藻藍蛋白β亞基基因的克隆表達的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及藻藍蛋白β亞基基因的克隆表達。通過基因工程手段將藻藍蛋白β亞基基因克隆于pET-32a質粒載體，重組質粒轉化到感受態(tài)大腸桿菌BL21中。構建的工程菌的表達產(chǎn)物用鎳親和層析柱純化后，所得融合蛋白對Hela細胞的增殖有一定的抑制作用。
【專利說明】藻藍蛋白β亞基基因的克隆表達
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及藻藍蛋白β亞基基因的克隆表達。
技術背景
[0002]藻藍蛋白(phycocyanin, PC)是一種存在于藍藻和紅藻細胞內(nèi)的光合色素，能高效捕獲光能。其基本構建單位是α和β亞基，分子量在17kD至22kD之間。α亞基由162個氨基酸殘基組成，β亞基由172個氨基酸殘基組成。研究發(fā)現(xiàn)，藻藍蛋白的生理活性包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥、提高機體抗輻射能力、保護神經(jīng)組織免受損傷、增強免疫功能、抑制溶血等。將藻藍蛋白的β亞單位在大腸桿菌中表達，發(fā)現(xiàn)重組體藻藍蛋白β單位有抗癌活性，但是在正常細胞中有很小的反應，抑制癌細胞增殖和誘導細胞凋亡可能會使重組體藻藍蛋白β單位成為一種有效的癌癥預防和治療的手段。研究發(fā)現(xiàn)與相同摩爾濃度的藻藍蛋白及其α亞基相比，β亞基對某些腫瘤細胞的生長有更強的抑制作用，提示β亞基具有成為抗腫瘤藥物的良好潛力。
[0003]本發(fā)明首先克隆表達藻藍蛋白β亞基的基因，并純化表達的融合蛋白，體外檢測該蛋白對Hela細胞生長的抑制作用，為其作為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所述的藻藍蛋白β亞基融合蛋白是通過重組質粒構建后轉化到感受態(tài)大腸桿菌，通過誘導表達 ，純化所得蛋白而得。其制備方法如下:
[0005]從本實驗室保存的含有操監(jiān)蛋白全部β亞基和部分Ct亞基基因的重組質粒上，PCR法擴增出β亞基基因片段，用內(nèi)切酶BamH 1、HindIII37°C雙酶切β亞基基因片段和pET-32a質粒1.5h，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的產(chǎn)物再16°C連接16h。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21中。工程菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)到細菌生長的對數(shù)期，加入終濃度為0.2mmol/L的IPTG，20°C誘導表達20h。誘導結束后lOOOOrpm、15min離心收集菌體，按照每收集IL菌體加入50ml緩沖液的比例，用緩沖液重懸菌體，60%功率超聲破碎，12000rpm、30min收集上清，用鎳親和層析柱純化得到藻藍蛋白β亞基的融合蛋白。
[0006]將本發(fā)明所述的含藻藍蛋白β亞基的融合蛋白作用于Hela細胞，MTT法檢測其對Hela細胞增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白對Hela細胞有明顯的增殖抑制作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1為PCR擴增出的藻藍蛋白β亞基基因序列。M =DNAMarker ；1:藻藍蛋白β亞
基基因O
[0008]圖2為菌液PCR擴增出的藻藍蛋白β亞基基因序列。M:DNA Marker ；1:藻藍蛋白β亞基基因。
[0009]圖3為提取的重組質粒雙酶切驗證。M =DNAMarker ；1:雙酶切得到的藻藍蛋白β
亞基基因。[0010]圖4為融合蛋白鎳親和層析柱純化結果。M:蛋白marker ；1:誘導前菌體；2:誘導后菌體；3:菌體超聲破碎離心后上清；4:菌體超聲破碎離心后沉淀；5:融合蛋白鎳親和層析柱純化效果。
【具體實施方式】
[0011]下面結合一些實例并參照圖表數(shù)據(jù)對本發(fā)明做進一步的說明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0012]實施例1
[0013]含藻藍蛋白β亞基基因的重組質粒的構建
[0014]選擇藻藍蛋白β亞基對應的基因序列克隆，序列長度為519bp。在目的基因的上下游引物中分別加入BamH 1、HindIII酶切位點。用本實驗室保存的含藻藍蛋白全部β亞基和部分α亞基基因的重組質粒PMD18-T-PC作為模板，并進行PCR擴增β亞基對應基因。PCR反應結束后，產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，如圖1，切下含有目的DNA的凝膠，按照DNA凝膠回收試劑盒說明書回收目的DNA片段。目的基因片段與pET-32a質粒載體同時雙酶切，取雙酶切產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，切下含有目的DNA的凝膠，按照凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段。將目的基因片段與雙酶切后的原核表達載體pET-32a在16°C、16h條件下連接。
[0015]實施例2
[0016]重組質粒轉化到感受態(tài)大腸桿菌BL21中 [0017]取連接產(chǎn)物10 μ I加入到50 μ I已制備好的大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，輕輕混勻后冰浴30min ;42°C水浴中熱激90s后，迅速再次冰浴3min ;加入500 μ I LB液體培養(yǎng)基并充分混勻，37°C、220rpm振搖培養(yǎng)Ih ;離心棄上清留取約100 μ I轉化菌液，涂布于含氨芐青霉素(Amp+，100 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)12_16h。挑取轉化成功的單克隆進行菌液PCR驗證(圖2)、提取質粒雙酶切驗證(圖3)，并測序。
[0018]實施例3
[0019]工程菌的誘導表達
[0020]將保存的菌種接種于含LB培養(yǎng)基的小試管中，37°C、220rpm搖至菌液飽和，作為種子菌。將飽和菌液按1:100比例轉接到含LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37度220rpm搖到0D600在 0.6-0.8 之間。加入終濃度為 0.2mmol/L 的 IPTG，20°C誘導 20h。lOOOOrpm、15min 離心收集菌體。
[0021]實施例4
[0022]融合蛋白的純化
[0023]收集的菌體用緩沖液重懸，超聲破碎菌體，12000rpm、30min收集上清。鎳離子親和層析柱純化蛋白:用結合緩沖液平衡柱子，將要流盡時，將已用0.45 μ m微孔濾膜過濾后的超聲上清液加入柱中；待上清液流盡，用結合緩沖液沖洗填料洗去未結合的蛋白；最后用含200mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫液并濃縮處理，加入終濃度為10%的甘油并用0.22 μ m無菌濾器過濾后備用。
[0024]實施例5
[0025]融合蛋白對Hela細胞的增殖抑制實驗[0026]將純化后的含藻藍蛋白β亞基的融合蛋白作用于宮頸癌細胞Hela，終濃度分別為 0,0.625、1.25,2.5、5、10ymol/L 的融合蛋白及 10ymol/L 的 pET_32a 空載體蛋白，72h后，MTT法檢測Hela細胞存活率。具體操作步驟:取生長良好的對數(shù)期Hela細胞，用DMEM培養(yǎng)基制成濃度為2 X IO4個/mL的單細胞懸液，每孔加入100 μ I于96孔板中培養(yǎng)至細胞貼壁。實驗設空白:用于調零；陰性對照組:只加10 μ mo I/L的pET-32a空載體蛋白；實驗組:0.625、1.25、2.5、5、10μπιΟ1/1的含藻藍蛋白β亞基的融合蛋白組，每孔加培養(yǎng)基至總體積100 μ I。37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后棄去上清液，加入5mg/mL的MTT，每孔10μ 1，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清液，加入DMS0150y 1/L孔，振蕩混勻后，在酶標儀上測定570nm下的OD值，按下式計算融合蛋白對Hela細胞生長抑制率:
[0027]抑制率％= (1-0D實驗組/OD陰性對照組)X100%
[0028]表1
[0029]
【權利要求】
1.一種藻藍蛋白β亞基基因在質粒載體上的克隆，其特征在于:質粒載體為pET-32a，酶切位點為BamH I, HindII1。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組質粒，其特征在于:重組質粒需轉化到感受態(tài)大腸桿菌BL21中以表達融合蛋白。
3.—種權利要求1所述的重組質粒的構建方法，其特征在于:PCR法擴增出藻藍蛋白β亞基基因，將擴增出的基因片段和質粒載體pET-32a同時用BamH 1、HindIII內(nèi)切酶于37°C雙酶切1.5h，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的產(chǎn)物，16°C連接16h。
4.根據(jù)權利要求3所述，一種構建的工程菌表達的融合蛋白，其特征在于:融合蛋白用鎳親和層析柱純化后，達電泳純。
5.根據(jù)權利要求4所述的融合蛋白，其特征在于:對Hela細胞的增殖有一定的抑制作用。
【文檔編號】C12N15/66GK103923938SQ201410186005
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權日:2014年4月30日
【發(fā)明者】歐瑜, 張靜 申請人:中國藥科大學