一種應(yīng)用脈沖直流電誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種應(yīng)用脈沖直流電誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的方法，采用作用于細(xì)胞的脈沖直流電電場強(qiáng)度為50-1000mv/mm、脈寬為1％-99％、頻率為1mHz-1MHz。本發(fā)明的有益效果是：1)脈沖直流電同樣具有細(xì)胞電趨性誘導(dǎo)效應(yīng)，且能夠以更短的累計電場作用時間達(dá)到與持續(xù)直流電等同的效果；2)較之持續(xù)直流電，脈沖直流電對電趨性誘導(dǎo)系統(tǒng)中細(xì)胞培養(yǎng)基及緩沖液的pH值和細(xì)胞培養(yǎng)小室兩端的電壓與整個系統(tǒng)的電阻影響更小，表明應(yīng)用脈沖直流電有助于降低電解效應(yīng)，從而在實際應(yīng)用中將明顯優(yōu)于持續(xù)直流電。
【專利說明】一種應(yīng)用脈沖直流電誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物電場【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種應(yīng)用脈沖直流電誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的方法。
【背景技術(shù)】 [0002]細(xì)胞有效的向創(chuàng)面遷移是哺乳動物創(chuàng)面愈合的基礎(chǔ)。誘導(dǎo)細(xì)胞方向性遷移的因素眾多(包括:電場、本身損傷刺激、趨化物質(zhì)梯度、接觸抑制釋放等)，有人通過實驗證明電場是所有誘導(dǎo)因素中的主要誘因，與創(chuàng)面愈合方向一致的電場能夠促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，相反的電場會阻止創(chuàng)面愈合或加大創(chuàng)面。電場誘導(dǎo)細(xì)胞定向遷移是依賴于細(xì)胞的電趨性。細(xì)胞電趨性是指在離體環(huán)境下，通過特定方式在細(xì)胞兩端加以一定電壓的持續(xù)直流電，細(xì)胞能表現(xiàn)出向電場陽極或陰極方向定向移動的特性。研究發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)胞，特別是上皮來源的細(xì)胞，在適當(dāng)強(qiáng)度的持續(xù)直流電刺激下均會表現(xiàn)出不同程度的電趨性。這一發(fā)現(xiàn)為創(chuàng)面愈合、腫瘤轉(zhuǎn)移、再生醫(yī)學(xué)等與細(xì)胞遷移相關(guān)的領(lǐng)域提供了新的研究思路和干預(yù)策略。
[0003]現(xiàn)階段研究細(xì)胞電趨性的方式絕大多數(shù)都是采用持續(xù)直流電(continuousdirect current,⑶C)進(jìn)行刺激,但由于電場的熱效應(yīng)和電解作用，長時間的刺激會對細(xì)胞造成損傷，從而阻礙該技術(shù)的臨床應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用脈沖直流電(pulse direct current, F1DC)誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的方法，一定程度上解決了持續(xù)直流誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性容易造成細(xì)胞損傷的問題。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是作用于細(xì)胞的脈沖直流電電場強(qiáng)度為:50-1000mv/_，脈寬為 1% -99%，頻率為 ImHz-1MHz。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)特點還在于脈沖直流電電場強(qiáng)度為150mv/mm，脈寬為60%，頻率為IOOmHz0
[0007]本發(fā)明的有益效果是:1)用脈沖直流電刺激細(xì)胞，能夠以更短的累計電場作用時間達(dá)到與持續(xù)直流電基本等效的電趨性誘導(dǎo)效果；2)降低直流電的電解效應(yīng)，從而在實際應(yīng)用中將明顯優(yōu)于持續(xù)直流電。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1是本發(fā)明中誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性實驗裝置結(jié)構(gòu)示意圖；
[0009]圖2是本發(fā)明中可用于誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的細(xì)胞培養(yǎng)小室實驗裝置俯視圖；
[0010]圖3是本發(fā)明在電場強(qiáng)度為50mv/mm、頻率為IOOmHz時細(xì)胞方向性隨脈寬變化的示意圖；可見細(xì)胞方向性隨脈寬增加而加大，當(dāng)D(脈寬)為20%、40%、60%時，細(xì)胞方向性低于⑶C刺激的結(jié)果(P〈0.01);當(dāng)D = 80%時，細(xì)胞達(dá)到與⑶C刺激基本等效的方向性(P>0.05)；[0011]圖4是本發(fā)明在電場強(qiáng)度為150mv/mm、頻率為IOOmHz時細(xì)胞方向性隨脈寬變化的示意圖；可見細(xì)胞方向性隨脈寬增加而加大，當(dāng)D為20%、40%時，細(xì)胞方向性低于CDC刺激的結(jié)果(林P〈0.01);當(dāng)0 = 60%及以上時，細(xì)胞達(dá)到與⑶C刺激基本等效的方向性(Ρ>0.05)；
[0012]圖5是本發(fā)明在電場強(qiáng)度為250mv/mm、頻率為IOOmHz時細(xì)胞方向性隨脈寬變化的示意圖；可見細(xì)胞方向性隨脈寬增加而加大，當(dāng)D為20%時，細(xì)胞方向性低于CDC刺激的結(jié)果(**Ρ〈0.01);當(dāng)D = 40%及以上時，細(xì)胞達(dá)到與⑶C刺激基本等效的方向性(Ρ>0.05)；
[0013]圖6是系統(tǒng)在加以roc(場強(qiáng)為150mv/mm、頻率為lOOmHz、脈寬為60% )和CDC兩種方式的電刺激時，陽極端(a)和陰極端(b)細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值隨時間變化的示意圖；(a):刺激后3、6h，CDC引起的陽極端培養(yǎng)基PH增加明顯高于PDC(*P〈0.05) ； (b):刺激后
3、6h，CDC引起的陰極端培養(yǎng)基PH增加明顯高于PDC(*P〈0.05，**Ρ〈0.01)；
[0014]圖7是系統(tǒng)在加以roc(場強(qiáng)為150mv/mm、頻率為lOOmHz、脈寬為60% )和⑶C兩種方式的電刺激時，陽極端(a)和陰極端(b)培養(yǎng)基mv值(反應(yīng)H+濃度的一個電位信號值)隨時間變化的示意圖；在刺激后不同時間，CDC引起的陽極端(a)和陰極端(b)培養(yǎng)基mv值的降低均低于I3DC ;在刺激后3、6h，兩組比較有顯著差異(*P〈0.05)；
[0015]圖8是系統(tǒng)在加以roc(場強(qiáng)為150mv/mm、頻率為lOOmHz、脈寬為60% )和CDC兩種方式的電刺激時，陽極端(a)和陰極端(b)電解緩沖液的PH值隨時間變化的示意圖；
(a):隨著刺激時間延遲，陽極端電解緩沖液PH值均呈上升趨勢，組間比較無顯著差異；
(b):隨著刺激時間延遲，陰極端電解緩沖液PH值均呈上升趨勢。組間比較，⑶C引起的PH增加在 1.5h、3h 和 6h 時明顯高于 PDC(*P<0.05，**P〈0.01)；
[0016]圖9是系統(tǒng)在加以roc(場強(qiáng)為150mv/mm、頻率為lOOmHz、脈寬為60% )和CDC兩種方式的電刺激時，陽極端(a)和陰極端(b)電解緩沖液的mv值隨時間變化的示意圖；(a):隨著刺激時間延長，陽極端電解緩沖液mv值均呈下升趨勢。組間比較，CDC引起的mv值降低在6h時明顯高于H)C(*P〈0.05) ； (b):隨著刺激時間延長，陰極端電解緩沖液mv值呈下升趨勢。組間比較，CDC引起的mv值降低在1.5h、3h和6h時明顯高于H)C(*P〈0.05，**Ρ〈0.01)；
[0017]圖10是系統(tǒng)在加以roc(場強(qiáng)為150mv/mm、頻率為lOOmHz、脈寬為60% )和CDC兩種方式的電刺激時，培養(yǎng)小室兩端的電壓變化率(a)和整個系統(tǒng)的電阻變化率(b)隨時間變化的示意圖；(a):隨著刺激時間延長，兩組均出現(xiàn)電壓下降，CDC引起的電壓下降變化率在0.5-6h各時間點均明顯高于roc(**p〈0.01) ； (b):隨著刺激時間延長，兩組均出現(xiàn)系統(tǒng)電阻增加，CDC引起的電阻增加變化率在0.5-6h各時間點均明顯高于roc(**p〈0.01)。
【具體實施方式】
[0018]下面通過附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行說明。
[0019]脈沖直流電是一種周期性出現(xiàn)的直流電，包括場強(qiáng)(E)、脈寬(D)、頻率(f)三個可調(diào)參數(shù)，其中，場強(qiáng)表示所施加電場的強(qiáng)度，單位是mv/_ ;脈寬表示一個周期中電刺激時間的百分比(它決定一個周期中細(xì)胞處于電刺激時間的長短，剩余的時間細(xì)胞處于無電刺激狀態(tài))，單位是％ ;頻率表示單位時間Is內(nèi)周期性電刺激的次數(shù)，單位是Hz。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種應(yīng)用PDC誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的方法，其特征在于:采用電場強(qiáng)度為50-1000mv/mm(優(yōu)選 l50mv/mm)、脈寬為 1% -99% (優(yōu)選 60% )、頻率為 ImHz-1MHz (優(yōu)選IOOmHz)的脈沖直流電對細(xì)胞進(jìn)行電刺激，以誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性。它與持續(xù)直流電刺激方法不同的是給電方式的不同。脈沖直流電是按照一定的電場強(qiáng)度、脈寬和頻率，對細(xì)胞進(jìn)行周期性的電刺激。
[0020]圖1為驗證本發(fā)明的實驗裝置。I為PDC電源，能夠提供包括脈寬、場強(qiáng)、頻率三個可變參數(shù)的直流電源；2為盛有電解緩沖液的燒杯。導(dǎo)線的一端與roc電源的正或負(fù)極連接，另一端通過銀絲插入電解緩沖液中。3為灌滿瓊脂的U形玻璃管。4為細(xì)胞培養(yǎng)皿。5為誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的細(xì)胞培養(yǎng)小室。培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基與細(xì)胞培養(yǎng)小室中培養(yǎng)基相通。兩個U形玻璃管均一端插入到電解緩沖液中，另一端插入到培養(yǎng)皿中細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0021]圖2為誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的細(xì)胞培養(yǎng)小室實驗裝置(圖1中標(biāo)注5)的俯視圖。用于誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的細(xì)胞培養(yǎng)小室是由培養(yǎng)皿底面、上下兩側(cè)蓋玻片和頂部蓋玻片構(gòu)成的空間。上下兩側(cè)蓋玻片(型號為N0.1，厚度約0.17mm)圍成大小為18mmX 9mm的方形區(qū)域，其內(nèi)接種細(xì)胞；方形區(qū)域的上方蓋以頂部蓋玻片，由此便構(gòu)成大小為18mmX9mmX0.17mm的細(xì)胞培養(yǎng)小室空間。圖中四條白色豎帶為涂布在細(xì)胞培養(yǎng)小室實驗裝置左右兩側(cè)的3140硅膠，3140硅膠具有不導(dǎo)電和不溶于水的特性，其可將細(xì)胞培養(yǎng)小室實驗裝置與培養(yǎng)皿左右兩側(cè)的培養(yǎng)基分隔開，而僅留正中間的細(xì)胞培養(yǎng)小室左右兩側(cè)與培養(yǎng)皿左右兩側(cè)培養(yǎng)基連通，由此構(gòu)成一個可實施細(xì)胞電趨性誘導(dǎo)和觀察細(xì)胞運動情況的細(xì)胞培養(yǎng)小室。
[0022]圖3、4、5:為Balb/c乳鼠來源的原代表皮細(xì)胞在不同強(qiáng)度PDC作用180min條件下，其細(xì)胞方向性隨電場脈寬變化的情況，及其與CDC作用180min時的對比結(jié)果。細(xì)胞在電場作用下運動的方向性是反映細(xì)胞電趨性的關(guān)鍵指標(biāo)。方向性的強(qiáng)弱通過cos Θ表示(Θ為細(xì)胞起點和終點 的連線與電場線的夾角)。當(dāng)細(xì)胞移行的方向與電場方向同向或反向平行時，cos Θ等于I或-1，表示細(xì)胞電趨性最好；當(dāng)細(xì)胞移行的方向與電場方向垂直時，COS Θ等于O,表示細(xì)胞電趨性最差。PDC的電場場強(qiáng)分別為50mv/mm(圖3)、150mv/mm(圖4)和250mv/mm(圖5)，頻率均為lOOmHz。在這三種不同場強(qiáng)刺激條件下，當(dāng)脈寬分別為80%、60%、40%時，細(xì)胞的方向性大小與采用⑶C刺激對比無顯著差異(*P〈0.05, **P〈0.01)。此結(jié)果提示:1、PDC能誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性；2、PDC能以更少的累計電刺激時間達(dá)到與CDC等效的細(xì)胞電趨性誘導(dǎo)效應(yīng)，且隨著場強(qiáng)的增加，所需要的累計電刺激時間越少。例如，在圖3(場強(qiáng):50mv/mm)中，脈寬為80%的PDC刺激180min，其細(xì)胞方向性與采用⑶C刺激180min基本等效，即意味著該條件下細(xì)胞采用PDC方式的累計電刺激時間達(dá)144min(180X80%)時，其方向性大小與采用CDC方式累計電刺激時間達(dá)180min時基本相等。在圖5 (場強(qiáng):250mv/mm)中，脈寬為40%的PDC刺激180min，其細(xì)胞方向性與采用⑶C刺激180min基本等效，即意味著該條件下細(xì)胞采用PDC方式的累計電刺激時間達(dá)72min(180X40%)時，其方向性大小與采用CDC方式累計電刺激時間達(dá)180min時基本相等。
[0023]圖6、圖7:細(xì)胞電趨性誘導(dǎo)系統(tǒng)在加以I3DC(場強(qiáng)為150mv/mm、頻率為lOOmHz、脈寬為60% )和CDC兩種方式的電刺激時，陽極端(a)和陰極端(b)細(xì)胞培養(yǎng)基的PH和mv值隨時間變化的情況及其在每個時間點兩種電場對比的結(jié)果(*P〈0.05, **P〈0.01);此結(jié)果表明PDC所引起的培養(yǎng)基堿化效應(yīng)要低于⑶C，在電刺激3、6h時有顯著差異(P〈0.05)，且電刺激時間越長，二者間差異越大。
[0024]圖8、圖9:細(xì)胞電趨性誘導(dǎo)系統(tǒng)在加以I3DC(場強(qiáng)為150mv/mm、頻率為lOOmHz、脈寬為60% )和CDC兩種方式的電刺激時，陽極端(a)和陰極端(b)電解緩沖液的PH和mv值隨時間變化的情況及其在每個時間點兩種電場對比的結(jié)果(*P〈0.05, **P〈0.01);此結(jié)果表明PDC所引起的電解緩沖液堿化效應(yīng)要低于CDC，且電刺激時間越長，二者間差異越大。
[0025]圖10:細(xì)胞電趨性誘導(dǎo)系統(tǒng)在加以roc (場強(qiáng)為150mv/mm、頻率為IOOmHz、脈寬為60%)和CDC兩種方式的電刺激時，細(xì)胞培養(yǎng)小室兩端的電壓變化率(a)和整個系統(tǒng)的電阻變化率(b)隨時間變化的情況及其在每個時間點兩種電場對比的結(jié)果(*P〈0.05, **P〈0.01)。該結(jié)果表明PDC所引起的細(xì)胞培養(yǎng)小室兩端電壓和整個系統(tǒng)的電阻變化要低于CDC，提示PDC對系統(tǒng)的穩(wěn)定性更好。
[0026]下面列舉具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行說明:
[0027]實施例1:作用于細(xì)胞的脈沖直流電電場強(qiáng)度為1000mv/mm、脈寬為1%、頻率為10Hz，測得細(xì)胞的方向性遷移cos Θ為0.53±0.02(M±SEM)。[0028]實施例2:作用于細(xì)胞的脈沖直流電電場強(qiáng)度為500mv/mm、脈寬為10%、頻率為IkHz,測得細(xì)胞的方向性遷移cos Θ為0.72±0.03 (M±SEM)。
[0029]實施例3:作用于細(xì)胞的脈沖直流電電場強(qiáng)度為250mv/mm、脈寬為40%、頻率為IOOmHz,測得細(xì)胞的方向性遷移cos Θ為0.80±0.03 (M±SEM)。
[0030]實施例4:作用于細(xì)胞的脈沖直流電電場強(qiáng)度為50mv/mm、脈寬為60%、頻率為500mHz,測得細(xì)胞的方向性遷移cos Θ為0.61 ±0.02 (M±SEM)。
[0031]實施例5:作用于細(xì)胞的脈沖直流電電場強(qiáng)度為lOOOmv/mm、脈寬為80%、頻率為ImHz,測得細(xì)胞的方向性遷移cos Θ為0.94±0.03 (M±SEM)。
[0032]實施例6:作用于細(xì)胞的脈沖直流電電場強(qiáng)度為600mv/mm、脈寬為99%、頻率為IMHz,測得細(xì)胞的方向性遷移cos Θ為0.92±0.03 (M±SEM)。
[0033]實施例7:作用于細(xì)胞的脈沖直流電電場強(qiáng)度為150mv/mm、脈寬為60%、頻率為IOOmHz,測得細(xì)胞的方向性遷移cos Θ為0.73±0.02 (M±SEM)。
【權(quán)利要求】
1.一種采用脈沖直流電誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的方法，其特征在于:作用于細(xì)胞的脈沖直流電電場強(qiáng)度為50-1000mv/mm、脈寬為1% -99%、頻率為ΙΗζ-ΙΜΗζ。
2.按照權(quán) 利要求1所述一種采用脈沖直流電誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的方法，其特征在于:所述脈沖直流電電場強(qiáng)度為150mv/mm、脈寬為60%、頻率為lOOmHz。
【文檔編號】C12N13/00GK103952395SQ201410186031
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月5日
【發(fā)明者】張家平, 任淅, 郭小偉, 孫寰博, 劉杰 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院