鼠，未敲除SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白的編碼基因)以及PF4-Cre/ERp57fl/fl (血小板特異性敲除SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白的編碼基因的小鼠)血小板裂解液200 μ g和ERp57重組蛋白50ng進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，使用5%的脫脂牛奶溶液室溫封閉I小時(shí)。使用TBS/T溶液將抗DuIn抗體稀釋到I μ g/ml，將封閉過(guò)的PVDF膜放入抗體稀釋液中，室溫孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，使用TBS/T溶液洗滌3次，每次10分鐘，然后再加膜放入熒光標(biāo)記的二抗稀釋液中，室溫孵育I小時(shí)。I小時(shí)之后，用TBS/T溶液洗滌膜3次，使用Odyssey紅外成像儀觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。
[0060]由圖1和圖2可以看出，DuIn抗體可抑制ERp57fl/fl小鼠血小板聚集，而不抑制PF4-Cre/ERp57fl/fl小鼠的血小板聚集(刺激劑Thrombin0.015U)，以上結(jié)果表明DuIn抗體特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白。
[0061]實(shí)施例4 =DuIn抗體抑制血小板聚集試驗(yàn)
[0062]人來(lái)源全血使用檸檬酸鈉作為抗凝劑。人來(lái)源全血加入Tyrode’ sbuffer(l:3)稀釋，然后800rpm,室溫離心10min,取上層富含血小板血衆(zhòng)至新的離心管。富血小板血衆(zhòng)再經(jīng)1300rpm,室溫離心15min,棄去上清,獲得血小板沉淀。血小板沉淀加入適當(dāng)體積的Tyrode’s buffer,緩慢吹打制成洗漆血小板懸液,計(jì)數(shù),調(diào)整血小板濃度為2 X 108/ml。使用雙通道血小板聚集儀(美國(guó)Chixmo-Log公司產(chǎn)品)，通過(guò)透光度的變化測(cè)試血小板的聚集。血小板聚集儀的溫度設(shè)置為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)置為1200rpm。取300 μ I洗滌血小板血液加入聚集管中，分別加入不同濃度的DuIn抗體和對(duì)照抗體IgG2a，37°C孵育5分鐘。然后加入3μ IlOOmM CaCl2溶液，使終濃度為ImM。將聚集管放入聚集儀中，加入刺激劑Thrombin0.025U,記錄聚集曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0063]由圖3的結(jié)果可以看出，不同濃度的DuIn抗體的透光度明顯低于對(duì)照IgG的透光度，表明DuIn抗體可有效抑制血小板聚集。
[0064]實(shí)施例5 =DuIn抗體抑制血小板表面整合素a IIb β 3的活化
[0065]取小鼠富含血小板血漿10 μ 1，分別加入DuIn抗體(30 μ g/ml)或者對(duì)照抗體鼠IgG2a，室溫孵育10分鐘。10分鐘后，加入適當(dāng)濃度的刺激劑convulxin，室溫孵育5分鐘，然后加入FITC標(biāo)記的PAC-1抗體(BD公司，可結(jié)合血小板表面整合素a IIbP 3) I μ 1，避光孵育15分鐘。孵育完畢后，加入290μ I PBS溶液稀釋樣品，再加入終濃度為I %的多聚甲醛固定樣品。制備好的樣品使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析并記錄柱形圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0066]由圖4的結(jié)果可以明顯看出，DuIn抗體可明顯抑制血小板表面整合素a IIb β 3的活化，從而在試驗(yàn)結(jié)果上表現(xiàn)出較低的熒光強(qiáng)度。
[0067]實(shí)施例6:DuIn抗體抑制血小板表面p-selectin的表達(dá)
[0068]取小鼠富含血小板血漿10 μ 1，分別加入DuIn抗體(30 μ g/ml)或者對(duì)照抗體鼠IgG2a，室溫孵育10分鐘。10分鐘后，加入適當(dāng)濃度的刺激劑convulxin，室溫孵育5分鐘，然后加入PE標(biāo)記的抗p-selectin的抗體(eBioscience公司)0.1 μ I,避光孵育15分鐘。孵育完畢后，加入290μ I PBS溶液稀釋樣品，再加入終濃度為1%的多聚甲醛固定樣品。制備好的樣品使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析并記錄柱形圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。[0069]由圖5的結(jié)果可以明顯看出，DuIn抗體可明顯抑制血小板表面p-selectin的表達(dá)，從而在試驗(yàn)結(jié)果上表現(xiàn)出較低的熒光強(qiáng)度。
[0070]實(shí)施例7 =DuIn抗體抑制小鼠體內(nèi)血栓形成
[0071]取體重20~25克的C57BL/6雄性小鼠，腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(120mg/kg)麻醉小鼠。麻醉后的小鼠取仰臥位固定在解剖臺(tái)上，解剖臺(tái)溫度設(shè)定為37°C。在小鼠頸部中間線處做一縱向切口，用顯微鑷分離皮下組織，暴露出頸總動(dòng)脈，用顯微鑷分離處左側(cè)頸動(dòng)脈。實(shí)驗(yàn)前5分鐘，分別經(jīng)髂靜脈注射450 μ g的DuIn抗體和對(duì)照抗體IgG2a。5分鐘后，用濾紙(lmmx2mm)浸潤(rùn)5%的FeCl3溶液,將濾紙片放置到暴露的小鼠頸動(dòng)脈上2分鐘。兩分鐘后除去濾紙，滴加PBS清洗小鼠頸動(dòng)脈5次，然后在小鼠的頸部傷口處加上用于多普勒檢測(cè)的成像超聲導(dǎo)電膏。利用VisualSonics Vevo model2100小動(dòng)物超聲成像儀和小動(dòng)物血液流量傳感器(MS400，18-38MHz, VisualSonics)，在頻譜多普勒模式下觀察小鼠頸動(dòng)脈血流狀態(tài)。血管阻塞所需時(shí)間從最初的動(dòng)脈損傷開(kāi)始計(jì)算，直到血流最終消失。當(dāng)血流完全停止至少5分鐘時(shí)，說(shuō)明血管達(dá)到完全阻塞，記錄此時(shí)間為血管阻塞時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖6。
[0072]由圖6可知，由于DuIn抗體能夠抑制血栓的形成，從而導(dǎo)致其血管阻塞時(shí)間變長(zhǎng)，而對(duì)照抗體組的時(shí)間較短。
[0073]實(shí)施例8 =DuIn抗體抑制血小板積聚和纖維蛋白形成
[0074]激光誘導(dǎo)提睪肌動(dòng)脈血栓形成(活體熒光攝像顯微鏡法): [0075]熒光標(biāo)記抗體探針的制備:抗小鼠⑶41(整合素a IIb)單克隆抗體(cloneMWReg30)和抗 fibrin 單克隆抗體(clone NYBT2G1)分別購(gòu)自 BD Bioscience 和Accurate Chemical公司，二者在體內(nèi)可分別識(shí)別血小板血栓和生成的纖維蛋白。使用ImmunoPure Fab 試劑盒(Peirce 公司)制備 Fab 片段，分別用 Alexa Fluor488 或 AlexaFluor647 (Invitrogen)進(jìn)行突光標(biāo)記。
[0076]血栓形成模型的觀測(cè)方法:應(yīng)用腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(90mg/kg)，將小鼠麻醉，置于保溫毯，溫度保持在37°C。在頸靜脈留置插管，用于戊巴比妥維持麻醉和注射熒光標(biāo)記抗體CD41 (0.1 μ g/g) ant1-Fibrin(0.2 μ g/g)。在活體顯微鏡下，切開(kāi)陰囊，游離出提睪肌，固定于圓形托孔。在配有60倍水浸物鏡的顯微鏡下，對(duì)提睪肌動(dòng)脈血管壁定位，用Ablate?(31)微點(diǎn)激光器(Photonics Instruments)產(chǎn)生的激光誘導(dǎo)血管壁損傷，自血流流向的下游至上游誘導(dǎo)多處損傷。用突光顯微鏡(ZEISS, Examiner Dl)在每一損傷部位，用高靈敏度CCD數(shù)字錄像機(jī)Photometries (Cool SNAP HQ2)獲取標(biāo)記積聚的血小板和纖維蛋白的突光信號(hào)，記錄5分鐘(50frames/秒)，應(yīng)用Slide Book5.5軟件(IntelligentImaging Innovations)對(duì)突光圖像進(jìn)行分析,通過(guò)計(jì)算損傷的血栓的突光值中位數(shù)作為反映血栓形成的動(dòng)態(tài)曲線。應(yīng)用上述方法，對(duì)分別注射Mouse IgG(對(duì)照小鼠抗體)和DuIn抗體(450μ g/mice)兩組小鼠提睪肌動(dòng)脈血栓形成進(jìn)行比較，每組小鼠4只，每只激光誘導(dǎo)損傷30-40處，結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。
[0077]與注射Mouse IgG小鼠相比，注射DuIn抗體的小鼠損傷部位的血小板積聚和纖維蛋白形成均明顯受到抑制。
[0078]實(shí)施例9:DuIn抗體抑制凝血酶形成
[0079]將人新鮮外周血與PBSl:1 稀釋后用 CEDARLANE 公司 Lympliolyte? -H(CL5020)分離液密度梯度離心，室溫800g20分鐘，吸取中間層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入PBS稀釋后800g離心10分鐘，去上清，沉淀加PBS重懸再400g離心10分鐘，用含5% FBS的1640培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)備用。取I X IO5PBMC分別加入100 μ g/mlControl mouse IgG和DuIn抗體，混勻，加入100ng/ml LPS,置于含5% CO2的37°C培養(yǎng)箱中4小時(shí)。使用Technoclone公司Ceveron Alpha TGA分析儀分別加入40 μ I新鮮血漿(含4 μ M CTI) ,40 μ I熒光底物(能被凝血酶切割而產(chǎn)生熒光)和35μ 125mM Ca2+，檢測(cè)熒光的增加量，Ceveron軟件自動(dòng)將熒光的增加值轉(zhuǎn)換成凝血酶的生成量，結(jié)果見(jiàn)圖9。
[0080]由圖9的曲線圖可以看出，注射DuIn抗體組的凝血酶生成量明顯低于注射對(duì)照小鼠抗體(Control mouse IgG)組,表明DuIn抗體可顯著抑制凝血酶的生成,具有抗凝血作用。 [0081]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9153。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，由以下方法制備獲得: SEQ ID勵(lì):1所示氨基酸序列的蛋白免疫8八1^/(:小鼠，3天后取841^/(:小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按照5: I~10: I的比例混合，利用PEG進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后進(jìn)行HAT培養(yǎng)，然后吸取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞用有限稀釋法克隆至能穩(wěn)定分泌抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白單克隆抗體，獲得所述單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，所述SEQID ΝΟ:1所示氨基酸序列的蛋白免疫BALB/C小鼠具體為: 取SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白100 μ g加等質(zhì)量福氏完全佐劑對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第一次皮下注射，21天后取SEQ ID ΝΟ:1所示氨基酸序列的蛋白300yg加等質(zhì)量福氏不完全佐劑對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第二次皮下注射，10天后尾部采血并用ELISA間接法測(cè)定抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白的鼠血清效價(jià)，選擇效價(jià)高的BALB/C小鼠用SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的蛋白IOOyg進(jìn)行免疫。
4.保藏編號(hào)為CGMCCN0.9153的雜交瘤細(xì)胞在制備抗SEQ ID ΝΟ:1所示氨基酸序列蛋白單克隆抗體中的應(yīng)用。
5.一種抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白單克隆抗體，其特征在于，由保藏編號(hào)為CGMCC N0.9153的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生。
6.權(quán)利要求5所述單克隆抗體在制備治療血栓性疾病或凝血性疾病藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述血栓性疾病為冠脈綜合征或深靜脈血栓。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述凝血性疾病為彌散性血管內(nèi)凝血病。
9.權(quán)利要求5所述單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、用不完全佐劑免疫BALB/C小鼠I~2周后，分別往小鼠腹腔注射IXlO6個(gè)保藏編號(hào)為CGMCC N0.9153的雜交瘤細(xì)胞，接種所述雜交瘤細(xì)胞7~10天后產(chǎn)生腹水； 步驟2、從所述BALB/C小鼠腹腔抽取腹水，置于15ml離心管中，2000rpm離心10min，以沉淀血細(xì)胞及其它雜質(zhì)，將上清轉(zhuǎn)移入新的離心管中，放入_80°C冰箱保存，純化前，使用0.1M的PBS溶液按1:3的比例稀釋腹水； 取0.5ml Protein G裝入吸附柱中，加入20倍柱體積的0.1M的PBS緩沖液平衡柱子，以備上樣； 取稀釋的腹水，加入純化柱中，每次2-3ml，腹水循環(huán)過(guò)柱3遍； 步驟3、待腹水循環(huán)過(guò)柱3遍后，加上30倍柱體積的0.1M的PBS緩沖液充分洗滌柱子，洗掉雜蛋白； 洗滌完畢后，加0.1Μ、ρΗ值為2.8的Gly洗脫液洗脫結(jié)合的抗體，預(yù)先在收集管中加入25ullM、pH值8.9的Tris-Hcl，每管收集500ul的洗脫液，連續(xù)收集10管； 使用顯色液測(cè)定每管收集液是否含有蛋白質(zhì)，取蛋白含量最多的收集液進(jìn)行透析，透析后獲得抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白蛋單克隆抗體。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK103966173SQ201410184173
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】武藝, 周俊松, 陳鳳梧 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)