土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法，包括以下步驟：1)選用經(jīng)常服用抗生素的豬，以豬糞DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增目的抗性基因片段；2)切膠回收純化擴(kuò)增后的目的抗性基因，將抗性基因連接在T載體上，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，涂LB平板后挑選陽(yáng)性克隆子；3)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)大培養(yǎng)菌液的質(zhì)量，選克隆成功的菌液提取質(zhì)粒，檢測(cè)質(zhì)粒濃度，換算出質(zhì)粒所攜帶抗性基因的拷貝數(shù)，并按10倍為稀釋梯度稀釋備用，作為抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品；4)提取土壤的基因組DNA，將土壤樣品DNA和抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，從而最終得出土壤樣品的抗性基因的拷貝數(shù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于土壤環(huán)境污染物的檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]1928年Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)了青霉素,20世紀(jì)40年代青霉素大規(guī)模投入生產(chǎn)，隨后又相繼發(fā)現(xiàn)了鏈霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、甲氧西林等抗生素。我國(guó)是抗生素的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，其中2007年生產(chǎn)抗生素21萬(wàn)噸，除出口約3萬(wàn)噸外，在國(guó)內(nèi)使用18萬(wàn)噸(其中養(yǎng)殖業(yè)占9.7萬(wàn)噸)。目前抗生素已經(jīng)廣泛的用于人類(lèi)和動(dòng)物的疾病預(yù)防及治療，同時(shí)也被用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑來(lái)提高畜禽的生長(zhǎng)速率?，F(xiàn)代養(yǎng)殖場(chǎng)中大量使用抗生素已經(jīng)成為一種習(xí)慣，在使用一種抗生素產(chǎn)生耐藥性的情況下，養(yǎng)殖場(chǎng)一方面加大抗生素使用劑量，另一方面在不斷尋找新的抗生素，同時(shí)還會(huì)使用復(fù)方抗生素制劑，農(nóng)業(yè)土壤是獸用抗生素的主要?dú)w宿地，大部分抗生素以母體化合物形式隨糞尿排出體外，80%以上的畜禽糞未經(jīng)綜合處理，便直接施于農(nóng)田，導(dǎo)致土壤中抗生素抗性基因(ARGs)和耐受菌的積累。土壤中的微生物種類(lèi)繁多，數(shù)量巨大，高密度的微生物更容易促進(jìn)基因的橫向轉(zhuǎn)移，ARGs可以整合到一些可移動(dòng)基因元件上，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等，通過(guò)直接或者間接接觸(如食物鏈)等途徑進(jìn)入人體，增加人體的耐藥性，進(jìn)而對(duì)人體健康以及整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成長(zhǎng)期潛在危害?？股丿煼ㄊ歉腥炯膊〉闹饕踔潦俏ㄒ化煼ǎ虏【退幮缘脑黾雍蛿U(kuò)散已經(jīng)成為全球疾病治療所面臨的一個(gè)巨大問(wèn)題。
[0003]Pruden等人早在2006年就提出，將ARGs作為一種新型的環(huán)境污染物?？股乜剐曰蚍N類(lèi)繁多，數(shù)量巨 大，比如編碼四環(huán)素類(lèi)抗性基因就有三大類(lèi)超過(guò)四十種，建立土壤中ARGs的定量檢測(cè)方法，對(duì)于進(jìn)一步系統(tǒng)地監(jiān)測(cè)土壤環(huán)境中抗生素抗性基因及其評(píng)價(jià)其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)是十分必要的。目前沒(méi)有商品化的抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品，而且普通PCR只能定性的檢測(cè)基因的有無(wú)，而且靈敏度不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法。
[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0006]I)、選用經(jīng)常服用抗生素的豬，服用的抗生素種類(lèi)應(yīng)包括目的抗性基因所對(duì)應(yīng)的抗生素；
[0007]提取上述豬的豬糞的基因組DNA，并以豬糞DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增目的抗性基因片段；
[0008]備注說(shuō)明:如果無(wú)法獲得目的抗性基因，則重選豬糞，重復(fù)上述步驟1)，直至能獲得該目的抗性基因?yàn)橹梗?br> [0009]2)、切膠回收純化擴(kuò)增后的目的抗性基因，將抗性基因連接在T載體上，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，涂LB平板后挑選陽(yáng)性克隆子，用LB培養(yǎng)液培養(yǎng)(擴(kuò)大培養(yǎng))；
[0010]3)、用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)大培養(yǎng)菌液的質(zhì)量，選克隆成功的菌液提取質(zhì)粒，檢測(cè)質(zhì)粒濃度，換算出質(zhì)粒所攜帶抗性基因的拷貝數(shù)，并按10倍為稀釋梯度稀釋備用，作為抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品；
[0011]4)、提取土壤的基因組DNA，將土壤樣品DNA和抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)和其擴(kuò)增的CT值生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)而得出土壤樣品的抗性基因的拷貝數(shù)。
[0012]作為本發(fā)明的土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法的改進(jìn):
[0013]所述目的抗性基因，其長(zhǎng)度為100_350bp ；
[0014]所述目的抗性基因?yàn)?青霉素類(lèi)抗性基因blaTEM基因、四環(huán)素類(lèi)抗性基因tetC基因、四環(huán)素類(lèi)抗性基因tetM基因。
[0015]作為本發(fā)明的土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn):
[0016]所述步驟3)中，質(zhì)粒濃度換算成每μ L質(zhì)粒溶液所攜帶的絕對(duì)模板拷貝數(shù)的公式% =Copies/μ L = [x/(a+b)X660]Xl(T9X6.02X 1023，其中 X 為質(zhì)粒濃度(ng/ μ L) ;a 為載體長(zhǎng)度(bp) ;b為目的抗性基因長(zhǎng)度(bp)。
[0017]作為本發(fā)明的土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟I)中，
[0018]PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:
[0019]2 X EasyTaq PCR SuperMix10 μ L ；
[0020]DNA 模板(濃度為 18 ~20ng/ μ L,例如為 19.1ng/ μ L) I μ L ;
[0021]目的抗性基因的前后引物(10μ Μ)各luL;
[0022]余量為二次重蒸水；
[0023]反應(yīng)條件為:
[0024]94°C預(yù)變性 4min，
[0025]
【權(quán)利要求】
1.土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟: 1)、選用經(jīng)常服用抗生素的豬； 提取上述豬的豬糞的基因組DNA，并以豬糞DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增目的抗性基因片段； 2)、切膠回收純化擴(kuò)增后的目的抗性基因，將抗性基因連接在T載體上，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，涂LB平板后挑選陽(yáng)性克隆子，用LB培養(yǎng)液培養(yǎng)； 3)、用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)大培養(yǎng)菌液的質(zhì)量，選克隆成功的菌液提取質(zhì)粒，檢測(cè)質(zhì)粒濃度，換算出質(zhì)粒所攜帶抗性基因的拷貝數(shù)，并按10倍為稀釋梯度稀釋備用，作為抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品； 4)、提取土壤的基因組DNA，將土壤樣品DNA和抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)和其擴(kuò)增的CT值生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)而得出土壤樣品的抗性基因的拷貝數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法，其特征在于: 所述目的抗性基因，其長(zhǎng)度為100-350bp ； 所述目的抗性基因?yàn)?青霉素類(lèi)抗性基因blaTEM基因、四環(huán)素類(lèi)抗性基因tetC基因、四環(huán)素類(lèi)抗性基因tetM基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟3)中，質(zhì)粒濃度換算成每μ L質(zhì)粒溶液所攜帶的絕對(duì)模板拷貝數(shù)的公式為:Copies/μ L = [x/(a+b) X660] Χ10-9Χ6.02X 1023，其中 X 為質(zhì)粒濃度(ng/ μ L) ;a 為載體長(zhǎng)度(bp) ;b為目的抗性基因長(zhǎng)度(bp)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟I)中， PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為: 2XEasyTaq PCR SuperMix10 μ L ； DNA模板(濃度為18~20ng/ μ L)I μ L ; 目的抗性基因的前后引物(10 μ Μ)各luL; 余量為二次重蒸水； 反應(yīng)條件為: 94°C預(yù)變性4min，

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法，其特征在于: 當(dāng)目的抗性基因?yàn)榍嗝顾仡?lèi)抗性基因blaTEM基因時(shí)，前后引物序列分別為AAGCCATACCAAACGACGAG, CCGCCTCCATCCAGTCTAT ;退火溫度為 66 °C ； 當(dāng)目的抗性基因?yàn)樗沫h(huán)素類(lèi)抗性基因tetC基因時(shí)，前后引物序列分別為GCGGGATATCGTCCATTCCG, GCGTAGAGGATCCACAGGACG ;退火溫度為 68 °C ； 當(dāng)目的抗性基因?yàn)樗沫h(huán)素類(lèi)抗性基因tetM基因時(shí)，前后引物序列分別為ACAGAAAGCTTATTATATAAC, TGGCGTGTCTATGATGTTCAC ;退火溫度為 46 °C。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的土壤中抗生素抗性基因的定量檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟4)中，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的R2值應(yīng)大于0.98，越接近于1，結(jié)果可信度越高；擴(kuò)增效率E的范圍應(yīng)在0.8-1.2,越 接近于I,越理想。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103981263SQ201410198989
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】張奇春, 侯昌萍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)