抑制ER81基因表達(dá)的siRNA及其在乳腺癌細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種特異性抑制人ER81基因表達(dá)的siRNA及其制備和篩選方法。本發(fā)明以ER81基因?yàn)榘悬c(diǎn)序列，針對(duì)該基因的7個(gè)轉(zhuǎn)錄突變體編碼區(qū)的同源序列，分別在上、中、下游各選擇一個(gè)干擾靶點(diǎn)，構(gòu)建出三個(gè)重組siRNA表達(dá)載體。將siRNA重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中，利用DNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，最終篩選出一個(gè)能夠明顯抑制ER81基因表達(dá)的siRNA片段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所篩選出的siRNA可以特異、高效的抑制ER81基因的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本發(fā)明所篩選出的siRNA為制備靶向治療乳腺癌相關(guān)藥物提供了一個(gè)新的途徑，展示出了良好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】抑制ER81基因表達(dá)的siRNA及其在乳腺癌細(xì)胞中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及靶向人ER81基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其在抑制乳腺癌細(xì)胞中ER81基因表達(dá)水平中的應(yīng)用。尤其涉及利用siRNA通過(guò)RNA干擾途徑特異性抑制ER81基因表達(dá)及其在殺傷乳腺癌細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年約有130萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌，有50萬(wàn)婦女死于乳腺癌。其發(fā)病率始終處于上升狀態(tài)，尤以近20年來(lái)最為顯著。乳腺癌的發(fā)生涉及細(xì)胞凋亡與增殖失衡、細(xì)胞的分化紊亂、癌基因與抑癌基因的功能失調(diào)以及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)等多種生命活動(dòng)的異常。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)、生物工程學(xué)研究的迅速進(jìn)展，人們對(duì)乳腺癌的研究已進(jìn)入了一個(gè)活躍階段。
[0003]目前乳腺癌的治療主要是采取手術(shù)為主，輔以化療、放療及內(nèi)分泌治療等綜合方式。近年來(lái)，隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的日趨深入，腫瘤的基因治療以其治療的高特異性和相對(duì)較低的毒副作用為乳腺癌的治療開(kāi)辟了一個(gè)新天地。因此，尋找可用于診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物，并由此引出新的治療靶點(diǎn)，是當(dāng)今腫瘤學(xué)研究的重要內(nèi)容。
[0004]基因治療(gene therapy)是將正常的外源基因?qū)肴梭w祀細(xì)胞或組織以取代有缺陷的基因，通過(guò)其正常表達(dá)，達(dá)到治療基因病的目的?；蛑委熥鳛橹委熂膊〉囊环N新手段，正愈來(lái)愈受到人們的重視和關(guān)注。目前基因治療主要涉及惡性腫瘤、心腦血管疾病、遺傳病和某些傳染病，其中又以惡性腫瘤為主要治療對(duì)象，它為腫瘤治療開(kāi)辟了一條新的道路，而且隨著研究的深入，基因治療可能成為從根本上解決腫瘤問(wèn)題的金鑰匙。腫瘤的基因治療屬于一種生物治療手段，是一大類治療策略的總稱。根據(jù)治療機(jī)理不同，目前至少可以分為以下六類:1、免疫基因治療，治療基因包括腫瘤相關(guān)抗原基因、細(xì)胞因子(如IL -2、TNF等)基因或者M(jìn)HC基因等。2、抑癌基因治療，體內(nèi)導(dǎo)入野生型抑癌基因，替代缺失或異常的抑癌基因表達(dá)，可以達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果，目前研究較為深入的抑癌基因治療主要運(yùn)用p53、pl6、RB基因等。3、抗血管生成基因治療，通過(guò)基因?qū)氩⒈磉_(dá)的手段，在體內(nèi)長(zhǎng)期維持一定水平的血管生成抑制因子，抑制腫瘤血管的生成，從而達(dá)到抑制腫瘤的增殖、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。4、調(diào)節(jié)毒素表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，利用植物或細(xì)菌的免疫毒素，如白喉毒素、假單孢內(nèi)毒素等，將編碼正?；蜃儺惖亩舅鼗蚺c單克隆抗體細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子等連接，將毒素基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，引起腫瘤細(xì)胞的死亡；5、反義癌基因治療:通過(guò)人工合成的寡核苷酸與癌基因編碼的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，可以抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到封閉癌基因的目的。6、RNA干擾(RNAi):是指細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA某段序列同源的雙鏈RNA (dsRNA),可致該mRNA發(fā)生特 異性降解從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，通過(guò)RNA干擾，使與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的相關(guān)因子沉默，從而達(dá)到抗腫瘤作用。
[0005]在正常生物體內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA (dsRNA, 38個(gè)堿基以上)在依賴ATP的情況下，被核糖核酸酶Dicer切割成雙鏈小干擾RNA (siRNA，21~25個(gè)堿基)。siRNA這個(gè)結(jié)構(gòu)對(duì)基因沉默效應(yīng)十分關(guān)鍵。(I)SiRNA中有兩條鏈，一條為正義鏈，一條為反義鏈，其中反義鏈可和多種核酸酶結(jié)合形成沉默復(fù)合物(RISC)，同時(shí)由于反義鏈與某一種mRNA的編碼區(qū)是同源的，因此可與此編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，隨之引導(dǎo)RISC結(jié)合mRNA，然后通過(guò)依賴于ATP的解螺旋酶解開(kāi)siRNA的雙鏈，并將其正義鏈與靶mRNA置換，即mRNA取代正義鏈與反義鏈互補(bǔ)，繼而核酸酶將mRNA切割成21~23 nt的小片段，切斷部位大約在與siRNA反義鏈配對(duì)序列的中部，于是mRNA發(fā)生降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的沉默，干擾了靶基因的表達(dá)。(2)RISC中的RdRP(RNA依賴性RNA聚合酶)以siRNA反義鏈作為引物，以靶mRNA為模板合成新的dsRNA，然后由Dicer切割產(chǎn)生新的siRNA，新siRNA再去識(shí)別新一組mRNA，又產(chǎn)生新的SiRNA0經(jīng)過(guò)若干次合成-切割循環(huán)，沉默信號(hào)就會(huì)不斷放大，甚至穿過(guò)細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長(zhǎng)距離傳遞和維持。
[0006]RNAi具有許多傳統(tǒng)方法無(wú)法比擬的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。RNAi具有以下特征:(I)抗干擾性=RNAi是dsRNA介導(dǎo)的PTGS機(jī)制，翻譯抑制劑對(duì)RNAi不產(chǎn)生影響；(2)特異性:RNAi具有很高的特異性，RNAi只能特異地降解與之序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA，而其它mRNA的表達(dá)則不受影響；(3)催化性:RNAi抑制基因表達(dá)具有很高的效率，是以催化放大的方式進(jìn)行的，相對(duì)少量的dsRNA分子就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)；(4)傳遞性:RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以跨越細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞甚至生物體間長(zhǎng)距離傳遞和維持，并可傳遞給子代；(5)長(zhǎng)度限制性:引發(fā)有效RNAi的dsRNA不得短于21 bp，而大于30 bp的dsRNA誘導(dǎo)的不是特異的RNAi，而是引起細(xì)胞非特異性和全面的基因表達(dá)受抑和凋亡，一般來(lái)說(shuō)，引發(fā)有效RNAi的dsRNA要求在21~23 bp ; (6)濃度、時(shí)間雙重依賴性:dsRNA誘發(fā)的RNAi效應(yīng)的強(qiáng)度隨著其濃度的增高而增強(qiáng)；(7)ATP依賴性:在去除ATP的樣品中，RNAi現(xiàn)象降低或消失，顯示RNAi是一個(gè)ATP依賴的過(guò)程，可能Dicer和RISC的酶切反應(yīng)必須由ATP提供能量所致。基于以上的特點(diǎn)，siRNA作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于反義寡核苷酸、核酶等，RNAi可有效的彌補(bǔ)反義寡核苷酸技術(shù)與基因敲除技術(shù)的不足。
[0007]RNA 干擾作為一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing ,PTGS)機(jī)制，與傳統(tǒng)的基因敲除等基因沉默技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有投入少，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。因此，人們把注意力從反義RNA技術(shù)如核酶、寡聚脫氧核苷酸等轉(zhuǎn)移至RNAi上，使其在基因功能研究以及基因治療中發(fā)揮了重要的作用。從1998年Fire首次報(bào)道雙鏈RNA可以特異性地沉默基因表達(dá)以來(lái)，RNAi已經(jīng)在各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，尤其在腫瘤的治療領(lǐng)域中，已顯示巨大的潛力。近年來(lái)RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著RNAi技術(shù)將成為研究基因功能及進(jìn)行基因治療不可缺少的方法。RNAi技術(shù)的不斷成熟使其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到快速的發(fā)展，尤其在癌癥治療方面，RNAi作為一種基因治療手段已顯示出遠(yuǎn)大的前景，并有望 在腫瘤基因治療、遺傳性疾病以及病毒性感染治療等方面發(fā)揮重要作用。
[0008]1992年Thomas A.Brown等在鼠的基因組DNA中發(fā)現(xiàn)了 ER81基因，該基因位于鼠第12號(hào)染色體上，人ER81基因于1995年被Monte D等發(fā)現(xiàn)，命名為ETVl，位于人類第7號(hào)染色體上。ER81基因?qū)儆贓TS家族，Ets基因最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)Frederick的國(guó)家癌癥研究所分子腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)室。他們?cè)贓26鳥(niǎo)骨髓成紅細(xì)胞增多癥病毒所表達(dá)的融合蛋白中發(fā)現(xiàn)了癌基因Ets。E26為禽類的白血病病毒，是一個(gè)復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒，轉(zhuǎn)錄一個(gè)5.7kb RNA,并編碼一個(gè)135 kD的三聯(lián)核內(nèi)磷酸蛋白，即一個(gè)Ets的序列結(jié)合了濾過(guò)性病毒的gag基因和癌基因myb。此后，一系列細(xì)胞Ets基因被發(fā)現(xiàn)，它們的序列與E26都擁有高度保守的同源序列。因此，根據(jù)E26 (E-twenty six)的縮寫(xiě)而將該基因命名為Ets。又因?yàn)镋ts家族是細(xì)胞內(nèi)最大的信號(hào)依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，故也有作者認(rèn)為Ets來(lái)自英文“E26” (transformation specific)的縮寫(xiě)。ER81 為 ETS related 81 的縮寫(xiě)。
[0009]ER81作為基因轉(zhuǎn)錄因子，除DNA結(jié)合區(qū)域外，還有調(diào)控區(qū)域，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。ER81可以促進(jìn)細(xì)胞的分化、促進(jìn)器官的形成，在乳腺腫瘤的形成過(guò)程中，ER81起著促進(jìn)腫瘤的生成與轉(zhuǎn)移的作用。
[0010]ER81作為一個(gè)廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在人體組織中，ER81 mRNA在腦組織表達(dá)非常高，在睪丸、肺和心臟高表達(dá)，在脾、小腸、胰腺和結(jié)腸中度表達(dá)，在肝、前列腺和胸腺弱表達(dá)，在骨骼、肌肉、腎和卵巢表達(dá)非常弱，在胎盤(pán)和外周血粒細(xì)胞不表達(dá)。而在乳腺癌、Ewing’ s肉瘤、前列腺癌、黑色素瘤和胃癌等幾種腫瘤中都有ER81的異常表達(dá)。對(duì)正常乳腺細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系的分析發(fā)現(xiàn)，ER81不僅存在于正常乳腺細(xì)胞系，在乳腺癌細(xì)胞系中，ER81基因在MDA-MB-436、MDA-MB-330和MDA-MB-231細(xì)胞系以相對(duì)高水平表達(dá)，其中以MDA-MB-231細(xì)胞系表達(dá)最高。并且發(fā)現(xiàn)ER81 mRNA和ER和/或PR mRNA之間存在負(fù)相關(guān)性趨勢(shì)0° < 0.05)， 表明在乳腺腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，ER81起著促進(jìn)腫瘤生成與轉(zhuǎn)移的作用。這些結(jié)果說(shuō)明ER81對(duì)于體外和體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和惡性表現(xiàn)型的維持是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因素。ER81轉(zhuǎn)錄因子的激活可能發(fā)生在乳腺惡變過(guò)程的早期，該轉(zhuǎn)錄因子的激活對(duì)乳腺癌的產(chǎn)生和發(fā)展至關(guān)重要，而乳腺癌的發(fā)生可能是HER2基因通過(guò)激活ER81而促進(jìn)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。因此，ER81對(duì)于乳腺癌的治療從而降低腫瘤惡性轉(zhuǎn)化可能是一個(gè)潛在的分子靶點(diǎn)。
[0011]雖然人們對(duì)ER81基因、ER81轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能、ER81轉(zhuǎn)錄因子的活化機(jī)制、以及ER81轉(zhuǎn)錄因子與腫瘤的關(guān)系的研究已達(dá)到一定的程度。但是，人體是一個(gè)有機(jī)的、復(fù)雜的相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)；而且人類腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多階段、多基因參與的系統(tǒng)過(guò)程；腫瘤細(xì)胞的增生、凋亡、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移牽涉到一系列復(fù)雜的分子事件，在這些過(guò)程中關(guān)于激活ER81表達(dá)的信號(hào)通路、受ER81調(diào)控的靶基因以及與其它基因間的相互作用等了解得還不夠充分。
[0012]ER81蛋白可由乳腺癌細(xì)胞的ER81 mRNA編碼合成，如果運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，將攜帶特異性小干擾RNA (siRNA)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，將可能使腫瘤細(xì)胞的ER81 mRNA特異性降解，減少ER81蛋白的合成，使ER81的表達(dá)下調(diào)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)?；谏鲜鲈恚景l(fā)明利用基因工程技術(shù)，設(shè)計(jì)、選擇3段人ER81基因的RNA干擾片段，將設(shè)計(jì)的人ER81siDNA序列插入siRNA表達(dá)載體pGenesil-Ι中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pGenesil-ETVlA/ETVlB/ETV1C，研究靶向ER81 mRNA的siRNA對(duì)人乳腺癌細(xì)胞ER81 mRNA和ER81蛋白表達(dá)的影響及對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。有助于闡明ER81基因及其靶基因的作用，進(jìn)一步研究新的ER81反應(yīng)性基因，將為深入研究其在多種生理和病理過(guò)程中的作用提供理論依據(jù)，有助于闡明ER81轉(zhuǎn)錄因子在惡性腫瘤中的發(fā)展規(guī)律，為從分子水平研究疾病的發(fā)病機(jī)制，以及臨床的診斷治療提供新的思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種特異性抑制人ER81基因的siRNA序列，其特征在于，其堿基序列為:GUUGGUACAUAGGACGUCC。針對(duì)的ER81基因靶序列是ETVlA:GGACGTCCTATGTACCAAC。
[0014]本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性抑制人ER81基因表達(dá)的siRNA的制備方法。
[0015]本發(fā)明是基于ER81基因7個(gè)轉(zhuǎn)錄突變體的共同序列設(shè)計(jì)siRNA序列。并利用RNAi在線設(shè)計(jì)軟件查找共同序列中得分較高的RNA干擾靶點(diǎn)序列。再經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)，去除可能與其他非相關(guān)基因雜交的靶點(diǎn)序列，最終在序列的上、中、下游各選擇一個(gè)得分較高、特異性好的靶點(diǎn)序列。最后用篩選出的靶點(diǎn)序列構(gòu)建重組siRNA表達(dá)載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，最終在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出具有干擾活性的siRNA。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的siRNA不僅特異性高，而且能夠同時(shí)抑制人ER81基因7個(gè)不同轉(zhuǎn)錄突變體的表達(dá)。
[0016]本發(fā)明還提供了編碼該siRNA前體的DNA序列，以及包含該編碼序列的重組siRNA表達(dá)載體pGenesil-ETVlA。利用該重組siRNA表達(dá)載體可以直接在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA，從而抑制ER81基因表達(dá)，達(dá)到抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的。 [0017]本發(fā)明所用siRNA表達(dá)載體pGenesil-Ι含有一個(gè)可用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA的具有固定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(G)和終止位點(diǎn)(TTTTTT)的U6啟動(dòng)子。該表達(dá)載體上的U6啟動(dòng)子可以轉(zhuǎn)錄出具有特異序列的siRNA前體一shRNA(短發(fā)卡RNA)，該mRNA并不編碼氨基酸，而是在細(xì)胞內(nèi)自動(dòng)形成一個(gè)帶有莖環(huán)的shRNA。該shRNA在細(xì)胞內(nèi)被核酸酶Dicer識(shí)別并剪切為長(zhǎng)度約有21-25nt并在3’末端帶有兩個(gè)核苷酸突出的siRNA。用這個(gè)成熟的siRNA作為引導(dǎo)序列，引導(dǎo)RISC (RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物)去識(shí)別與siRNA互補(bǔ)的靶基因mRNA序列。然后siRNA與mRNA在復(fù)合物中換位，核酸酶Dicer將mRNA切割成21_23nt的片段，特異性的抑制靶基因的表達(dá)。新產(chǎn)生的siRNA片段可再次引導(dǎo)RISC與靶基因mRNA形成復(fù)合物，繼續(xù)降解靶基因的mRNA，從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，使得靶基因的表達(dá)幾乎完全被特異性抑制。
[0018]本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性抑制人ER81基因表達(dá)的方法。本發(fā)明所提供的抑制人乳腺癌細(xì)胞中ER81基因表達(dá)水平的方法，是利用DNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，將抑制該基因表達(dá)的siRNA編碼基因克隆到siRNA表達(dá)載體，然后導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞。重組siRNA表達(dá)載體在細(xì)胞中表達(dá)出能夠抑制ER81基因mRNA的siRNA，使得乳腺癌細(xì)胞中的ER81基因在轉(zhuǎn)錄水平得到抑制。
[0019]本發(fā)明還提供了所述siRNA在制備抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明的上述目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
(1)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索人ER81基因的mRNA，通過(guò)序列比對(duì)確定該基因7個(gè)轉(zhuǎn)錄突變體的同源序列。用Genscript網(wǎng)站中的RNAi在線設(shè)計(jì)軟件查找同源序列中得分最高的RNA干擾靶點(diǎn)序列。經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)，去除可能與其他非相關(guān)基因雜交的靶點(diǎn)序列，最終在序列的上、中、下游各選擇一個(gè)得分較高、特異性好的靶點(diǎn)序列；
(2)將確定的祀點(diǎn)序列按I+Sense+Loop+AntiSense+終止信號(hào)+5^7 I +HindIII酶切位點(diǎn)的形式設(shè)計(jì)編碼能夠自發(fā)形成莖環(huán)RNA的siDNA序列。并將化學(xué)合成的siDNA片段連接到siRNA表達(dá)載體pGenesil-Ι中，構(gòu)建出重組siRNA表達(dá)載體pGenesi1-ETVlA/ETV1B/ETV1C ；
(3)將重組siRNA表達(dá)載體pGenesi1-ETV1A/ETV1B/ETV1C轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，用G418篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株MDA-MB-231/ETVIA/ETV1B/ETV1C ；
(4)提取穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株MDA-MB-231/ETV1A /ETV1B/ETV1C的總RNA和總蛋白，分別進(jìn)行熒光定量PCR和Western Blot，從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平確定ER81基因的表達(dá)量變化。通過(guò)MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化。最后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況，確定穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株MDA-MB-231/ETV1A/ETV1B/ETV1C的凋
亡率變化。
[0021]本發(fā)明最終篩選出了一個(gè)能夠明顯抑制人ER81基因表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的siRNA。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所篩選出的重組表達(dá)載體pGenesi1-ETVlA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)ER81基因的表達(dá)量顯著降低；利用MTT和平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖被顯著抑制；最后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡明顯增加。說(shuō)明pGenesil-ETVlA在抑制了乳腺癌細(xì)胞ER81基因的表達(dá)后，會(huì)抑制癌細(xì)胞的增殖，引起癌細(xì)胞的凋亡，最終起到抑制、殺傷癌細(xì)胞的作用。
[0022]本發(fā)明的有益成果:本發(fā)明利用DNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，以在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的ER81基因?yàn)榘悬c(diǎn)，針對(duì)其基因編碼序列設(shè)計(jì)了小干擾RNA (SiRNA)0將能夠編碼該siRNA的重組siRNA表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中，通過(guò)外源導(dǎo)入的siRNA來(lái)介導(dǎo)內(nèi)源ER81 mRNA的降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ER81基因的沉默。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選出了一個(gè)能夠明顯抑制ER81基因表達(dá)的siRNA。該siRNA可用于觀察細(xì)胞內(nèi)ER81基因被特異性抑制的情況下表達(dá)及信號(hào)通路的變化，為從分子和細(xì)胞水平研究ER81基因的功能提供了有效的工具。同時(shí)也為乳腺癌的基因治療提供了新的途徑，在靶向治療與ER81基因相關(guān)的腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。
[0023]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
(1)本發(fā)明所選用的siRNA表達(dá)載體，控制siRNA轉(zhuǎn)錄的是RNA聚合酶III家族中的U6啟動(dòng)子，其有確定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，便于設(shè)計(jì)編碼siRNA的siDNA序列。并且能夠高水平表達(dá)小RNA，使得siRNA在細(xì)胞內(nèi)的積累較多，抑制效果更明顯；
(2)本發(fā)明所選用的siRNA表達(dá)載體，攜帶有新霉素抗性基因和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的編碼基因。新霉素抗性基因可用于G418篩選，便于穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立。綠色熒光蛋白可以直接在熒光顯微鏡下觀察，能夠快速、準(zhǔn)確的追蹤轉(zhuǎn)染效率；
(3)本發(fā)明在構(gòu)建重組siRNA表達(dá)載體的過(guò)程中，利用兩條引物相互退火延伸，得到的退火產(chǎn)物不需要進(jìn)行酶切及純化，就可以直接與處理好的載體進(jìn)行連接。并且本發(fā)明在設(shè)計(jì)編碼干擾序列的siDNA序列時(shí)引入了一個(gè)I酶切位點(diǎn)，可用于連接后的酶切鑒定，解決了因插入片段過(guò)短PCR難以鑒定陽(yáng)性克隆的問(wèn)題。以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)極大的簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)工序，提聞了實(shí)驗(yàn)效率，降低了實(shí)驗(yàn)成本；
(4)本發(fā)明所篩選出的針對(duì)人ER81基因的siRNA抑制效果更為顯著。本發(fā)明針對(duì)人ER81基因的上、中、下 游分別設(shè)計(jì)了干擾靶點(diǎn)，并從實(shí)驗(yàn)中篩選出了對(duì)ER81基因抑制效率較高的siRNA ；
(5)本發(fā)明所篩選出的siRNA序列具有更高的特異性。小干擾RNA在識(shí)別靶序列過(guò)程中只降解與之相對(duì)應(yīng)的單個(gè)基因的mRNA，針對(duì)同源基因共同序列的RNAi則能導(dǎo)致同源基因共同失活，而單個(gè)堿基的改變就能導(dǎo)致RNAi的失效。本發(fā)明針對(duì)ER81基因7個(gè)轉(zhuǎn)錄突變體的共同序列設(shè)計(jì)siRNA序列，經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)去除了與其他非相關(guān)基因配對(duì)程度高的siRNA序列，選擇了只能夠特異性靶向ER81基因mRNA的siRNA序列；
(6)本發(fā)明構(gòu)建的抑制ER81基因的重組siRNA表達(dá)載體，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡?？捎糜谶M(jìn)一步研究ER81基因的功能及其在關(guān)于激活ER81表達(dá)的信號(hào)通路、受ER81調(diào)控的靶基因以及與其它基因間的相互作用；
(7)本發(fā)明使用DNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，利用脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組siRNA表達(dá)載體。安全性高、無(wú)插入突變的危險(xiǎn)，并且沒(méi)有免疫毒性反應(yīng)。為腫瘤治療提供了新的靶向治療方案和相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)制備；
(8)本發(fā)明使用RNA干擾技術(shù)，直接從轉(zhuǎn)錄水平上降低ER81基因mRNA的表達(dá)，并直接導(dǎo)致ER81蛋白的積累減少進(jìn)而抑制ER81信號(hào)通路。本發(fā)明相對(duì)于反義寡核苷酸、基因敲除以及受體中和抗體等傳統(tǒng)抑制蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療腫瘤的技術(shù)和方法，具有操作簡(jiǎn)便、特異性高、針對(duì)性強(qiáng)、級(jí)聯(lián)放大、效果更加持續(xù)的特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為本發(fā)明siRNA表達(dá)載體pGenesil-Ι的漢.Η I _ind III雙酶切電泳圖，M:Transit Plus DNA Marker，泳道I為BamR I單酶切條帶，泳道2為III單酶切條帶，泳道3為BarM I取Hind III雙酶切條帶；
圖2為本發(fā)明重組siRNA表達(dá)載體的I酶切鑒定電泳圖，M:7>a/?52K? Plus DNAMarker，泳道 1-4 分別為重組質(zhì)粒 pGenesi1-ETVlA/ ETVIB/ ETV1C/NC 的 I 酶切條帶；圖3為本發(fā)明重組siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 24小時(shí)后的共聚焦掃描圖，X 200，I為表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，2為全光下細(xì)胞共聚焦掃描圖，3為綠色熒光與全光通道的疊加圖；
圖4為本發(fā)明提取五組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞及正常乳腺癌細(xì)胞的總RNA電泳圖，泳道1-6分別為轉(zhuǎn)染A、B、C、NC、BC組以及未轉(zhuǎn)染的空白組細(xì)胞總RNA電泳圖；
圖5為本發(fā)明轉(zhuǎn)染A、B、C、NC、BC組以及未轉(zhuǎn)染的空白組細(xì)胞中ER81基因mRNA的相
對(duì)定量結(jié)果圖；
圖6為本發(fā)明轉(zhuǎn)染A、B、C、NC、BC組以及未轉(zhuǎn)染的空白組細(xì)胞中ER81蛋白的WesternBlot結(jié)果圖，泳道1-6分別為轉(zhuǎn)染A、B、C、NC、BC組以及未轉(zhuǎn)染的空白組細(xì)胞ER81和內(nèi)參GAPDH蛋白的定量表達(dá)結(jié)果；
圖7為本發(fā)明MTT法繪制轉(zhuǎn)染A、B、C、NC、BC組以及未轉(zhuǎn)染的空白組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
圖；
圖8為本發(fā)明轉(zhuǎn)染A、B、C、NC、BC組以及未轉(zhuǎn)染的空白組細(xì)胞的克隆形成率結(jié)果圖； 圖9為本發(fā)明轉(zhuǎn)染A、B、C、NC、BC組以及未轉(zhuǎn)染的空白組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布圖；
圖10為本發(fā)明轉(zhuǎn)染A、B、C、NC、BC組以及未轉(zhuǎn)染的空白組細(xì)胞的細(xì)胞增殖指數(shù)示意
圖；
圖11為本發(fā)明轉(zhuǎn)染A、B、C、NC、BC組以及未轉(zhuǎn)染的空白組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡示意圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，本發(fā)明中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0026]實(shí)施例1:祀向人ER81基因的重組siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
1、靶向人ER81基因的siDNA基因片段的合成
在NCBI網(wǎng)站上的基因數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中搜索人ER81 mRNA序列，ER81基因共有7個(gè)轉(zhuǎn)錄突變體，基因登錄號(hào)分別為:NM_004956，NM_001163147，NM_001163148，NM_001163149，NM_001163150, NM_001163151, NM_001163152。通過(guò)序列比對(duì)找出7個(gè)轉(zhuǎn)錄突變體的共同序列并利用它們的共同序列在Genscript公司的RNAi在線設(shè)計(jì)工具GenScript siRNATarget Finder (https://www.genscript.com/ssl_bin/app/rnai)中查找得分最高的幾個(gè)siRNA靶點(diǎn)序列。最后將設(shè)計(jì)出的siRNA靶點(diǎn)序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，剔除可能與其他非相關(guān)基因雜交的序列。最終選擇mRNA上、中、下游三個(gè)位置的靶點(diǎn)序列，得到如下序列:ETV1A: GGACGTCCTATGTACCAAC ；ETV1B: CGGCGAGGATCACTTCAGC ；ETVIC:GACAGACATGGAACGTCAC。 同時(shí)設(shè)置亂序siRNA靶點(diǎn)序列為陰性對(duì)照組，其中亂序siRNA靶點(diǎn)序列為:GACTTCATAAGGCGCATGC。
[0027]由于siRNA必須由雙鏈RNA (dsRNA)在宿主細(xì)胞內(nèi)通過(guò)核酸內(nèi)切酶RNaseIII家族中的核酸Dicer切割為具有活性的雙鏈小干擾RNA(siRNA)，所以必須設(shè)計(jì)出一個(gè)在轉(zhuǎn)錄為RNA后能夠形成帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的編碼siRNA的siDNA基本結(jié)構(gòu)為酶切位點(diǎn)I +Sense+Loop+AntiSense+終止信號(hào)+5^7 I +Hind III酶切位點(diǎn)。其中Sense 為編碼 siRNA 的 siDNA 序列，Loop 環(huán)的序列為 5，- TTCAAGAGA-3，, AntiSense 為編碼siRNA的siDNA反向互補(bǔ)序列，終止信號(hào)序列為5’ -TTTTTT-3’。
[0028]最終確定合成的siDNA序列及互補(bǔ)序列分別為:ETV1A-1:GATCCCGGACGTCCTATGTACCAACTTCAAGAGAGTTGGTACATAGGACGTCCTTTTTTGTCGACA ；
【權(quán)利要求】
1.一種抑制ER81基因表達(dá)的siRNA，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA，其特征在于該siRNA是通過(guò)如SEQID NO:8所示的DNA寡核苷酸鏈轉(zhuǎn)錄并在細(xì)胞內(nèi)由核酸酶Dicer剪切而成。
3.權(quán)利要求1所述的siRNA在制備抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡相關(guān)藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述siRNA在制備抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡相關(guān)藥物中的應(yīng)用， 其特征在于:所述癌細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞株。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103923925SQ201410189953
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】楊舉倫, 馮強(qiáng), 黎貴蕓 申請(qǐng)人:楊舉倫