一種同步檢測四種蘋果病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種同步檢測四種蘋果病毒的方法。以帶有葉芽蘋果一年生枝條頂端0～5cm皮層組織或組培苗葉片組織為試材，采用TRIzol法提取組織總RNA，以總RNA為模板，六堿基隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA合成，以四種病毒特異性引物及內(nèi)源基因引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳中擴(kuò)增條帶大小判斷組織攜帶病毒情況。判斷標(biāo)準(zhǔn)為：未擴(kuò)增出內(nèi)源基因特異性片段即代表實(shí)驗(yàn)失?。粩U(kuò)增出內(nèi)源基因特異性片段即代表蘋果組織總RNA提取質(zhì)量符合要求；擴(kuò)增出內(nèi)源基因特異性片段及任意病毒特異性片段即代表組織中帶有該病毒；擴(kuò)增出內(nèi)源基因特異性片段，未擴(kuò)增出任何病毒特異性片段即代表組織中不帶有任何病毒。
【專利說明】—種同步檢測四種蘋果病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種同步檢測四種蘋果病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蘋果病毒病在世界各地廣泛分布，我國各蘋果產(chǎn)區(qū)普遍存在，樹體受到病毒危害后，病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)寄生并增殖，破壞干擾樹體的正常生理機(jī)能，嚴(yán)重影響果樹的生長，降低產(chǎn)量、品質(zhì)、果品的貯藏性和耐運(yùn)力，也影響蘋果根系對土壤營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。
[0003]蘋果病毒病主要通過嫁接途徑傳染，在長期的無性繁殖過程中，病毒在植物體內(nèi)積累和傳播，用帶毒樹的任何部位做繁殖材料，其后代均帶毒，造成病毒病害日益嚴(yán)重。在當(dāng)今技術(shù)水平下，蘋果病毒病尚無有效的防治藥劑，采用脫毒方法，繁殖無病毒苗木，加強(qiáng)植物檢疫是防治病毒病的有效途徑之一。我國對蘋果病毒病的研究起步較晚，自1978年從國外引進(jìn)病毒指示植物才開始對蘋果病毒病進(jìn)行系統(tǒng)研究，目前已初步明確了我國蘋果主產(chǎn)區(qū)病毒病的種類、分布，并在病毒檢測方面取得一定的進(jìn)展，獲得了一些品種的無病毒苗木，但真正應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中的脫毒源種微乎其微。脫除病毒是果樹無毒化的基礎(chǔ)，準(zhǔn)確、靈敏、快速的病毒檢測技術(shù)既是果樹無毒化栽培的關(guān)鍵環(huán)節(jié)也是基本保障。
[0004]蘋果病毒大多為潛隱性病毒，在常規(guī)品種不表現(xiàn)明顯癥狀，其具有在樹體中含量低、分布不均、分布受外界因素影響大、組織富含多糖、多酚的特點(diǎn)，目前，準(zhǔn)確、快速、靈敏的蘋果病毒檢測技術(shù)還有待進(jìn)一步完善。多重RT-PCR可同時(shí)檢測侵染同一植株的多種病毒，大大縮短檢測時(shí)間，同時(shí)減少檢測費(fèi)用。蘋果病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍，因此，多重RT-PCR技術(shù)在蘋果病毒檢測中具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0005]多重RT-PCR在國內(nèi)外已有應(yīng)用于果樹病毒檢測的報(bào)道，但同時(shí)檢測四種蘋果病毒的方法鮮有報(bào)道，加上病毒具有基因組變異快的特點(diǎn)，本發(fā)明針對我國四種主要蘋果病毒多重RT-PCR方法的開發(fā)將為更好的繁育無毒苗木和病毒檢疫奠定基礎(chǔ)，為今后蘋果病毒病的有效防治提供理論依據(jù)，從而促進(jìn)我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明建立了一套能夠同時(shí)檢測蘋果四種病毒的多重RT-PCR技術(shù)體系。
[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:通過提取蘋果組織總RNA，采用四種病毒及一種蘋果內(nèi)源基因的特異性引物，通過多重RT-PCR方法擴(kuò)增各病毒及蘋果內(nèi)源基因特異性序列，蘋果內(nèi)源基因可以起到排除假陰性對照的作用，最后通過凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物大小，判定組織中所帶病毒種類。
[0008]本發(fā)明的具體內(nèi)容，即同時(shí)檢測四種蘋果病毒的具體方法如下:
(I)蘋果組織總RNA的提取田間樣本采取帶有葉芽一年生枝條頂端(T5cm皮層組織、組培苗采取葉片組織，采用Trizol法提取組織總RNA，定容于30 μ L除RNase水中，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0009] (2)病毒特異性基因序列的擴(kuò)增以步驟(1)獲得的總RNA為模板，進(jìn)行多重RT-PCR得到擴(kuò)增產(chǎn)物。引物為:第I對引物:ASPV-F:5’_T GGAACCTCATGCTGC A-3’ ；ASPV-R:5’-T TGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATA A~3f。第 2 對引物:ASGV-F:5’-GAGGATTTAGGTCCCTCT C_3’ ；ASGV-R:5’ -GTATAAAGGCAGGCATGTCAAC C_3’。第 3 對引物:ApMV_F:5，-CAACCGAGAGGTTGGC A~3f ；ApMV-R j’-TTCTAGCAGGTCTTCATCGA-3’。第 4 對引物:ACLSV-F:5’ -G AGAGTTTCAGTTTGCTAGAC A_3’ ；ACLSV-R:5’-G CAAATTCAGTCTGTAAAA G_3’。第 5 對蘋果內(nèi)源基因引物:EFl-a-V:5’ -A CCAACCTTGACTGGTACAAG G~3f -,EF卜 a -認(rèn):5’ -TGGTGCATCTCAACAGAC T_3，。
[0010](3)瓊脂糖凝膠電泳檢測取8yL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用含0.Syg.mr1溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠在I X TAE緩沖液中進(jìn)行電泳分析，120V電泳40分鐘，根據(jù)電泳條帶大小判斷病
毒種類。
[0011]3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于四種蘋果病毒特異性片段大小為:蘋果莖痕病毒stem pitting virus, ASPV) 360 bp、蘋果莖溝病毒stemgrooving virus, ASGV) 821 bp、蘋果花葉病毒(々7/?7<9 mosaic virus, ApMV) 161 bp、蘋果裡綠葉斑病毒(々少7(9 chlorotic leafspot virus, ACLSV) 566 bp,蘋果內(nèi)源基因 EF1_ α特異性片段大小為236 bp。
[0012]本發(fā)明專利的有益效果是，通過設(shè)計(jì)可明顯區(qū)分四種蘋果病毒的特異性引物及能夠排除假陰性樣本的內(nèi)源基因引物，進(jìn)行檢測體系及程序的優(yōu)化，建立了一套同步檢測四種蘋果病毒的檢測技術(shù)，避免了普通PCR檢測的多次重復(fù)工作，檢測穩(wěn)定性好，特異性強(qiáng)，可應(yīng)用于田間蘋果樣本及組培苗帶毒情況的快速檢測，從而指導(dǎo)蘋果病毒病害防控措施的制定，減少病害造成的損失。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是帶毒樣本經(jīng)多重RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳效果圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以帶有葉芽蘋果一年生枝條頂端0-5 cm皮層組織或組培苗葉片組織為試材，取50mg組織，在液氮中迅速研磨，加0.5 mL提取試劑(400 μ L RNA提取試劑+100 μ LP -巰基乙醇)進(jìn)行提取，最后加入30 UL DEPC水充分溶解RNA。然后以六堿基隨機(jī)引物為引物，以M-MLV為反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA合成，以合成的cDNA為模板，配制以下PCR反應(yīng)體系:cDNA 4.0μ L, ASGV-F 0.6 μ L, ASGV-R 0.6 μ L, ASPV-F 0.2 μ L，ASPV-R 0.2 μ L，ACLSV-F 0.6μ L, ACLSV-R 0.6 μ L, ApMV-F 0.5 μ L, ApMV-R 0.5 μ L, EFl- α -F 0.05 μ L, EFl- α -R
0.05 μ L,2XES Taq 12.5 μ L，用dd2H20水補(bǔ)足25 μ L。按照以下程序進(jìn)行PCR:預(yù)變性 94°C2 min ;35 個(gè)循環(huán) :94°C 變性 I min，55°C 退火 I min，72°C 延伸 I min ;72°C 終延伸 7min。取8 UL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用含0.5 μ g.ml—1溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠在I XTAE緩沖液中進(jìn)行電泳分析，120V電泳40分鐘，根據(jù)電泳條帶大小判斷病毒種類。四種蘋果病毒特異性片段大小分別為:ASPV 360 bp、ASGV 821 bp、ApMV 161 bp、ACLSV 566 bp,BFl-α236 bp ο
【權(quán)利要求】
1.一種同步檢測四種蘋果病毒的方法，其特征在于通過提取蘋果組織總RNA，采用四種病毒及一種蘋果內(nèi)源基因的特異性引物，通過多重RT-PCR方法擴(kuò)增各病毒及蘋果內(nèi)源基因特異性序列，凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物大小，判定組織中所帶病毒種類。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)蘋果組織總RNA的提取田間樣本采取帶有葉芽一年生枝條頂端(T5cm皮層組織，組培苗采取葉片組織，采用Trizol法提取組織總RNA，定容于30 μ L除RNase水中，-80°C保存?zhèn)溆谩? (2)病毒特異性基因序列的擴(kuò)增以步驟(1)獲得的總RNA為模板，進(jìn)行多重RT-PCR得到擴(kuò)增產(chǎn)物。引物為--第I對引物:ASPV-F:5’-TGGAACCTCATGCTGC A_3’；ASPV-R:5’-T TGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATA Α_3’。第 2 對引物:ASGV-F:5’-GAGGATTTAGGTCCCTCT C_3，;ASGV_R:5’ -G T A T A AAGGCAGGCATGTCAAC C_3’。第 3 對引物:ApMV_F:5，-C A A C C G A G AGGTTGGC A-3，; ApMV-R:5，-T TCTAGCAGGT CTTCATCG A_3，。第 4對引物:ACLSV-F:5，-G AGAGTTTCAGTTTGCTAGAC A_3，;ACLSV-R:5，_GCAAATTCAGTCTGTAAAA G_3’。第 5 對蘋果內(nèi)源基因引物-F:5’_ACCAACCTTGACTGGTACAAG G~3f -,EF卜 a -義:5’ -T G G T G C A T C TCAACAGAC T-3，。 (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測取8μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用含0.5 μ g.πι1溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠在I X TAE緩沖液中進(jìn)行電泳分析，120V電泳40分鐘，根據(jù)電泳條帶大小判斷病毒種類。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于四種蘋果病毒特異性片段大小為:蘋果莖痘病毒stem pitting virus, ASPV) 360 bp、蘋果莖溝病毒stem groovingvirus, ASGV) 821 bp、蘋果花葉病毒mosaic virus, ApMY) 161 bp、蘋果裡綠葉斑病毒(AppIe chlorotic leafspot virus, ACLSV) 566 bp,蘋果內(nèi)源基因 EFl- α 特異性片段大小為236 bp ο
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103966362SQ201410196186
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】王亞南, 曹克強(qiáng), 趙緒生 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)