一種實時熱啟動Taq酶及其制備方法
【專利摘要】一種實時熱啟動Taq酶及其制備方法，它涉及Taq酶的制備技術(shù)，即通過噬菌體表面展示肽技術(shù)，淘選出一種與Taq酶在65℃以下都有親和性的陽性噬菌體，通過擴增該噬菌體并用胰蛋白酶處理后經(jīng)超濾而得到含有親和配體肽的濾液?；蜻M一步分析該配體的序列組成，人工合成這一多肽配體。兩種配體可各自按一定比例與Taq酶混合，制備出一種實時熱啟動Taq酶。由于配體分子量小，熱變性過程不會降解，隨著溫度降至65℃以下，該配體又可以與Taq酶結(jié)合而封閉后者的酶活性，所以實現(xiàn)了實時熱啟動Taq酶的功能。同時短肽對整個PCR反應(yīng)體系的影響也小的多。
【專利說明】一種實時熱啟動Taq酶及其制備方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種實時熱啟動Taq酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】 [0003]熱啟動Taq酶已越來越多地被用于PCR之中，特別是在多位點基因復(fù)合擴增，如人或動植物的微衛(wèi)星基因，也叫短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)分析中用的更多，因為這種酶與普通Taq酶相比其最大的特點是:酶活是在反應(yīng)體系由高溫(95°C)降至退火溫度的過程中釋放恢復(fù)的，也就是說；是在反應(yīng)體系中引物與模板處于一種嚴(yán)謹(jǐn)性配對結(jié)合狀態(tài)下開始PCR的，所以這種DNA擴增是一種更嚴(yán)謹(jǐn)真實的擴增，雜帶更少，本底更少，噪音更低，擴增效率更高[1]。到目前為止，制備熱啟動Taq酶的方法有；1、石蠟包被法，
2、抗體介導(dǎo)抑制法，3、化學(xué)修飾法，4、ssDNA鏈(適配子)結(jié)合法,5、肝素鹽法。在我國有關(guān)研究熱啟動DNA聚合酶的報道文章還很少，更未見過用噬菌體展示肽親和配體(或短肽)結(jié)合普通Taq酶，來制備熱啟動Taq酶的報道。用短肽制備的熱啟動Taq酶與常規(guī)意義上的熱啟動Taq酶還有所不同，它無需95 °C預(yù)熱十幾分鐘，而是像普通Taq酶一樣直接進入PCR循環(huán)，縮短了反應(yīng)時間。同時，短肽熱穩(wěn)定性好，它的熱啟動不是反應(yīng)初始階段的一次性熱啟動，而是在整個PCR的每個循環(huán)中的熱啟動。短肽與抗體相比較，分子量小得多，穩(wěn)定性好，短肽可以通過胰蛋白酶水解Taq酶親和性噬菌體而獲得，也可直接通過人工合成來制備，免去了動物免疫、飼養(yǎng)、檢測、提取和純化……等一系列繁瑣的抗體生產(chǎn)程序，也降低了成本。選到的噬菌體表面展示肽親和配體及其肽序列可以一直沿用，一次投入終生受用。同時短肽對整個PCR反應(yīng)體系的影響也小的多熱啟動Taq酶已越來越多地被用于PCR之中，特別是在多位點基因復(fù)合擴增，如人或動植物的微衛(wèi)星基因，也叫短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandem repeat, STR)分析中用的更多，因為這種酶與普通Taq酶相比其最大的特點是:酶活是在反應(yīng)體系由高溫(95°C)降至退火溫度的過程中釋放恢復(fù)的，也就是說；是在反應(yīng)體系中引物與模板處于一種嚴(yán)謹(jǐn)性配對結(jié)合狀態(tài)下開始PCR的，所以這種DNA擴增是一種更嚴(yán)謹(jǐn)真實的擴增，雜帶更少，本底更少，噪音更低，擴增效率更高[1]。到目前為止，制備熱啟動Taq酶的方法有；1、石蠟包被法，2、抗體介導(dǎo)抑制法，3、化學(xué)修飾法，4、ssDNA鏈(適配子)結(jié)合法，5、肝素鹽法。在我國有關(guān)研究熱啟動DNA聚合酶的報道文章還很少，更未見過用噬菌體展示肽親和配體(或短肽)結(jié)合普通Taq酶，來制備熱啟動Taq酶的報道。用短肽制備的熱啟動Taq酶與常規(guī)意義上的熱啟動Taq酶還有所不同，它無需95 °C預(yù)熱十幾分鐘，而是像普通Taq酶一樣直接進入PCR循環(huán)，縮短了反應(yīng)時間。同時，短肽熱穩(wěn)定性好，它的熱啟動不是反應(yīng)初始階段的一次性熱啟動，而是在整個PCR的每個循環(huán)中的熱啟動。短肽與抗體相比較，分子量小得多，穩(wěn)定性好，短肽可以通過胰蛋白酶水解Taq酶親和性噬菌體而獲得，也可直接通過人工合成來制備，免去了動物免疫、飼養(yǎng)、檢測、提取和純化……等一系列繁瑣的抗體生產(chǎn)程序，也降低了成本。選到的噬菌體表面展示肽親和配體及其肽序列可以一直沿用，一次投入終生受用。同時短肽對整個PCR反應(yīng)體系的影響也小的多。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是提供一種實時熱啟動Taq酶及其制備方法，它可以取代金牌Taq酶，淘選到的具有表面展示肽親和配體的噬菌體及其親和配體肽序列可以一直用于該實時熱啟動Taq酶的制備，一次投入終生受用。
[0005]為了解決【背景技術(shù)】所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案:它通過噬菌體表面展示肽技術(shù)，從噬菌體展示肽庫中淘選出一種與Taq酶有親和性，而且在65°C以下這種親和性都很穩(wěn)定的陽性噬菌體，通過擴增該噬菌體并用胰蛋白酶處理并經(jīng)過超濾而得到含有親和配體肽的濾液 ；進一步分析該噬菌體表面展示肽親和配體的序列組成，人工合成這一多肽配體，兩種配體可各自按一定比例與Taq酶混合。
[0006]它的制備方法如下:1、用Taq酶蛋白包被酶標(biāo)板，通過噬菌體表面展示肽技術(shù)，生物淘選使與Taq酶具有親和性的噬菌體富集；
2、利用ELISA法進行陽性噬菌體克隆的鑒定，再通過提高ELISA法中洗滌緩沖液的溫度，篩選出與Taq酶在65°C以下親和性穩(wěn)定的陽性噬菌體，擴增該噬菌體并用胰蛋白酶處理之，再通過超濾得到含有親和配體肽的濾液；
3、或分析篩選到的噬菌體表面展示肽親和配體的序列組成，人工合成這段配體的序列
肽；
4、將含有親和配體肽的濾液或人工合成的肽與Taq酶蛋白按比例混合，即得到實時熱啟動Taq酶。
[0007]本發(fā)明是通過是通過噬菌體表面展示肽技術(shù)淘選到與Taq酶具有親和性的噬菌體表面展示肽親和配體。
[0008]本發(fā)明是通過提高ELISA法中洗滌緩沖液的溫度，篩選出與Taq酶在65°C以下親和性穩(wěn)定的陽性噬菌體。
[0009]本發(fā)明是通過擴增該噬菌體并用胰蛋白水解該噬菌體，再通過超濾得到含有親和配體肽的濾液。
[0010]本發(fā)明是通過分析該噬菌體表面展示肽親和配體的序列組成為七肽。
[0011]本發(fā)明具有以下有益效果:它可以取代金牌Taq酶，淘選到的具有表面展示肽親和配體的噬菌體及其親和配體肽序列可以一直用于該實時熱啟動Taq酶的制備，一次投入終生受用。
【具體實施方式】
[0012]本【具體實施方式】采用以下技術(shù)方案:它通過噬菌體表面展示肽技術(shù)，從噬菌體展示肽庫中淘選出一種與Taq酶有親和性，而且在65°C以下這種親和性都很穩(wěn)定的陽性噬菌體，通過擴增該噬菌體并用胰蛋白酶處理并經(jīng)過超濾而得到含有親和配體肽的濾液；進一步分析該噬菌體表面展示肽親和配體的序列組成，人工合成這一多肽配體，兩種配體可各自按一定比例與Taq酶混合。
[0013]它的制備方法如下:1、用Taq酶蛋白包被酶標(biāo)板，通過噬菌體表面展示肽技術(shù)，生物淘選使與Taq酶具有親和性的噬菌體富集；
2、利用ELISA法進行陽性噬菌體克隆的鑒定，再通過提高ELISA法中洗滌緩沖液的溫度，篩選出與Taq酶在65°C以下親和性穩(wěn)定的陽性噬菌體，擴增該噬菌體并用胰蛋白酶處理之，再通過超濾得到含有親和配體肽的濾液；
3、或分析篩選到的噬菌體表面展示肽親和配體的序列組成，人工合成這段配體的序列
肽；
4、將含有親和配體肽的濾液或人工合成的肽與Taq酶蛋白按比例混合，即得到實時熱啟動Taq酶。
[0014]本【具體實施方式】步驟I中是通過噬菌體表面展示肽技術(shù)淘選到與Taq酶具有親和性的噬菌體表面展示肽親和配體。
[0015]本【具體實施方式】步驟2中是通過提高ELISA法中洗滌緩沖液的溫度，篩選出與Taq酶在65°C以下親和性穩(wěn)定的陽性噬菌體。
[0016]本【具體實施方式】步驟2中是通過擴增該噬菌體并用胰蛋白水解該噬菌體，再通過超濾得到含有親和配體肽的濾液。
[0017]本【具體實施方式】步驟3中是通過分析該噬菌體表面展示肽親和配體的序列組成為七肽。
[0018]本【具體實施方式】步驟4中Pfu=IO8 -1O9的曬菌體胰蛋白酶酶解超濾液與10μ/Pg/? Taq酶等體積混合即成實時熱啟動Taq酶。而人工合成的配體序列肽與Taq酶蛋白混合的摩爾比為5一50:lo
[0019]本【具體實施方式】具有以下有益效果:它可以取代金牌Taq酶，淘選到的具有表面展示肽親和配體的噬菌體及其親和配體肽序列可以一直用于該實時熱啟動Taq酶的制備，一次投入終生受用。
[0020]實施例:
實施例一、制備實時熱啟動Taq酶一
O酶標(biāo)板的包被及封閉:用包被buffer (0.1MNaHCO3 pH8.6)將Taq酶蛋白的濃度稀釋至100ug/ml，作為第一輪淘選用的包被液，第二輪至第四輪包被液的濃度分別為:50ug/ml、25ug/ml和10ug/ml,酶標(biāo)板經(jīng)15W紫外燈間距IOcm照射15mim后，包被液按IOOul/孔分裝至四個孔中，另外用包被buffer包被兩個預(yù)處理孔，置自封袋中，4 一 8°C孵育過夜，棄包被液，用 TBST(50mMTris-HCl ρΗ7.5 150mMNaCl 0.5 % Tween20)洗板 4 次，每次3min,拍干,每孔加入350ul封閉液(I % BSA-包被buffer)，37°C封閉60min,棄封閉液，用 TBST (50mMTris-HCl ρΗ7.5 150mMNaCl 0.1 % Tween20)洗板 4 次，每次 3min,拍干。
[0021]2)噬菌體展示肽的預(yù)結(jié)合和親合:向上述步驟I)的兩個預(yù)處理孔中分別加入95ul的TBST和5ul的噬菌體展示肽庫(試劑盒內(nèi)容物)，混勻，室溫下與預(yù)處理孔中的BSA預(yù)結(jié)合20min，以除去肽庫中與BSA有親和性的噬菌體展示肽。然后再將該噬菌體展示肽庫液均分轉(zhuǎn)移至四個包被孔中(內(nèi)有50ulTBST)置37°C IOOrpm結(jié)合60min
3)噬菌體的洗脫及擴增:將上述步驟2)的酶標(biāo)板包被液棄之，用TBST洗板10次，洗去未結(jié)合及低親和力的噬菌體。每孔加入IOOul0.2M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.2含ImgBSA/ml)洗脫液，室溫，IO Orpm維持15min，解離已結(jié)合的噬菌體，吸出洗脫液立即加入60ul中和液(IMtris-HCl pH9, I),即得到第一循環(huán)淘洗物。
[0022]4)噬菌體的擴增:上述步驟3)的淘洗物除留下20ul用作滴度測定，其余的都轉(zhuǎn)入20mlER2738敏感態(tài)菌液中，置37°C 230rpm擴增4.5小時，。擴增液轉(zhuǎn)入離心管，4°C9000rpm離心10min，上清轉(zhuǎn)入新離心管，同條件再次離心。由上而下收集80 %上清液加入 1/6 體積的 PEG/NaCl(20 % PEG-8000 2.5M NaCl)，4°C孵育過夜。4°C 1000Orpm 離心15min,棄上清,沉淀重懸于ImlTBS中，室溫下1000Orpm離心5min,上清加入1/6體積的PEG/NaCl，冰浴60min, 4°C 1000Orpm離心 IOmin,沉淀重懸于 200ul TBS 0.02% NaN3 中，室溫下1000Orpm離心5min,上清即為第一循環(huán)擴增洗脫物。
[0023]5)重復(fù)上述步驟I)至4):如此反復(fù)“親和一淘洗一擴增”過程，通過4輪篩選直至洗脫的噬菌體滴度穩(wěn)定在一定數(shù)量級，鋪板，挑取單克隆噬菌斑。其中后3輪篩選時TBST中的Tween 20濃度增加為0.5 %。結(jié)果第4輪篩選后與第I輪相比，富集了 400倍(富集倍數(shù)=第4輪回收率/第I輪回收率)。
[0024]6)噬菌斑的擴增:第四輪噬菌體滴度測定時，在< 100個藍色噬菌斑(噬菌體單克隆)的平皿上，以無菌牙簽隨機挑取30個(I個/管)噬菌斑，轉(zhuǎn)入5mlER2738敏感態(tài)菌液中，置370C 230rpm擴增4.5小時，培養(yǎng)物經(jīng)室溫12000rpm離心5min得到上清即為擴增的單個噬菌體克隆。
[0025]7)陽性噬菌體克隆的鑒定:對上述步驟6)的單個噬菌體克隆采用ELISA法進行鑒定，即用含Taq酶(10ug/ml)的包被液，按IOOul/孔包被酶標(biāo)板30孔作為檢測孔，同時用含I % BSA的包被液包被30個空白對照孔，4°C一 8°C孵育過夜，經(jīng)封閉、洗板后，分列30對，將30個單克隆噬菌體(上清)按IOOul/孔分別對應(yīng)加入30對檢測孔和空白對照孔中，37 °C 孵育 2h、用 TBST 洗板4次，每次 3min，加入 HRP/Anti_M13 (1:4000) 37 °C 孵育 Ih,用TBST洗板4次，立即加入TMB顯色劑，37°C避光顯色15min，用2M硫酸中止反應(yīng)后，于450nm讀取吸光度值(A45tl )，以(A45tl )值高于空白對照3倍以上作為陽性。結(jié)果其中有5個噬菌體克隆顯示與Taq酶具有高親和性結(jié)合能力。
[0026]8)陽性噬菌體與Taq酶親和性的熱穩(wěn)定篩選:用含Taq酶(10ug/ml)的包被液，按IOOul/孔包被酶標(biāo)板，相對于上述步驟7)淘選到的5個陽性噬菌體，每個需6個孔，操作同步驟8)，只是增加了一組熱處理，即；將每個陽性噬菌體(上清)按IOOul/孔分別加入6個孔和I個空白對照孔中，3個孔和空白對照孔用常溫TBST洗板，另外3個孔用65°C的恒溫TBST洗板，以便篩選出65°C以下與Taq酶親和性穩(wěn)定的陽性噬菌體，并用高溫ELISA的OD45tl值與常溫ELISA的OD45tl值比值的百分?jǐn)?shù)來代表其熱穩(wěn)定性。結(jié)果2號噬菌體常溫親和性(OD450值)為0.91，65°C親和性(OD45tl值)為0.83。說明2號噬菌體與Taq酶有良好的結(jié)合活性，為0.91，而且在650C以下這種結(jié)合的穩(wěn)定性最高，為0.83 + 0.91 X 100%=91.2 %。
[0027]9)獲取親和配體多肽:對上述步驟8)篩到的2號噬菌體進行擴增至pfu=1013，取IOul噬菌體加IOul胰蛋白酶和碳酸氫銨等至終體積為IOOul，酶解液通過超濾得到含有親和配體肽的濾液，再將濾液稀釋至1000-10000倍
10)配制實時熱啟動Taq酶:將上述步驟9)的稀釋濾液與lOP/^g/^LTaq酶按等體積混合即成實時熱啟動Taq酶。
[0028]實施例二、制備實時熱啟動Taq酶二
I)噬菌體表面展示肽親和配體氨基酸序列推導(dǎo)；對實施例一淘選到的噬菌體，進行克隆擴增，以碘化鈉溶解抽提噬菌體單鏈DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定和PCR檢驗，再進行DNA測序。根據(jù)編碼鏈中噬菌體P III基因的閱讀框架推導(dǎo)出與P III蛋白融合的外源多肽的氨基酸序列為7肽序列2)人工合成親和配體多肽:將上述步驟I)的7肽序列委托相關(guān)公司進行人工合成；
3)配制實時熱啟動Taq酶；將上述步驟2)合成的親和配體7肽溶解稀釋并與Taq酶按摩爾比5 — 50:1混合，即為實時熱啟動Taq酶，
實驗結(jié)果:將實施例一步驟10)制備的實時熱啟動Taq酶用于早期的人類14+1 STR銀染檢測試劑盒，15個STR基因位點分布在5個PCR反應(yīng)管中全部得到擴增，而且擴增的DNA條帶清晰均一。將實施例二步驟3)制備的實時熱啟動Taq酶用于人類17+1 STR熒光檢測試劑盒，18個STR基因位點集中在一個PCR反應(yīng)管中全部得到了擴增，而且擴增的DNA條帶清晰，基本均一。
【權(quán)利要求】
1.一種實時熱啟動Taq酶及其制備方法，其特征在于它通過噬菌體表面展示肽技術(shù)，從噬菌體展示肽庫中淘選出一種與Taq酶有親和性，而且在65°C以下這種親和性都很穩(wěn)定的陽性噬菌體，通過擴增該噬菌體并用胰蛋白酶處理并經(jīng)過超濾而得到含有親和配體肽的濾液；進一步分析該噬菌體表面展示肽親和配體的序列組成，人工合成這一多肽配體，兩種配體可各自按一定比例與Taq酶混合。
2.一種實時熱啟動Taq酶及其制備方法，其特征在于它的操作步驟如下: (1)、用Taq酶蛋白包被酶標(biāo)板，通過噬菌體表面展示肽技術(shù)，生物淘選使與Taq酶具有親和性的噬菌體富集； (2)、利用ELISA法進行陽性噬菌體克隆的鑒定，再通過提高ELISA法中洗滌緩沖液的溫度，篩選出與Taq酶在65°C以下親和 性穩(wěn)定的陽性噬菌體，擴增該噬菌體并用胰蛋白酶處理之，再通過超濾得到含有親和配體肽的濾液； (3)、或分析篩選到的噬菌體表面展示肽親和配體的序列組成，人工合成這段配體的序列肽； (4)、將含有親和配體肽的濾液或人工合成的肽與Taq酶蛋白按比例混合，即得到實時熱啟動Taq酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實時熱啟動Taq酶及其制備方法，其特征在于它是通過噬菌體表面展示肽技術(shù)淘選到與Taq酶具有親和性的噬菌體表面展示肽親和配體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實時熱啟動Taq酶及其制備方法，其特征在于它是通過提高ELISA法中洗滌緩沖液的溫度，篩選出與Taq酶在65 °C以下親和性穩(wěn)定的陽性噬菌體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實時熱啟動Taq酶及其制備方法，其特征在于它是通過擴增該噬菌體并用胰蛋白水解該噬菌體，再通過超濾得到含有親和配體肽的濾液。
【文檔編號】C12N9/12GK103966184SQ201410186822
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】涂祖新, 熊勇華, 鄭國華, 陳媛, 張莉莉 申請人:江西省科學(xué)院微生物研究所