一種植物dna的快速提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種植物DNA的提取方法。該植物DNA提取方法(冰浴法)，包括下述步驟1)和2)：1)破碎植物器官和/或組織，得到植物粉末；2)向所述植物粉末中加入細(xì)胞裂解液和溶液S在冰浴中反應(yīng)15-40分鐘，得到含有DNA的提取液，將該提取液稱為提取液1，除去所述提取液1的雜質(zhì)，得到DNA。該方法與現(xiàn)有的植物DNA提取方法(水浴提取法)相比，不但縮短時(shí)間還簡(jiǎn)化了提取工藝。本發(fā)明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)在需大量提取DNA或做棉花品種的純度檢測(cè)時(shí)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。
【專利說明】一種植物DNA的快速提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中一種植物DNA的快速提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]通常棉花的DNA提取方法為水浴提取法，步驟基本是這樣:粉碎樣品；加恒溫65°C裂解液在65°C下水浴30-40分鐘，充分裂解細(xì)胞膜和核膜，使DNA從細(xì)胞中釋放出來；然后加苯酚或氯仿去蛋白、酚類物質(zhì)和多糖等，離心；取上清，用異丙醇沉淀DNA。
[0003]子葉DNA提取的主要步驟如下:1)取發(fā)芽I周的子葉一片裝于2ml的離心管中，同時(shí)裝入一粒鋼珠，保存于_70°C低溫冰箱中備用。提取時(shí)用研磨儀進(jìn)行冷凍研磨，一般磨2次，每次20秒。2)研磨后取出鋼珠，加入提取液700μ 1，搖勻，放入65°C水浴40分鐘，中間每10分鐘緩慢顛倒離心管(提取液的組成:0.1M Tris-HCU0.025M EDTA鈉鹽、2% CTAB,2% ρνρ>1.5M NaCl >2% β-巰基乙醇)。3)加入等體積的氯仿:異戍醇(24:1),緩慢顛倒8-10分鐘，4°C條件下12000rpm離心10分鐘。4)取上清液，加入0.6倍的冰冷異丙醇，緩慢顛倒離心管，直至有絮狀沉淀集結(jié)，靜止2分鐘，用移液器槍頭把絮狀物挑到離心管中。5)用70%的酒精洗2次，100%酒精洗I次，倒干酒精，在真空干燥機(jī)中干燥DNA。用500 μ I滅菌超純水溶解DNA，保存于_20°C冰箱中備用(付小瓊等.棉花總DNA快速提取技術(shù)及其在國(guó)家棉花區(qū)試中的應(yīng)用.中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2011年年會(huì)論文匯編.中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2011年年會(huì).中國(guó)棉花學(xué)會(huì).2011-08-07)。
[0004]種子DNA提取的主要步驟如下:1)用電動(dòng)種子粉碎機(jī)將去殼棉仁充分粉碎后轉(zhuǎn)入2ml的離心管中。2)加入提取液700 μ 1，搖勻，放入65°C水浴40分鐘，中間每10分鐘緩慢顛倒離心管(提取液的組成:0.1M Tris-HCU0.025M EDTA鈉鹽、2% CTAB,2% ρνρ、1.5ΜNaCl, 2% β-巰基乙醇、0.lg/L蛋白酶K)。3)水浴結(jié)束后，加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，混勻至不分層，4°C條件下12000rpm離心10分鐘。4)取上清加入等體積的氯仿:異戍醇(24:1),混勻至不分層，4°C條件下12000rpm離心通過10分鐘。5)取上清液,加入0.6倍的冰冷異丙醇，緩慢顛倒離心管，直至有絮狀沉淀集結(jié)，靜止2分鐘，用移液器槍頭把絮狀物挑到離心管中。6)用70%的酒精洗I次，100%酒精洗一次，倒干酒精，在真空干燥機(jī)中干燥DNA。用500 μ I滅菌超純水溶解DNA，保存于_20°C冰箱中備用(付小瓊等.棉花總DNA快速提取技術(shù)及其在國(guó)家棉花區(qū)試中的應(yīng)用.中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2011年年會(huì)論文匯編.中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2011年年會(huì).中國(guó)棉花學(xué)會(huì).2011-08-07)。
[0005]目前，在棉花DNA的提取過程中，耗時(shí)長(zhǎng)，且需要65或60°C的水浴，經(jīng)常影響到大量棉花品種純度檢測(cè)時(shí)的速度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種植物DNA的快速提取方法，該方法與現(xiàn)有的植物DNA提取方法(水浴提取法)相比，不但縮短時(shí)間還簡(jiǎn)化了提取工藝。 [0007]本發(fā)明所提供的植物DNA的快速提取方法，簡(jiǎn)稱冰浴法，包括下述步驟I)和2):[0008]I)破碎植物器官和/或組織，得到植物粉末；
[0009]2)向所述植物粉末中加入細(xì)胞裂解液和溶液S，在冰浴中反應(yīng)15-40分鐘，得到含有DNA的提取液，將該提取液稱為提取液1，除去所述提取液I的雜質(zhì)，得到DNA ；
[0010]上述植物DNA的快速提取方法中，所述細(xì)胞裂解液由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為0.1M Tris-HCU0.02M EDTA鈉鹽、2% (質(zhì)量百分含量)十六烷基三甲基溴化銨、2% (質(zhì)量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和1% (體積百分含量)β -巰基乙醇；[0011 ] 上述DNA的快速提取方法中，所述溶液S為溶液A或溶液B ；
[0012]上述DNA的快速提取方法中，所述溶液A由苯酚、氯仿和異戊醇組成，所述溶液A中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1 ；
[0013]上述DNA的快速提取方法中，所述溶液B由氯仿和異戊醇組成，所述溶液B中氯仿和異戊醇的體積比為24:1。
[0014]上述DNA的快速提取方法中，所述植物器官為種子，所述除去所述提取液I的雜質(zhì)包括以下步驟:將所述提取液I進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入上清液中，收集上清液，將該上清液稱為上清液Al，向所述上清液Al中加入所述溶液B反應(yīng)3-5分鐘，得到含有DNA的提取液，將該提取液稱為提取液Α2，除去所述提取液2的雜質(zhì)，得到DNA。
[0015]上述DNA的快速提取方法中，所述植物器官為種子，所述除去所述提取液Α2的雜質(zhì)包括以下步驟:將所述提取液Α2進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入上清液中，收集上清液，將該上清液稱為上清液Α2，向所述上清液Α2中加入所述異丙醇反應(yīng)10秒，得到DNA絮狀沉淀，用移液器槍頭把絮狀沉淀挑到離 心管中。將該沉淀稱為沉淀Al，用乙醇水溶液或乙醇洗滌所述沉淀Al得到DNA。其中用乙醇水溶液或乙醇洗滌所述沉淀Al的方法具體可為用70%的酒精水溶液洗所述沉淀Α12次，100%酒精洗I次，倒干酒精，在真空干燥機(jī)中干燥DNA。用500 μ I滅菌超純水溶解DNA，保存于-20°c冰箱中備用。
[0016]上述異丙醇的體積可為0.6-1.0倍的所述上清液A2的體積。
[0017]上述DNA的快速提取方法中，所述植物器官為葉(如真葉或子葉)，所述除去所述提取液I的雜質(zhì)包括以下步驟:將所述提取液I進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入上清液中，收集上清液，將該上清液稱為上清液BI，向所述上清液BI中加入所述異丙醇反應(yīng)10秒，得到DNA絮狀沉淀，用移液器槍頭把絮狀沉淀挑到離心管中。將該沉淀稱為沉淀BI，用乙醇水溶液或乙醇洗滌所述沉淀BI得到DNA。其中用乙醇水溶液或乙醇洗滌所述沉淀BI的方法具體可為用70%的酒精水溶液洗所述沉淀B12次，100%酒精洗一次，倒干酒精，在真空干燥機(jī)中干燥DNA。用500 μ I滅菌超純水溶解DNA，保存于_20°C冰箱中備用。
[0018]上述異丙醇的體積可為0.6-1.0倍所述上清液BI的體積。
[0019]上述DNA的快速提取方法中，所述離心的溫度為4°C，時(shí)間為10分鐘。
[0020]上述DNA的快速提取方法中，所述15-40分鐘可為15_30分鐘或15_20分鐘或15分鐘。
[0021]上述DNA的快速提取方法中，所述植物可為雙子葉植物或單子葉植物，如棉花。
[0022]上述DNA的快速提取方法在分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述分子標(biāo)記輔助育種為通過在分子水平上分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的基因型來判別目標(biāo)基因是否存在和對(duì)其進(jìn)行間接選擇的一種育種方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述分子標(biāo)記具體可為SSR(簡(jiǎn)單序列重復(fù))。[0023]上述DNA的快速提取方法在品種純度檢測(cè)或品種的真實(shí)性鑒定中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024]本發(fā)明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)中,通過向所述植物粉末中加入細(xì)胞裂解液和溶液S在冰浴中反應(yīng)15分鐘即可，將現(xiàn)有的植物DNA提取方法(水浴提取法)中的裂解膜和去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)兩步改為一步，且不用水浴鍋，水浴加熱需要等待30分鐘，直接用常溫裂解液，將現(xiàn)有的裂解膜和去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)所需要的30-40分鐘縮短了 I倍以上，大大地節(jié)約了時(shí)間，提高效率，且本發(fā)明的植物DNA的快速提取方法中采用的裂解液既適用于種子也適用于葉，而現(xiàn)有的植物DNA提取方法中種子和葉需要分別采用不同的裂解液。本發(fā)明的植物DNA的快速提取方法提取的種子DNA的0D260/0D280為1.96，提取的葉DNA的0D260/0D280為1.84，現(xiàn)有的水浴提取法提取的種子DNA的0D260/0D280為2.04，提取的葉DNA的0D260/0D280為1.96，可見本發(fā)明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)提取的種子DNA純度好于現(xiàn)有的植物DNA提取方法(水浴提取法)，本發(fā)明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)提取的葉DNA純度與現(xiàn)有的水浴提取法提取的葉DNA相當(dāng)。本發(fā)明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)在需大量提取DNA或做棉花品種的純度檢測(cè)時(shí)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為引物NAU1255鑒定冰浴法提取中植棉2號(hào)種子DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0026]圖2為引物NAU1102鑒定冰浴法提取中植棉2號(hào)種子DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0027]圖3為引物NAU1233鑒定冰浴法提取欣試71143種子DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0028]圖4為引物NAUl 102鑒定冰浴法提取欣試71143種子DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0029]圖5為引物NAU1255鑒定水浴法提取中植棉2號(hào)種子DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0030]圖6為引物NAU1102鑒定水浴法提取中植棉2號(hào)種子DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0031]圖7為引物NAU1369鑒定水浴法提取中棉所63種子DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0032]圖8為引物CS62鑒定水浴法提取中棉所63種子DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0033]圖9為引物NAU1255鑒定冰浴法提取中植棉2號(hào)子葉DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0034]圖10為引物NAU1102鑒定冰浴法提取中植棉2號(hào)子葉DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0035]圖11為引物NAU1102鑒定冰浴法提取銀興棉4號(hào)真葉DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。[0036]圖12為引物NAU1255鑒定冰浴法提取銀興棉4號(hào)真葉DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0037]圖13為引物NAU1255鑒定水浴法提取中植棉2號(hào)真葉DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0038]圖14為引物NAU1102鑒定水浴法提取中植棉2號(hào)真葉DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0039]圖15為引物NAU1102鑒定水浴法提取中棉所63子葉DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0040]圖16為引物NAU1186鑒定水浴法提取中棉所63子葉DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0041]圖17為引物NAU1255鑒定冰浴法用酚、氯仿和異戊醇抽提一次提取中植棉2號(hào)種子DNA質(zhì)量聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0042]圖18為引物NAU2026鑒定冰浴法用氯仿和異戊醇抽提一次提取中棉所63種子DNA質(zhì)量聚丙烯 酰胺凝膠電泳圖。每個(gè)泳道為一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0044]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0045]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046]下述實(shí)施例中所用的棉花如下:中植棉2號(hào)(中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所，2006年通過國(guó)家審定的常規(guī)棉品種，多年作為黃河流域的對(duì)照品種)；中棉所63(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，2007年通過國(guó)家審定的雜交棉品種)；銀興棉4號(hào)(山東銀興種業(yè)有限公司，2010年通過山東省審定的常規(guī)棉品種)；欣試71143(國(guó)欣農(nóng)村技術(shù)服務(wù)總會(huì)，2014年通過河北省審定的常規(guī)棉品種)。
[0047]下述實(shí)施例中所用的引物NAUl 102、引物NAU1255、弓丨物NAU1233、弓丨物NAU1369、引物CS62、引物NAU1186、引物NAU2026均由正引物和反引物組成，其序列如下:
[0048]NAUl 102 的正引物(序列表中序列 I):ATCTCTCTGTCTCCCCCTTC ；NAU1102 的反引物(序列表中序列 2):GCATATCTGGCGGGTATAAT ；
[0049]NAU1255 的正引物(序列表中序列 3):CATGCAAATCCATGCTAGAG ；NAU1255 的反引物(序列表中序列 4):GGTTTCTTTGGTGGTGAAAC ；
[0050]NAU1233 的正引物(序列表中序列 5):TTCGGGAAAGTTAGAGGAGA ；NAU1233 的反引物(序列表中序列 6):TCCTCAGAGCTCGGAATAGT ；
[0051]NAU1369 的正引物(序列表中序列 7):TGGCAGAGATGAATGTAAGC ；NAU1369 的反引物(序列表中序列 8):GGTAACGGATGGAAAATCAC ；
[0052]CS62的正引物(序列表中序列9):GATGGCTACCTCCCTTTGTA ；CS62的反引物(序列表中序列 10):CGTAAGGAAGCCTAGCAAAA ；
[0053]NAUl 186 的正引物(序列表中序列 11):AATGGTCCTGCTCCAGATT ；NAU1186 的反引物(序列表中序列 12):AATCGTCGTCGTCGAATTAT ；[0054]NAU2026 的正引物(序列表中序列 13):GAATCTCGAAAACCCCATCT ；NAU2026 的反引物(序列表中序列 14):ATTTGGAAGCGAAGTACCAG?
[0055]實(shí)施例1、棉花DNA的提取
[0056]1、冰浴法提取中植棉2號(hào)種子DNA
[0057]實(shí)驗(yàn)設(shè)重復(fù)，每次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0058]1.1剝?nèi)ジ稍锏闹兄裁?號(hào)種子的種皮得到棉仁，I粒棉仁裝于I個(gè)2ml的離心管中，再裝I粒5mm的鋼珠,用麗301混合型研磨儀研磨,得到中植棉2號(hào)種子粉末。
[0059]1.2向離心管中加入850 μ I細(xì)胞裂解液用力搖勻，再加入850 μ I溶液A搖勻，冰浴15分鐘，中間上下顛倒離心管3次，得到含有DNA的提取液，將該提取液稱為提取液1，除去提取液I的雜質(zhì)，得到中植棉2號(hào)種子DNA。其中，按照下述方法除去提取液I的雜質(zhì):4°C條件下12000rpm離心10分鐘，收集上清液，將該上清液稱為上清液Al，再向上清液Al中加入是上清液Al等體積的溶液B，緩慢顛倒30-50下(共需3-5分鐘)，4°C條件下12000rpm離心10分鐘，收集上清液，將該上清液稱為上清液A2 ;再向上清液A2中加入是上清液A20.6倍體積的冰冷異丙醇，緩慢顛倒離心管，直至有絮狀沉淀集結(jié)(共需10秒)，靜置2分鐘，用槍頭把絮狀物沉淀挑至離心管中，將該沉淀稱為沉淀Al ;用70% (體積百分含量)的乙醇洗所述沉淀A12次，再用100%乙醇洗I次，倒干乙醇，在真空干燥機(jī)中干燥DNA，得到中植棉2號(hào)種子DNA。用500 μ I滅菌超純水溶解DNA，保存于_20°C冰箱中備用。
[0060]其中，細(xì)胞裂解液由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為0.1M Tris-HCU0.02MEDTA鈉鹽、2% (質(zhì)量 百分含量)十六烷基三甲基溴化銨、2% (質(zhì)量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和I % (體積百分含量)β -巰基乙醇，所述細(xì)胞裂解液的pH為8.0。
[0061]溶液A由苯酚、氯仿和異戊醇組成，溶液A中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1。
[0062]上述除去提取液I的雜質(zhì)中，溶液B由氯仿和異戊醇組成，溶液B中氯仿和異戊醇的體積比為24 =10
[0063]2、冰浴法提取欣試71143種子DNA
[0064]除將步驟I中的中植棉2號(hào)種子替換為欣試71143種子外，其它方法與步驟I完全相同。
[0065]3、水浴法提取中植棉2號(hào)種子DNA
[0066]參考下述文獻(xiàn)中描述的水浴法提取中植棉2號(hào)種子DNA:付小瓊等.棉花總DNA快速提取技術(shù)及其在國(guó)家棉花區(qū)試中的應(yīng)用.中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2011年年會(huì)論文匯編.中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2011年年會(huì).中國(guó)棉花學(xué)會(huì).2011-08-07。實(shí)驗(yàn)設(shè)重復(fù)，每次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0067]3.1中植棉2號(hào)種子去殼，得到棉仁，用電動(dòng)種子粉碎機(jī)將棉仁充分粉碎后轉(zhuǎn)入2ml的離心管中。
[0068]3.2向離心管中加入提取液700 μ I，搖勻，放入65°C水浴40分鐘，中間每10分鐘緩慢顛倒離心管，得到含有DNA的提取液。
[0069]3.3向含有DNA的提取液中加入等體積溶液A，混勻，4°C條件下12000rpm離心10分鐘。
[0070]3.4取上清液，加入等體積的溶液B，混勻，4°C條件下12000rpm離心10分鐘。[0071]3.5取上清液，加入是上清液0.6倍的冰冷異丙醇，緩慢顛倒離心管，直至有絮狀沉淀集結(jié)，靜置2分鐘，用移液器槍頭把絮狀沉淀挑到離心管中。
[0072]3.6用70%的乙醇洗2次，100%乙醇洗I次，倒干乙醇，在真空干燥機(jī)中干燥DNA。用500 μ I滅菌超純水溶解DNA，保存于-20°c冰箱中備用。
[0073]其中，提取液由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為0.1M Tris-HCU0.025M EDTA鈉鹽、2% CTAB、2% ρνρ、1.5M NaClU% β_ 巰基乙醇。
[0074]溶液A由苯酚、氯仿和異戊醇組成，溶液A中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1。
[0075]溶液B由氯仿和異戊醇組成，溶液B中氯仿和異戊醇的體積比為24:1。
[0076]4、水浴法提取中棉所63種子DNA 的中植棉2號(hào)種子替換為中棉所63種子外，其它方法與步驟3完全相同。
[0078]5、冰浴法提取中植棉2號(hào)葉DNA
[0079]實(shí)驗(yàn)設(shè)重復(fù)，每次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0080]5.1從田間或室內(nèi)取棉花幼葉I片，直接裝于2ml的離心管中，再裝I粒5mm的鋼珠，保存于_70°C低溫冰箱中備用。提取時(shí)用麗301混合型研磨儀進(jìn)行冷凍研磨，得到中植棉2號(hào)葉粉末。
[0081]5.2向中植棉2號(hào)葉粉末中迅速加入細(xì)胞裂解液800 μ 1，搖勻，加入800 μ I溶液B搖勻，冰浴15分鐘，中間上下顛倒離心管3次，得到含有DNA的提取液，將該提取液稱為提取液1，除去提取液I的雜質(zhì)，得到中植棉2號(hào)葉DNA。其中，按照下述方法除去提取液I的雜質(zhì):4°C條件下12000rpm離心10分鐘，收集上清液，將該上清液稱為上清液BI，向上清液BI中加入是上清液B10.6倍體積的冰冷異丙醇，緩慢顛倒離心管，直至有絮狀沉淀集結(jié)(共需10秒)，靜置2分鐘，用槍頭把絮狀沉淀挑至離心管中，將該沉淀稱為沉淀BI ;用70%(體積百分含量)的乙醇洗所述沉淀B12次，再用100%乙醇洗I次，倒干乙醇，在真空干燥機(jī)中干燥DNA，得到中植棉2號(hào)葉DNA。用500 μ I滅菌超純水溶解DNA，保存于_20°C冰箱中備用。
[0082]其中，細(xì)胞裂解液由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為0.1M Tris-HCl,
0.02MEDTA鈉鹽、2% (質(zhì)量百分含量)十六烷基三甲基溴化銨、2% (質(zhì)量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和I % (體積百分含量)β -巰基乙醇，所述細(xì)胞裂解液的pH為8.0。
[0083]溶液B由氯仿和異戊醇組成，溶液B中氯仿和異戊醇的體積比為24:1。
[0084]6、冰浴法提取銀興棉4號(hào)葉DNA
[0085]除將步驟5中的中植棉2號(hào)葉替換為銀興棉4號(hào)葉外，其它方法與步驟5完全相同。
[0086]7、水浴法提取中植棉2號(hào)葉DNA
[0087]參考下述文獻(xiàn)中描述的水浴法提取中植棉2號(hào)葉DNA:付小瓊等.棉花總DNA快速提取技術(shù)及其在國(guó)家棉花區(qū)試中的應(yīng)用.中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2011年年會(huì)論文匯編.中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2011年年會(huì).中國(guó)棉花學(xué)會(huì).2011-08-07。實(shí)驗(yàn)設(shè)重復(fù)，每次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0088]7.1取中植棉2號(hào)葉裝于2ml的離心管中，同時(shí)裝入一粒鋼珠，保存于_70°C低溫冰箱中備用。提取時(shí)用研磨儀進(jìn)行冷凍研磨，一般磨2次，每次20秒。[0089]7.2研磨后取出鋼珠，向中植棉2號(hào)葉粉末中加入提取液700 μ I，搖勻，放入65°C水浴40分鐘，中間每10分鐘緩慢顛倒離心管，得到含有DNA的提取液。
[0090]7.3向含有DNA的提取液中加入等體積的溶液B，緩慢顛倒8_10分鐘，4°C條件下12000rpm離心10分鐘。
[0091]7.4取上清液，加入0.6倍的冰冷異丙醇，緩慢顛倒離心管，直至有絮狀沉淀集結(jié)，靜置2分鐘，用移液器槍頭把絮狀沉淀挑到離心管中。
[0092]7.5用70%的乙醇洗2次，100%乙醇洗I次，倒干乙醇，在真空干燥機(jī)中干燥DNA。用500 μ I滅菌超純水溶解DNA，保存于-20°c冰箱中備用。
[0093]其中，提取液由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為0.1M Tris-HCU0.025M EDTA鈉鹽、2% CTAB、2% ρνρ、1.5M NaClU% β_ 巰基乙醇。
[0094]溶液B由氯仿和異戊醇組成，溶液B中氯仿和異戊醇的體積比為24:1。
[0095]8、水浴法提取中棉所63葉DNA
[0096]除將步驟7中的中植棉2號(hào)葉替換為中棉所63葉外，其它方法與步驟7完全相同。
[0097]檢測(cè)上述步驟I至8得到的DNA溶液的純度，結(jié)果如表1所示，冰浴法提取的種子與葉的DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，0D260/0D280的比值均在1.84-1.96之間，均符合SSR(簡(jiǎn)單序列重復(fù))分析模板的要求，表明本發(fā)明的DNA的快速提取方法提取棉花種子與葉的DNA是可行的。其中，中植棉2號(hào)種子冰浴法得到的DNA溶于500 μ I滅菌超純水得到的溶液0D260/0D280為1.9 7 ;中植棉2號(hào)種子水浴法得到的DNA溶于500 μ I滅菌超純水得到的溶液0D260/0D280為2.04。說明本發(fā)明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)提取的種子DNA純度好于現(xiàn)有的植物DNA提取方法(水浴提取法)，葉片提取時(shí)兩種方法所得的DNA純度均好。本發(fā)明的植物DNA的快速提取方法(冰浴法)中，通過向植物粉末中加入細(xì)胞裂解液和溶液S在冰浴中反應(yīng)15分鐘即可，將現(xiàn)有的植物DNA提取方法(水浴提取法)中的裂解膜和去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)兩步改為一步，且不用水浴鍋，直接用常溫裂解液，將現(xiàn)有的裂解膜和去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)所需要的30-40分鐘縮短了 I倍以上，大大地節(jié)約了時(shí)間，提高效率。
[0098]表1、步驟I至8得到的DNA溶液的0D260/0D280
[0099]
【權(quán)利要求】
1.植物DNA提取方法，包括下述步驟I)和2): 1)破碎植物器官和/或組織，得到植物粉末； 2)向所述植物粉末中加入細(xì)胞裂解液和溶液S在冰浴中反應(yīng)15-40分鐘，得到含有DNA的提取液，將該提取液稱為提取液1，除去所述提取液I的雜質(zhì)，得到DNA ； 所述細(xì)胞裂解液由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為0.1M Tris-HCU0.02M EDTA鈉鹽、2% (質(zhì)量百分含量)十六烷基三甲基溴化銨、2% (質(zhì)量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和I % (體積百分含量)β -巰基乙醇； 所述溶液S為溶液A或溶液B ； 所述溶液A由苯酚、氯仿和異戊醇組成，所述溶液A中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1 ； 所述溶液B由氯仿和異戊醇組成，所述溶液B中氯仿和異戊醇的體積比為24:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA提取方法，其特征在于:所述植物器官為種子，所述溶液S為溶液Α，所述除去所述提取液I的雜質(zhì)包括以下步驟:將所述提取液I進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入上清液中，收集上清液，將該上清液稱為上清液Al，向所述上清液Al中加入所述溶液B反應(yīng)3-5分鐘，得到含有DNA的提取液，將該提取液稱為提取液Α2，除去所述提取液Α2的雜質(zhì)，得到DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA提取方法，其特征在于:所述植物器官為種子，所述除去所述提取液Α2的雜質(zhì)包括以下步驟:將所述提取液Α2進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入上清液中，收集上清液，將該上清液稱為上清液Α2，向所述上清液Α2中加入所述異丙醇反應(yīng)10秒，得到含有DNA的沉淀，將該沉淀稱為沉淀Al，除去所述沉淀Al的雜質(zhì)，得到DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的DNA提取方法，其特征在于:所述植物器官為種子，所述除去所述沉淀Al的雜質(zhì)包括以下步驟:用乙醇水溶液或乙醇洗滌所述沉淀Al得到DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA提取方法，其特征在于:所述植物器官為葉，所述溶液S為溶液B，所述除去所述提取液I的雜質(zhì)包括以下步驟:將所述提取液I進(jìn)行離心，使DNA進(jìn)入上清液中，收集上清液，將該上清液稱為上清液BI，向所述上清液BI中加入所述異丙醇反應(yīng)10秒，得到含有DNA的沉淀，將該沉淀稱為沉淀BI，除去所述沉淀BI的雜質(zhì)，得到DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的DNA提取方法，其特征在于:所述植物器官為葉，所述除去所述沉淀BI的雜質(zhì)包括以下步驟:用乙醇水溶液或乙醇洗滌所述沉淀BI得到DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的DNA提取方法，其特征在于:所述離心的溫度為4°C，時(shí)間為10分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的DNA提取方法，其特征在于:所述15-40分鐘為15-30分鐘或15-20分鐘或15分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的DNA提取方法，其特征在于:所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.權(quán)利要求1-9中任一所述DNA提取方法在分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用，或權(quán)利要求1-9中任一所述DNA提取方法在品種純度檢測(cè)或品種的真實(shí)性鑒定中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103966198SQ201410188782
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】付小瓊, 葉武威, 楊付新, 王秀玲 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所