一種檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法：(1)采集氣溶膠樣本；(2)提取氣溶膠樣本中病毒的RNA和cDNA；(3)檢測(cè)：進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線：建立陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及擴(kuò)增體系的溶解曲線；(5)判斷氣溶膠樣本中是否含有牛病毒性腹瀉病毒。本發(fā)明還公開了特異性引物(如SEQIDNO.3～8所示)以及試劑盒(由特異性引物、牛病毒性腹瀉病毒陽性質(zhì)粒pEASY-T3-B1、SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑和ddH2O組成)。本發(fā)明的方法，既可用于牛病毒性腹瀉病毒氣溶膠樣本的分型檢測(cè)，也可用于臨床血液、奶樣、組織等樣本的檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]牛病毒性腹?寫(Bovineviraldiarrhea, BVD)是由牛病毒性腹?寫病毒(Bovineviral diarrheavirus, BVDV)引起的傳染病，呈地方性流行。本病可通過接觸及氣溶膠等方式傳播，病牛及隱性感染牛的呼吸道、眼分泌物、乳汁及糞便等排泄物均含有病毒，在封閉式牛群中可呈暴發(fā)式流行，給畜牧業(yè)生產(chǎn)和相關(guān)商業(yè)領(lǐng)域造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]BVDV是單股正鏈RNA病毒，有囊膜，基因組由5’端非翻譯區(qū)(5’NTR)，一個(gè)長(zhǎng)的開放閱讀框，編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，包括病毒的衣殼蛋白和囊膜蛋白(Erns、El和E2)和非結(jié)構(gòu)蛋白，和3’端非翻譯區(qū)(3’ NTR)組成。根據(jù)BVDV基因組5’端非翻譯區(qū)(5’ NTR)序列不同，把BVDV分為牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1)和牛病毒性腹瀉病毒II型(BVDV-2)。BVDV流行株的基因分型在流行病學(xué)研究、疫苗研制乃至疫病的控制和消滅等方面都具有重要的意義。
[0004]實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)巧妙地利用了 PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增、熒光技術(shù)高特異性和光譜技術(shù)的敏感性及實(shí)時(shí)定量分析的優(yōu)點(diǎn)，儀器自動(dòng)分析，效率高、無后續(xù)處理，克服了常規(guī)PCR定性檢測(cè)的一些不足，極大地提高了檢測(cè)的敏感性和特異性，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間、簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。
[0005] 氣溶膠是由懸浮于氣體介質(zhì)中的固態(tài)或液態(tài)微小粒子形成的相對(duì)穩(wěn)定的分散體系，其粒徑一般為0.001-100 μ m?？諝馍餁馊苣z研究主要集中在動(dòng)物舍環(huán)境氣載細(xì)菌、真菌及其毒素、內(nèi)毒素等的檢測(cè)，而病毒氣溶膠濃度低、難以收集，樣品處理以及病毒的鑒定等方面比其他微生物的研究方法及步驟更加復(fù)雜，影響因素多，對(duì)病毒氣溶膠的研究不夠深人。迄今為止，還沒有應(yīng)用SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)鑒別牛病毒性腹瀉病毒氣溶膠樣品的研究報(bào)道。本研究應(yīng)用熒光RT-PCR對(duì)收集到的奶牛場(chǎng)不同環(huán)境中空氣樣品中牛病毒性腹瀉病毒進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便、快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果可靠。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，一種檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，可同時(shí)對(duì)氣溶膠樣本中牛病毒性腹瀉病毒不同基因型進(jìn)行鑒別診斷。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，步驟如下:
[0009](I)采集氣溶膠樣本；
[0010]進(jìn)一步地，采集氣溶膠樣本的方法為:采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的全玻璃液體沖擊式采樣器(all-glass-1mpinger,簡(jiǎn)稱AGI),以IOmLpH值7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)為采樣介質(zhì)，按照12.5L/min的采樣流量采集20min，收集養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中的氣溶膠樣本；
[0011](2)提取氣溶膠樣本中病毒的RNA和cDNA ；[0012] 進(jìn)一步地，提取RNA和cDNA的方法為:將采集到的IOmL氣溶膠樣本在4°C下12000r/min離心30min，取上清液lmL，應(yīng)用病毒RNA試劑盒(商業(yè)化產(chǎn)品，現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑盒)提取病毒的總RNA ;將RNA提取物溶解于50 μ LRNAase-free水中，按照FermentasRevertAid?FirstStrandcDNASynthesisKit 說明書進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)，得到 cDNA ；
[0013](3)檢測(cè):以上述提取的cDNA為模板，采用試劑盒進(jìn)行SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR,具體如下:
[0014]所述試劑盒由特異性引物、牛病毒性腹瀉病毒陽性質(zhì)粒PEASY-T3-B1、SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑(現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)試劑)和ddH20組成；所述的SYBRGreen I 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 試劑盒為 SYBR* PremixExTaq?II (TliRNaseHPlus)試劑盒(購自大連寶生物)。采用SYBRGreen I熒光染料的方法，要比Taqman探針方法簡(jiǎn)便，價(jià)格相對(duì)較低。
[0015]所述牛病毒性腹瀉病毒陽性質(zhì)粒PEASY-T3-B1由序列為SEQIDN0.9所示的DNA片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質(zhì)粒，連接方法為所屬領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。
[0016]所述特異性引物選自①通用檢測(cè)引物對(duì)或/和②牛病毒性腹瀉病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)；
[0017]所述通用型檢測(cè)引物對(duì)的序列如下:
[0018]上游引物RT-F 為 5' -TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA-3'(如 SEQIDN0.3 所示);
[0019]下游引物RT-R 為 5’ -CCCTATCAGGCTGTATTCGT-3’ (如 SEQIDN0.4 所示)。
[0020]所述牛病毒性腹瀉病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)的序列如下:
[0021]牛病毒性腹瀉病毒I型鑒別檢測(cè)引物對(duì):
[0022]上游引物RT-1-F 為 5' -TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT-3'(如 SEQIDN0.5 所示);
[0023]下游引物RT-1-R 為為 5' -GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3'(如 SEQIDN0.6 所示)；
[0024]牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì):
[0025]上游引物RT-2-F 為 5' -AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA-3'(如 SEQIDN0.7 所示);
[0026]下游引物RT_2_R 為 5' -GTCTCTGCTACACCCTATCAG-3'(如 SEQIDN0.8 所示)。
[0027]擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μ L:2XSYBRPremixExTaqII10y L，模板2μ L，上游引物和下游引物各0.5μ L，RNaseFreeddH207 y L。所述的定量引物對(duì)中，上游引物和下游引物在反應(yīng)體系中的終濃度均為0.25 μ mol/L。
[0028]反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 °C 30s，然后按照95°C變性5s、65°C退火延伸30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；溶解曲線為95°C 5s,65°C 60s,95°C Continuous ;最后50°C 30s結(jié)束反應(yīng)。溫度轉(zhuǎn)換率為20°C /s，在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。
[0029](4)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線:建立陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及擴(kuò)增體系的溶解曲線；
[0030](5)判斷:當(dāng)所用特異性引物為通用檢測(cè)引物對(duì)時(shí)，若溶解曲線為S型曲線，則表明氣溶膠樣本中含有牛病毒性腹灣病毒；若溶解曲線為一條直線，貝1J表明氣溶膠樣本中不含有牛病毒性腹瀉病毒；
[0031]當(dāng)所用特異性引物為牛病毒性腹瀉病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)時(shí)，若對(duì)應(yīng)于牛病毒性腹瀉病毒I型鑒別檢測(cè)引物對(duì)的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有牛病毒性腹灣病毒I型；若溶解曲線為一條直線，貝1J表明氣溶膠樣本中不含有牛病毒性腹瀉病毒I型；
[0032]若對(duì)應(yīng)于牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有牛病毒性腹?寫病毒II型；若溶解曲線為一條直線，貝1J表明氣溶膠樣本中不含有牛病毒性腹瀉病毒II型。
[0033]本發(fā)明的檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，既可用于牛病毒性腹瀉病毒氣溶膠樣本的分型檢測(cè)，也可用于臨床血液、奶樣、組織等樣本的檢測(cè)，對(duì)牛病毒性腹瀉病毒的流行與傳播進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1:牛病毒性腹瀉病毒所有基因型SYBRGreen I實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖中各點(diǎn)對(duì)應(yīng)為5.2 X IO8-L OX 10°拷貝數(shù)/ μ L。
[0035]圖2:牛病毒性腹瀉病毒所有基因型SYBRGreen I實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)的溶解曲線，其中，空白對(duì)照以等量RNaseFreeddH2O代替模板，其他模板為標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒分別為
1.0XlO8-L OXlO1 拷貝數(shù)/μ L。
[0036]圖3:牛病毒性腹瀉病毒所有基因型SYBRGreen I實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)的特異性曲線，其中，1:牛病毒性腹瀉病毒；2:牛副流感3型病毒(BPIV-3) ;3:牛腸道病毒(BEV) ；4:牛冠狀病毒(BcoV) ；5:牛輪狀病毒(BRV) ；6:ddH20。
[0037]圖4:牛病毒 性腹瀉病毒所有基因型SYBRGreen I實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法的靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其中，1:5.2X108拷貝數(shù)/yL;2:5.2X IO7拷貝數(shù)/ μ L ;3:5.2Χ IO6拷貝數(shù)/μ L ;4:5.2X IO5 拷貝數(shù) / μ L ;5:5.2X IO4 拷貝數(shù) / μ L ;6:5.2X IO3 拷貝數(shù) / μ L ;7:
5.2Χ102拷貝數(shù)/yL;8:5.2X IO1拷貝數(shù)/μ L ;9:5.2Χ 10°拷貝數(shù)/μ L ;10:空白對(duì)照(以等量RNaseFree ddH20代替模板)。
[0038]圖5:牛病毒性腹瀉病毒所有基因型SYBRGreen I實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)的重復(fù)性曲線，其中，1:5.2X108拷貝數(shù)/yL;2:5.2X IO7拷貝數(shù)/ μ L ;3:5.2Χ IO6拷貝數(shù)/ μ L ;4:5.2X IO5拷貝數(shù)/ μ L ；5:5.2X IO4拷貝數(shù)/ μ L ;6:空白對(duì)照(以等量RNaseFreeddH2O 代替模板)。
[0039]圖6 =SYBRGreen I實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法分型檢測(cè)的溶解曲線，空白對(duì)照以等量RNaseFreeddH2O代替模板，其他模板為標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒分別為1.0X IO8-L OX IO1拷貝數(shù)/μ L0
[0040]圖7:氣溶膠樣本所有基因型檢測(cè)曲線，其中，1:5.2Χ IO6拷貝數(shù)/μ L標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒對(duì)照；2:氣溶膠樣本I ;3:氣溶膠樣本2 ；4:氣溶膠樣本3 ；5:氣溶膠樣本4 ；6:氣溶膠樣本5 ;7:氣溶膠樣本6 ；8:氣溶膠樣本7 ;9:氣溶膠樣本8 ；10:氣溶膠樣本9 ；11:氣溶膠樣本10 ; 12:空白對(duì)照(以等量RNaseFreeddH2O代替模板)。
[0041]圖8:氣溶膠樣本分型檢測(cè)，其中，陽性對(duì)照是5.2X IO6拷貝數(shù)/μ L質(zhì)粒為模板，空白對(duì)照以等量RNaseFreeddH2O代替模板，其他模板為氣溶膠樣本1_4。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。[0043]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0044]下述實(shí)施例中所用一些材料和試劑如下:
[0045]MS-1型多功能微生物采樣器(青島眾瑞智能儀器有限公司)；LightCycle/480 II熒光定量PCR儀(羅氏公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(目錄號(hào):DP209)和高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(目錄號(hào):DP107)購自天跟生化科技(北京)有限公司；ReVertAid?FirstStrandcDNASynthesisKit (目錄號(hào):K1622)購自 Fermentas 公司；pEASY_T3 載體試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；病毒基因組RNA提取試劑盒(CodeN0.:9766)、SYBRsPremixExTaq? II (TIiRNaseHPlus)試劑盒(CodeN0.:RR820A)、LATaq(CodeN0.:RR02MA)、TaKaRa Taq(CodeN0.:R00ΙΑ)、DNAMarker，IPTG, X-gal 均購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0046]實(shí)施例1引物的設(shè)計(jì)與合成
[0047]根據(jù)GeneBank中牛病毒性腹?寫病毒5’ -UTR基因(GenBank:AF091605.1，)保守序列，應(yīng)用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物B_F、B-R(表1,序列I和序列2,如SEQIDN0.1、2所示)，用于陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建；采用PrimerExpress3.0軟件，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物RT-F、RT-R(表1，序列3和序列4，如SEQIDN0.3、4所示)，用于通用型牛病毒性腹?寫病毒檢測(cè)。分別根據(jù)GeneBank中不同型牛病毒性腹灣病毒序列,采用PrimerExpress3.0軟件，分別設(shè)計(jì)I型牛病毒性腹瀉病毒和II型牛病毒性腹瀉病毒特異性鑒別檢測(cè)引物(表1，序列 5-8，如 SEQIDN0.5、6、7、8 所示)。
[0048]表1引物寡核苷酸序列
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，其特征在于:步驟如下: (1)采集氣溶膠樣本； (2)提取氣溶膠樣本中病毒的RNA和cDNA； (3)檢測(cè):以上述提取的cDNA為模板，采用試劑盒進(jìn)行SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR,具體如下: 所述試劑盒由特 異性引物、牛病毒性腹瀉病毒陽性質(zhì)粒PEASY-T3-B1、SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑和ddH20組成； 所述牛病毒性腹瀉病毒陽性質(zhì)粒PEASY-T3-B1由序列為SEQIDN0.9所示的DNA片段與PEASY-T3載體相連接后得到的重組質(zhì)粒； 所述特異性引物選自①通用檢測(cè)引物對(duì)或/和②牛病毒性腹瀉病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)； 所述通用型檢測(cè)引物對(duì)的序列如下: 上游引物 RT-F 為 5' -TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA-3'；
下游引物 RT-R 為 5’ -CCCTATCAGGCTGTATTCGT-3’ ； 所述牛病毒性腹瀉病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)的序列如下: 牛病毒性腹瀉病毒I型鑒別檢測(cè)引物對(duì): 上游引物 RT-1-F 為 5' -TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT-3'； 下游引物 RT-1-R 為為 5' -GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3'； 牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì): 上游引物 RT-2-F 為 5' -AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA-3'； 下游引物 RT-2-R 為 5' -GTCTCTGCTACACCCTATCAG-3'； (4)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線:建立陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及擴(kuò)增體系的溶解曲線； (5)判斷:當(dāng)所用特異性引物為通用檢測(cè)引物對(duì)時(shí)，若溶解曲線為S型曲線，則表明氣溶膠樣本中含有牛病毒性腹?寫病毒；若溶解曲線為一條直線，貝1J表明氣溶膠樣本中不含有牛病毒性腹瀉病毒； 當(dāng)所用特異性引物為牛病毒性腹瀉病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)時(shí)，若對(duì)應(yīng)于牛病毒性腹瀉病毒I型鑒別檢測(cè)引物對(duì)的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有牛病毒性腹灣病毒I型；若溶解曲線為一條直線，貝1J表明氣溶膠樣本中不含有牛病毒性腹瀉病毒I型； 若對(duì)應(yīng)于牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有牛病毒性腹瀉病毒II型；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有牛病毒性腹瀉病毒II型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，其特征在于:所述步驟(1)中，采集氣溶膠樣本的方法為:采用全玻璃液體沖擊式采樣器，以IOmLpH值7.0的磷酸鹽緩沖液為采樣介質(zhì)，按照12.5L/min的采樣流量采集20min，收集氣溶膠樣本。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，提取RNA和cDNA的方法為:將采集到的IOmL氣溶膠樣本在4°C下12000r/min離心30min，取上清液lmL，應(yīng)用病毒RNA試劑盒提取病毒的總RNA ;將RNA提取物溶解于.50 μ LRNAase-free 水中，按照 FermentasRevertAid?FirstStrandcDNASynthesisKit 說明書進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到cDNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，PCR的擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μ L:2XSYBRPremixExTaqI110 μ L，模板2 μ L，上游弓丨物和下游引物各0.5μ L，RNaseFreeddH207 y L。所述的定量引物對(duì)中，上游引物和下游引物在反應(yīng)體系中的終濃度均為0.25 μ mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)氣溶膠中牛病毒性腹瀉病毒的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，PCR的反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C30s，然后按照95°C變性5s、65°C退火延伸30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；溶解曲線為95°C 5s,65°C 60s,95°C Continuous ;最后50°C 30s結(jié)束反應(yīng)。溫度轉(zhuǎn)換率為20°C /s，在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。
6.用于檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的特異性引物，其特征在于:所述特異性引物選自①通用檢測(cè)引物對(duì)或/和②牛病毒性腹瀉病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)； 所述通用型檢測(cè)引物對(duì)的序列如下: 上游引物 RT-F 為 5' -TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA-3'；
下游引物 RT-R 為 5’ -CCCTATCAGGCTGTATTCGT-3’ ； 所述牛病毒性腹瀉病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)的序列如下: 牛病毒性腹瀉病毒I型鑒別檢測(cè)引物對(duì): 上游引物 RT-1-F 為 5' -TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT-3'； 下游引物 RT-1-R 為為 5' -GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3'； 牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì): 上游引物 RT-2-F 為 5' -AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA-3'； 下游引物 RT-2-R 為 5' -GTCTCTGCTACACCCTATCAG-3'。
7.權(quán)利要求6所述的特異性引物在制備檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求6所述的特異性引物在檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒中的應(yīng)用。
9.一種用于檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒由由特異性引物、牛病毒性腹瀉病毒陽性質(zhì)粒pEASY-T3-Bl、SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑和ddH20組成； 所述牛病毒性腹瀉病毒陽性質(zhì)粒PEASY-T3-B1由序列為SEQIDN0.9所示的DNA片段與PEASY-T3載體相連接后得到的重組質(zhì)粒； 所述特異性引物選自①通用檢測(cè)引物對(duì)或/和②牛病毒性腹瀉病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)； 所述通用型檢測(cè)引物對(duì)的序列如下: 上游引物 RT-F 為 5' -TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA-3'；
下游引物 RT-R 為 5’ -CCCTATCAGGCTGTATTCGT-3’ ； 所述牛病毒性腹瀉病毒I型、牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì)的序列如下: 牛病毒性腹瀉病毒I型鑒別檢測(cè)引物對(duì): 上游引物 RT-1-F 為 5' -TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT-3'； 下游引物 RT-1-R 為為 5' -GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3'； 牛病毒性腹瀉病毒II型鑒別檢測(cè)引物對(duì):上游引物 RT-2-F 為 5' -AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA-3'；下游引物 RT-2-R 為 5' -GTCTCTGCTACACCCTATCAG-3'。
10.權(quán)利要求 9所述的試劑盒在檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103981285SQ201410188351
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】何洪彬, 侯佩莉 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心