具有增強(qiáng)子作用的家蠶BmHel-8轉(zhuǎn)座子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及的是一種來(lái)自家蠶的具有顯著增強(qiáng)下游基因表達(dá)的滾環(huán)式轉(zhuǎn)座子(BmHel-8)。該增強(qiáng)子由SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列組成。本發(fā)明是通過(guò)生物信息學(xué)方法在家蠶基因組中鑒定獲得并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法驗(yàn)證其具有增強(qiáng)子的功能，該發(fā)明不但有助于獲取高豐度的目的蛋白推動(dòng)家蠶生物反應(yīng)器的發(fā)展而且有利于家蠶品種的改良。
【專利說(shuō)明】具有增強(qiáng)子作用的家?jiàn)^BmHel-8轉(zhuǎn)座子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要是家蠶轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器和品種改良領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]滾環(huán)式轉(zhuǎn)座子(Helitixm)最初是在模式生物擬南芥，水稻和線蟲(chóng)基因組中被發(fā)現(xiàn)并且被歸類為DNA類轉(zhuǎn)座子(Kapitonov and Jurka2001)。但是Helitron轉(zhuǎn)座子的序列結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座機(jī)制都與其它DNA類轉(zhuǎn)座子完全不同。在轉(zhuǎn)座機(jī)制上，由于完整的Helitron轉(zhuǎn)座子編碼的轉(zhuǎn)座酶包含復(fù)制起始(Rep)和解螺旋酶(Helicase)的保守基序，所以它們被認(rèn)為是以滾環(huán)式機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)座的并且偏向于插入到基因組的AT 二核苷酸內(nèi)。在序列結(jié)構(gòu)上，它們的5’端是以TC 二核苷酸起始，3’端是以CTRR(R代表A或G)四個(gè)核苷酸終止，并且在其3’端通常具有一個(gè)頸環(huán)結(jié)構(gòu)(Mendiola et al.1994)。
[0003]近年許多研究表明Helitron轉(zhuǎn)座子廣泛的發(fā)布于高等真核生物基因組內(nèi)，例如在線蟲(chóng)中有超過(guò)2%，青蛙中超過(guò)0.5%，蝙蝠中大約3%，玉米中大約2%和果蠅中1-5%的基因組序列是由 Helitron 轉(zhuǎn)座子組成(Kapitonov and Jurka2001, Kapitonov2006, Prithamand Feschotte2007, Du et al.2009, Yang and Bennetzen2009)。雖然 Helitron 轉(zhuǎn)座子在許多真核生物中被報(bào)道，但是Helitron轉(zhuǎn)座子在鱗翅目昆蟲(chóng)基因組中卻尚未報(bào)道。最近，我們用基于結(jié)構(gòu)和同源性搜索相結(jié)合的方法對(duì)家蠶的全基因組Helitron轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了鑒定和注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶基因組中具有21個(gè)Helitron轉(zhuǎn)座子家族(被命名為BmHel-1到BmHel-21)，約占整個(gè) 家族基因組序列的4.23%。
[0004]雖然近年許多物種的Helitron轉(zhuǎn)座子相繼被報(bào)道,但是對(duì)于Helitron轉(zhuǎn)座子的研究還仍停留在全基因組鑒定上。真核生物基因組中為什么會(huì)保留如此多的Helitron轉(zhuǎn)座子序列？究竟具有什么功能？仍鮮有報(bào)道。最近我們應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)家蠶的BmHel-8具有顯著地增加其下游基因表達(dá)的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是利用生物信息學(xué)，分子和細(xì)胞生物學(xué)方法在家蠶中鑒定并證實(shí)了家蠶BmHel-8轉(zhuǎn)座子起到了增強(qiáng)子的作用。目的在于將該元件構(gòu)建到表達(dá)載體或者轉(zhuǎn)基因載體中可以有效增加目的基因表達(dá)的效果。
[0006]本發(fā)明 申請(qǐng)人:利用生物信息學(xué)方法在家蠶基因組中鑒定了一個(gè)Helitron轉(zhuǎn)座子BmHel-8。應(yīng)用PCR和TA克隆的方法在家蠶基因組中獲得了該轉(zhuǎn)座子的序列。測(cè)序驗(yàn)證為我們的目的序列。然后將該轉(zhuǎn)座子分別連接到細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體PGL3-Basic Vector載體的報(bào)告基因的5’端，再將這兩個(gè)載體分別進(jìn)行家蠶的細(xì)胞(BmN)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)了 BmHel-8轉(zhuǎn)座子具有增強(qiáng)子的作用。
[0007]這不但有助于原核或真核表達(dá)獲取高豐度的目的蛋白而且對(duì)家蠶生物反應(yīng)器的發(fā)展也將起到推動(dòng)作用。
[0008]本發(fā)明的家蠶增強(qiáng)子BmHel-8通過(guò)以下步驟獲得和證實(shí):[0009](I)家蠶BmHel-8轉(zhuǎn)座子的鑒定:首先應(yīng)用基于結(jié)構(gòu)和同源性搜索相結(jié)合的方法在家蠶9倍基因組序列中進(jìn)行Helitron轉(zhuǎn)座子序列的搜索。結(jié)果在家蠶基因組中鑒定出BmHel-8轉(zhuǎn)座子。該轉(zhuǎn)座子的一致序列(consensus sequence)長(zhǎng)度421bp, 5’端以ATC三核苷酸起始，3’端以CTAGT五個(gè)核苷酸終止。進(jìn)一步以BmHel-8的一致序列作為問(wèn)詢序列，用BLASTN程序在家蠶9倍基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋BmHel-8的同源序列(e值〈e—6，相似度>80%，序列長(zhǎng)度>80bp)，最終發(fā)現(xiàn)BmHel-8轉(zhuǎn)座子家蠶基因組中具有14656個(gè)拷貝。
[0010](2)家蠶BmHel-8轉(zhuǎn)座子序列的獲得:以家蠶大造品系的基因組DNA為模板，BmHel-8轉(zhuǎn)座子的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物(上游引物為:5’ -GGTACCATCTATATATTAATACGTGAAGCA-3’ ；下游引物為:5，-CTCGAGACTAGAGGTCCCGCAGTAG-3，下劃線分別為限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取目的條帶，PCR產(chǎn)物回收后與PMD-19-T載體連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性克隆后送往上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的序列與預(yù)期的結(jié)果一致。
[0011](3)將目的片段構(gòu)建到細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體
[0012]將含有目的片段(BmHel-8)的T克隆載體和細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體pGL3_Basic Vector分別用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI進(jìn)行雙酶切，分別回收目的片段和載體骨架，電泳檢測(cè)后，用DNA連接酶將目的片段BmHel-8與細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得含有BmHel-8重組質(zhì)粒的克隆，然后將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液送往上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與第一次測(cè)得的序列一致，獲得正確的克??；
[0013](4)細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果 [0014]將構(gòu)建好的具有BmHel-8轉(zhuǎn)座子插入和沒(méi)有BmHel-8轉(zhuǎn)座子插入的細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體分別與內(nèi)參質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑一同轉(zhuǎn)入家蠶的卵巢細(xì)胞系(BmN)內(nèi)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞27°C培養(yǎng)24~48個(gè)小時(shí)候后，用熒光素酶活性檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)這兩種報(bào)告基因的表達(dá)量。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0016]目前對(duì)于家蠶的研究已進(jìn)入后基因組即功能基因組時(shí)代，根據(jù)已有的報(bào)道大量與家蠶抗性和絲蛋白產(chǎn)量相關(guān)的基因被鑒定。然而尋找到合適的增強(qiáng)子來(lái)增加這些基因在家蠶中的表達(dá)以期獲得抗病力強(qiáng)和高產(chǎn)繭絲的家蠶品種變得尤為迫切。所以我們發(fā)明的這一增強(qiáng)子不但有望推動(dòng)家蠶優(yōu)良品種的繁育而且可能對(duì)家蠶生物反應(yīng)器的發(fā)展起到推動(dòng)作用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1:
[0019]家蠶BmHel-8轉(zhuǎn)座子的鑒定:應(yīng)用基于結(jié)構(gòu)和同源性搜索相結(jié)合的方法在家蠶9倍基因組序列中進(jìn)行Helitron轉(zhuǎn)座子序列的搜索。結(jié)果在家蠶基因組中鑒定出BmHel-8轉(zhuǎn)座子。該轉(zhuǎn)座子的一致序列(consensus sequence)長(zhǎng)度421bp (見(jiàn)SEQ ID NO:1)。
[0020]實(shí)施例2:
[0021]家蠶BmHel-8轉(zhuǎn)座子對(duì)下游基因表達(dá)增強(qiáng)作用的鑒定:為了探測(cè)BmHel-8是否對(duì)鄰近基因的表達(dá)具有調(diào)控作用，我們進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。我們首先將家蠶的A3啟動(dòng)子序列構(gòu)建到螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體(pGL3Basic Vector)的報(bào)告基因的5’端，然后再將BmHel-8的序列構(gòu)建到A3啟動(dòng)子的前面。然后將這個(gè)構(gòu)建好的載體和內(nèi)參載體(海腎熒光素酶報(bào)告基因)共轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞(BmN)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后測(cè)酶活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)熒光素酶報(bào)告基因的5’ 端插入了 BmHel-8時(shí)，顯著的增加了報(bào)告基因的表達(dá)量(Ρ〈0.01)(見(jiàn)附圖1)。
【權(quán)利要求】
1.具有增強(qiáng)子作用的BmHel-8轉(zhuǎn)座子，其特征在于該轉(zhuǎn)座子是家蠶來(lái)源的，序列組成如 SEQ ID NO:1 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的增強(qiáng)子，其中所說(shuō)的增強(qiáng)子來(lái)源于家蠶BmHel-8轉(zhuǎn)座子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2，其中所說(shuō)的家蠶是家蠶大造品系。
4.根據(jù)權(quán)利 要求1中的增強(qiáng)子BmHel-8轉(zhuǎn)座子在構(gòu)建家蠶重組表達(dá)載體并提高外源或內(nèi)源基因表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)率中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103923891SQ201410190464
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】張澤, 韓民錦 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)