一種適合于南疆特色果樹高質(zhì)量rna分離的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種適合于南疆特色果樹高質(zhì)量RNA分離的方法，該方法將“硼砂-CTAB”法和“改良CTAB”法結(jié)合在一起，即該發(fā)明的提取緩沖液中添加了硼砂，技術(shù)步驟的大體流程主要參考了“改良CTAB”法的流程。再結(jié)合南疆特色果樹(核桃、香梨、扁桃、杏、蘋果)自身特性，該發(fā)明重新確定了一套適合南疆特色果樹(核桃、香梨、扁桃、杏、蘋果)的高質(zhì)量RNA分離技術(shù)體系，具體包括操作環(huán)境溫度的確定、65℃溫浴提取的時(shí)間確定、高速冷凍離心反復(fù)抽提的轉(zhuǎn)速和時(shí)間確定以及高速冷凍離心沉淀RNA的轉(zhuǎn)速和時(shí)間確定。該技術(shù)發(fā)明經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)效果非常穩(wěn)定，重現(xiàn)性非常高，可操作性更強(qiáng)。
【專利說明】—種適合于南疆特色果樹高質(zhì)量RNA分離的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種適合于南疆特色果樹高質(zhì)量RNA分離的方法，屬于果樹生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有的針對植物的RNA分離技術(shù)體系，以及在多種果樹上得到較好應(yīng)用的RNA分離技術(shù)體系，都在南疆特色果樹上進(jìn)行了試驗(yàn)，效果不明顯，尤其是不穩(wěn)地，重現(xiàn)性也不太好，時(shí)而能分離出來，有時(shí)就沒了結(jié)果。針對這一缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的就是探索一種在南疆特色果樹上穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的RNA分離的方法，只有這樣才不耽誤完成科研任務(wù)的時(shí)間，避免了科研工作者的重復(fù)摸索過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種適合于南疆特色果樹高質(zhì)量RNA分離的方法，以便提供一種在南疆特色果樹上穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的RNA分離的方法。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0005]一種適合于南疆特色果樹高質(zhì)量RNA分離的方法，具體包括以下步驟:
[0006](I)準(zhǔn)備:將要進(jìn)行RNA分離操作的室內(nèi)溫度控制在_17°C，用于研磨樣品的研缽于_80°C預(yù)冷，用75%乙醇擦洗超凈臺(tái)，并紫外燈照射超凈臺(tái)30min，以下所有加樣、吸上清等操作(除了離心)均應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，高速冷凍離心機(jī)必須提前預(yù)冷至4°C ；
[0007](2)在2mL離心管中加入1500 μ L硼砂-CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液和26 μ L β -巰基乙醇，于恒溫水浴鍋中65°C溫浴5分鐘；
[0008](3)取出預(yù)冷好的研缽，先加入少許液氮再次預(yù)冷，同時(shí)加入Ig樣品和10%PVPP(聚乙烯比咯烷酮)，迅速研磨樣品，其間，加2-3次液氮反復(fù)研磨，將研磨成粉末狀的樣品加入預(yù)熱好的離心管中，渦旋震蕩混勻后，再次放回恒溫水浴鍋中65°C溫浴5min，每一分鐘顛倒離心管一次；
[0009](4)溫浴結(jié)束后，于高速冷凍離心機(jī)中，10000r/min,4°C,離心10min ；
[0010](5)轉(zhuǎn)移離心管中的上清液到另一個(gè)2mL離心管中，加入等體積的酚:氯仿:異戍醇(25: 24:1),輕微振蕩混勻，于高速冷凍離心機(jī)中，10000r/min,4°C,離心10min ;
[0011](6)重復(fù)第5步一次；
[0012](7)轉(zhuǎn)移離心后的上清液到另一個(gè)2mL離心管中，再用氯仿:異戊醇(24:1)抽提2次，即加完氯仿:異戊醇(24: I)后，輕微振蕩混勻，于高速冷凍離心機(jī)中，1000Or/min，4°C，離心10min，重復(fù)操作兩次；
[0013](8)轉(zhuǎn)移上清到另一個(gè)1.5mL離心管中，加入上清液0.6倍體積的異丙醇，輕輕搖勻，-20°C下沉淀 RNA，30min ；
[0014](9)于高速冷凍離心機(jī)中，12000r/min,4°C,離心20min,倒掉上清,用500yL75%乙醇漂洗沉淀1-2次，12000r/min,4°C,離心10min ；[0015](10)用移液器將離心后剩下的乙醇吸干，在超凈臺(tái)內(nèi)揮發(fā)5min，沉淀于燥后，用40 μ LDEPC (焦碳酸二乙酯)處理過的超純水溶解RNA沉淀。
[0016](11)用1%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測RNA質(zhì)量，該發(fā)明的每次檢測結(jié)果都能穩(wěn)定重現(xiàn)兩條RNA條帶，即28S RNA和18S RNA。同時(shí)用超微量分光光度計(jì)檢測所得RNA濃度，該發(fā)明的每次檢測結(jié)果可達(dá)到:Α260/280在2.0左右，Α260/230都大于2.0，說明該發(fā)明所得的RNA純度較高，污染非常小，非常適合做下一步研究，比如反轉(zhuǎn)錄、分離克隆基因等。
[0017]該發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明創(chuàng)造性地將“硼砂-CTAB”法和“改良CTAB”法結(jié)合在一起，即該發(fā)明的提取緩沖液中添加了硼砂，技術(shù)步驟的大體流程主要參考了 “改良CTAB”法的流程。再結(jié)合南疆特色果樹(核桃、香梨、扁桃、杏、蘋果)自身特性，該發(fā)明重新確定了一套適合南疆特色果樹(核桃、香梨、扁桃、杏、蘋果)的高質(zhì)量RNA分離技術(shù)體系，具體包括操作環(huán)境溫度的確定、65°C溫浴提取的時(shí)間確定、高速冷凍離心反復(fù)抽提的轉(zhuǎn)速和進(jìn)間確定以及高速冷凍離心沉淀RNA的轉(zhuǎn)速和時(shí)間確定。該技術(shù)發(fā)明經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)效果非常穩(wěn)定，重現(xiàn)性非常高，可操作性更強(qiáng)。
[0018]該發(fā)明技術(shù)剛開始只在在南疆早實(shí)核桃上實(shí)驗(yàn)，獲得了理想的效果后，在其它幾個(gè)南疆特色果樹(香梨、杏、扁桃、蘋果)上的應(yīng)用效果也非常好。經(jīng)過重復(fù)分離和重復(fù)檢測，都能獲得清晰的RNA的兩條帶，即28S和18S，而且超微量分光光度計(jì)所檢測數(shù)據(jù)也非常好，即A260/280在2. 0左右，A260/230都大于2.0，進(jìn)一步證明了該發(fā)明所得的RNA純度高，污染小，非常適合做下一步研究。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行描述，以便更好的理解本發(fā)明。
[0020]實(shí)施例
[0021]本發(fā)明實(shí)施例中的適合于南疆特色果樹高質(zhì)量RNA分離的方法，具體包括以下步驟:
[0022](I)準(zhǔn)備:將要進(jìn)行RNA分離操作的室內(nèi)溫度控制在_17°C，用于研磨樣品的研缽于_80°C預(yù)冷，用75%乙醇擦洗超凈臺(tái)，并紫外燈照射超凈臺(tái)30min，以下所有加樣、吸上清等操作(除了離心)均應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，高速冷凍離心機(jī)必須提前預(yù)冷至4°C ；
[0023](2)在2mL離心管中加入1500 μ L硼砂-CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液和26 μ L β -巰基乙醇，于恒溫水浴鍋中65°C溫浴5分鐘；
[0024](3)取出預(yù)冷好的研缽，先加入少許液氮再次預(yù)冷，同時(shí)加入Ig樣品和10%PVPP(聚乙烯比咯烷酮)，迅速研磨樣品，其間，加2-3次液氮反復(fù)研磨，將研磨成粉末狀的樣品加入預(yù)熱好的離心管中，渦旋震蕩混勻后，再次放回恒溫水浴鍋中65°C溫浴5min，每一分鐘顛倒離心管一次；
[0025](4)溫浴結(jié)束后，于高速冷凍離心機(jī)中，10000r/min,4°C,離心10min ；
[0026](5)轉(zhuǎn)移離心管中的上清液到另一個(gè)2mL離心管中，加入等體積的酚:氯仿:異戍醇(25: 24:1),輕微振蕩混勻，于高速冷凍離心機(jī)中，10000r/min,4°C,離心10min ;
[0027](6)重復(fù)第5步一次；
[0028](7)轉(zhuǎn)移離心后的上清液到另一個(gè)2mL離心管中，再用氯仿:異戊醇(24:1)抽提2次，即加完氯仿:異戊醇(24: I)后，輕微振蕩混勻，于高速冷凍離心機(jī)中，1000Or/min，4°C，離心10min，重復(fù)操作兩次；
[0029](8)轉(zhuǎn)移上清到另一個(gè)1.5mL離心管中，加入上清液0.6倍體積的異丙醇，輕輕搖勻，-20°C下沉淀 RNA，30min ；
[0030](9)于高速冷凍離心機(jī)中，12000r/min,4°C,離心20min,倒掉上清,用500yL75%乙醇漂洗沉淀1-2次，12000r/min,4°C,離心10min ；
[0031](10)用移液器將離心后剩下的乙醇吸干，在超凈臺(tái)內(nèi)揮發(fā)5min，沉淀干燥后，用40 μ L DEPC (焦碳酸二乙酯)處理過的超純水溶解RNA沉淀。
[0032](11)用1%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測RNA質(zhì)量，該發(fā)明的每次檢測結(jié)果都能穩(wěn)定重現(xiàn)兩條RNA條帶，即28S RNA和18SRNA。同時(shí)用超微量分光光度計(jì)檢測所得RNA濃度，該發(fā)明的每次檢測結(jié)果可達(dá)到:Α260/280在2.0左右，Α260/230都大于2.0，說明該發(fā)明所得的RNA純度較高，污染非常小，非常適合做下一步研究，比如反轉(zhuǎn)錄、分離克隆基因等。
[0033]本發(fā)明實(shí)施例的方法在南疆早實(shí)核桃上實(shí)驗(yàn)，獲得了理想的效果后，在其它幾個(gè)南疆特色果樹(香梨、杏、扁桃、蘋果)上的應(yīng)用效果也非常好。采用上述步驟方法所獲得的幾種南疆特色果樹RNA超微量分光光度計(jì)檢測數(shù)據(jù)如表1所示。經(jīng)過重復(fù)分離和重復(fù)檢測，都能獲得清晰的RNA的兩條帶，即28S和18S，而且超微量分光光度計(jì)所檢測數(shù)據(jù)也非常好，即Α260/280在2.0左右，Α260/230都大于2.0，進(jìn)一步證明了該發(fā)明所得的RNA純度高，污染小，非常適合做下一步研究。
[0034]表1幾種南疆特色果樹RNA超微量分光光度計(jì)檢測數(shù)據(jù)
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種適合于南疆特色果樹高質(zhì)量RNA分離的方法，其特征在:具體包括以下步驟: (1)準(zhǔn)備:將要進(jìn)行RNA分離操作的室內(nèi)溫度控制在-17°C，用于研磨樣品的研缽于_80°C預(yù)冷，用75%乙醇擦洗超凈臺(tái)，并紫外燈照射超凈臺(tái)30min，以下所有加樣、吸上清操作(除了離心)均應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，高速冷凍離心機(jī)必須提前預(yù)冷至4°C ； (2)在2mL離心管中加入1500μ L硼砂-CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液和.26 μ L β -巰基乙醇，于恒溫水浴鍋中65°C溫浴5分鐘； (3)取出預(yù)冷好的研缽，先加入少許液氮再次預(yù)冷，同時(shí)加入Ig樣品和10%PVPP (聚乙烯比咯烷酮)，迅速研磨樣品，其間，加2-3次液氮反復(fù)研磨，將研磨成粉末狀的樣品加入預(yù)熱好的離心管中，渦旋震蕩混勻后，再次放回恒溫水浴鍋中65°C溫浴5min，每一分鐘顛倒離心管一次； (4)溫浴結(jié)束后,于高速冷凍離心機(jī)中，10000r/min,4°C,離心10min； (5)轉(zhuǎn)移離心管中的上清液到另一個(gè)2mL離心管中，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25: 24:1),輕微振蕩混勻，于高速冷凍離心機(jī)中，10000r/min,4°C,離心10min ; (6)重復(fù)第5步一次； (7)轉(zhuǎn)移離心后的上清液到另一個(gè)2mL離心管中，再用氯仿:異戊醇(24: I)抽提2次，即加完氯仿:異戊醇(24: I)后，輕微振蕩混勻，于高速冷凍離心機(jī)中，lOOOOr/min，.4°C，離心10min，重復(fù)操作兩次； (8)轉(zhuǎn)移上清到另 一個(gè)1.5mL離心管中，加入上清液0.6倍體積的異丙醇，輕輕搖勻，-20°C下沉淀 RNA，30min ； (9)于高速冷凍離心機(jī)中，12000r/min,4°C，離心20min，倒掉上清，用500 μ L75 %乙醇漂洗沉淀 1-2 次，12000r/min, 4°C,離心 IOmin ； (10)用移液器將離心后剩下的乙醇吸干，在超凈臺(tái)內(nèi)揮發(fā)5min，沉淀干燥后，用.40 μ LDEPC (焦碳酸二乙酯)處理過的超純水溶解RNA沉淀； (11)用1%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測RNA質(zhì)量。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103966199SQ201410191027
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】金強(qiáng), 張銳, 王艷, 高疆生 申請人:塔里木大學(xué)