一株鞘氨醇桿菌及其在藍(lán)藻水華控制中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株鞘氨醇桿菌及其在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。從太湖水體中分離獲得了一株具有顯著溶藻活性的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium?sp.)Lzh-3，保藏號為CGMCC?No.8281，并且從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化并鑒定出其有效溶藻成分六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-異丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮，其中六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-異丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮對銅綠微囊藻9110的半致死量LD50分別為5.7μg/mL和8.2μg/mL。可用于新型生物殺藻劑的研發(fā)和生產(chǎn)，最終應(yīng)用于湖泊藍(lán)藻水華的控制。
【專利說明】一株鞘氨醇桿菌及其在藍(lán)藻水華控制中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境微生物領(lǐng)域，特別涉及一株分泌溶藻物質(zhì)的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.) Lzh-3及其在藍(lán)藻水華控制中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近些年來由于水體富營養(yǎng)化，太湖爆發(fā)了嚴(yán)重的藍(lán)藻水華，造成的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)問題日益突出，因此探索控制藍(lán)藻水華發(fā)生的有效途徑是非常必要的。
[0003]目前控制藍(lán)藻水華的方法可分為物理方法、化學(xué)方法和生物方法。但物理方法耗費(fèi)大量人力物力，化學(xué)方法易造成二次污染，生物方法因其高效、專一、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而得到越來越多的關(guān)注。之前的報道顯示溶藻菌導(dǎo)致了藍(lán)藻水華的消退，因此溶藻菌在控制藍(lán)藻水華方面具有很大的應(yīng)用潛力。
[0004]因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于篩選高效溶藻細(xì)菌或分離富集溶藻細(xì)菌代謝產(chǎn)生的高效溶藻活性物質(zhì)，以開發(fā)微生物殺藻劑，用以安全和高效的控制藍(lán)藻水華問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于現(xiàn)有控制藍(lán)藻水華技術(shù)中物理方法耗費(fèi)大量人力物力、處理能力有限和化學(xué)方法容易造成二次污染的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是尋找高效溶藻細(xì)菌及分離富集溶藻細(xì)菌代謝產(chǎn)生的高效溶藻活性物質(zhì)，用以安全和高效的控制藍(lán)藻水華問題。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一株具有溶藻活性的鞘氨醇桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物在藍(lán)藻水華控制中的應(yīng)用。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:提供一株從太湖水體中分離獲得的具有溶藻活性的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.) Lzh_3,該菌株屬革蘭氏染色陰性菌，細(xì)胞呈直桿狀，0.6~0.8 μ mX 0.6~4 μ m ;無鞭毛，少有滑行運(yùn)動；過氧化氫酶陽性，化能異養(yǎng)，無特殊營養(yǎng)需求；室溫下放置數(shù)日后菌落通常呈淡黃色；不產(chǎn)生吲哚，不水解蛋白，不液化明膠，氧化糖醇類產(chǎn)酸。經(jīng)16srRNA基因序列分析和同源性比較,得知其與GenBank中某鞘氨醇桿菌菌株有99%的同源性，故鑒定為鞘氨醇桿菌屬細(xì)菌，命名為鞘氨醇桿菌Lzh-3ο
[0008]該菌株已經(jīng)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC N0.8281，保藏日期為2013年9月27日。保藏機(jī)構(gòu)地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，郵編:100101，電話:86-10-64807355。該菌種的16S rRNA基因在GenBank中的登錄號是HQ896843。
[0009]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述鞘氨醇桿菌Lzh-3在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。
[0010]進(jìn)一步地，本發(fā)明鞘氨醇桿菌Lzh-3在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用方式可以是通過其發(fā)酵產(chǎn)物，包括發(fā)酵液、發(fā)酵液濃縮物、發(fā)酵液粗提物或發(fā)酵液提取物。
[0011]鞘 氨醇桿菌Lzh-3發(fā)酵產(chǎn)物的制備步驟如下:
[0012]I)、發(fā)酵鞘氨醇桿菌Lzh-3菌株，獲得發(fā)酵液；[0013]2)、用萃取劑萃取發(fā)酵液，獲得萃取液；
[0014]3)、將萃取液蒸干，獲得粗提物；
[0015]4)、將粗提物溶于水后過濾；
[0016]5)、將步驟4)過濾后的濾液進(jìn)一步提純得到多組分或單一組分的有效溶藻物質(zhì)，即為發(fā)酵液提取物。
[0017]優(yōu)選地，步驟I)中，發(fā)酵條件為，鞘氨醇桿菌Lzh-3接種于PH7.0的滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C、200rpm環(huán)境條件下發(fā)酵48h。
[0018]優(yōu)選地，步驟2)中，萃取劑為乙酸乙酯，萃取體系中乙酸乙酯與發(fā)酵液的體積比為1:1，混合后，放入振蕩器中振蕩24h，分離出的上層乙酸乙酯溶液即鞘氨醇桿菌Lzh-3發(fā)酵液的萃取液。
[0019]優(yōu)選地,步驟3)中，過濾為使用0.22 μ m孔徑濾膜過濾。
[0020]優(yōu)選地，步驟4)中，進(jìn)一步提純手段為組層析，具體為:將濾液通過半制備柱，用HPLC進(jìn)行初步純化，得到溶藻成分；將得到的溶藻成分通過分析柱，用HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到兩種有效溶藻成分S-3A和S-3B。
[0021]鞘氨醇桿菌Lzh-3的發(fā)酵產(chǎn)物中有效的溶藻成分S-3A和S_3B的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過LC-MS、GC-MG和NMR分析獲得。
[0022]有效溶藻成分S-3A的分子尚子峰為155.0820m/z,樣品分子量為154.0742,分子式為C7HltlN2O2，GC-MS分析結(jié)果顯示S-3A與GC-MS數(shù)據(jù)庫中六氫吡咯并[I，2_a]吡嗪-1，4- 二酮的結(jié)構(gòu)相似，核磁共振氫譜結(jié)果是1H NMR (400MHz, D2O) 54.31 (dd, J =
11.5，4.7Hz, 1H)，4.15 (dd, J = 17.3，2.6Hz, 1H)，3.86 (d, J = 17.3Hz, 1H)，3.53 (dd, J =
8.7，4.8Hz, 2H), 2.31 (dd, J = 8.5, 3.2Hz, 1H)，2.05 (dd, J = 7.3, 3.2Hz, 1H)，1.94 (ddd, J =16.6，6.6，4.6Hz, 2H)。
[0023]有效溶藻成分S-3B的分子離子峰為185.1288m/z，樣品分子量為184.1212，分子式為C9H16N2O2, GC-MS分析結(jié)果顯示S-3B與已知文獻(xiàn)中3-異丁基-6-甲基哌嗪-2，5- 二酮的結(jié)構(gòu)相似，核磁共振氫譜結(jié)果是1H NMR (400MHz, D2O) δ 4.16 (d, J =
7.2Hz, 2H)，1.74 (s, 3H)，1.49 (d, J = 7.1Hz, 3H)，0.95 (s, 6H)。
[0024]由此可以確定，上述鞘氨醇桿菌Lzh-3的發(fā)酵提取物中兩種具有溶藻活性的有效成分分別為具有結(jié)構(gòu)式⑴的六氫吡咯并[l，2-a]吡嗪-1，4-二酮和具有結(jié)構(gòu)式(II)的3-異丁基-6-甲基哌嗪-2，5- 二酮。
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一株具有溶藻活性的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.) Lzh_3,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC N0.8281，保藏日期為2013年9月27曰。
2.如權(quán)利要求1所述的鞘氨醇桿菌Lzh-3在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的鞘氨醇桿菌Lzh-3的發(fā)酵產(chǎn)物在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。
4.一種具有結(jié)構(gòu)式(II)所示結(jié)構(gòu)的化合物在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。
5.一種溶藻菌劑，其特征在于，所述溶藻菌劑中包含權(quán)利要求1所述的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.)Lzh_3。
6.一種溶藻藥劑，其特征在于，所述溶藻藥劑中包含權(quán)利要求1所述的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.)Lzh-3的發(fā)酵產(chǎn)物,所述發(fā)酵產(chǎn)物為發(fā)酵液、發(fā)酵液濃縮物、發(fā)酵液粗提物或發(fā)酵液提取物。
7.一種制備鞘氨醇桿菌Lzh-3發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括如下步驟: 1)、發(fā)酵權(quán)利要求1所述的鞘氨醇桿菌Lzh-3，獲得發(fā)酵液； 2)、用萃取劑萃取發(fā)酵液，獲得萃取液； 3)、將萃取液蒸干，獲得粗提物； 4)、將粗提物溶于水后過濾； 5)、將步驟4)過濾后的濾液進(jìn)一步提純得到多組分或單一組分的有效溶藻物質(zhì)，即為發(fā)酵液提取物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟I)中，發(fā)酵條件為，鞘氨醇桿菌Lzh-3接種于PH7.0的滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C、200rpm環(huán)境條件下發(fā)酵48h。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟2)中，萃取劑為乙酸乙酯，乙酸乙酯與發(fā)酵液的體積比為1:1。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟4)中，所述進(jìn)一步提純手段為:將濾液通過半制備柱，用HPLC進(jìn)行初步純化，得到溶藻成分；將得到的溶藻成分通過分析柱，用HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到單一組分的有效溶藻成分。
【文檔編號】C12R1/01GK103992970SQ201410190528
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】楊虹, 李正華, 林升欽 申請人:上海交通大學(xué)