一種pcr擴(kuò)增引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種PCR擴(kuò)增引物及其應(yīng)用。本發(fā)明所述PCR擴(kuò)增引物由具有SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列的下游引物組成，其對于枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)的β-D-葡萄糖苷酶基因檢測具有較好的適應(yīng)性，特別是適合于分離自香草蘭的枯草芽孢桿菌，能夠廣泛應(yīng)用到枯草芽孢桿菌β-D-葡萄糖苷酶基因的檢測以及檢測枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)β-D-葡萄糖苷酶基因試劑盒的制備中，可以協(xié)助產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶菌株的篩選工作。
【專利說明】—種PCR擴(kuò)增引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體的說是涉及一種PCR擴(kuò)增引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]香草蘭原產(chǎn)墨西哥，屬蘭科攀緣藤本。香草蘭是高級食用香料，有“食用香料之王”之稱，豆莢含有2~3%的香蘭素，廣泛用于食品工業(yè)中。
[0003]香草蘭發(fā)酵豆莢的最主要風(fēng)味物質(zhì)為香蘭素，其中香蘭素由其前體香蘭素葡萄糖苷經(jīng)豆莢自身攜帶的內(nèi)源β-D-葡萄糖苷酶水解而形成。目前已分離到多種產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的細(xì)菌。但是，從香草蘭上分離的各種菌株不是都能分泌出的β-D-葡萄糖苷酶，這需要通過生物技術(shù)手段進(jìn)行鑒定。[0004]至今已有多項研究報道了 β-D-葡萄糖苷酶基因的擴(kuò)增引物序列，但是細(xì)菌中的蛋白編碼基因變異度較大，不同菌種、不同來源的菌株其蛋白編碼基因序列差異較大，擴(kuò)增引物的適用范圍有限，本領(lǐng)域關(guān)于分離自香草蘭的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的性質(zhì)還未有深入的研究，特別是針對這些菌株的β -D-葡萄糖苷酶基因的檢測引物未見有報道。
[0005]因此，現(xiàn)階段需要一種新型的生物技術(shù)手段用于檢測枯草芽孢桿菌是否攜帶有β -D-葡萄糖苷酶基因，特別是分離自香草蘭的枯草芽孢桿菌，以此來協(xié)助產(chǎn)β -D-葡萄糖苷酶的菌株的篩選工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種PCR擴(kuò)增引物，使得所述PCR擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增枯草芽孢桿菌β -D-葡萄糖苷酶基因，具有較好的適用性。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種PCR擴(kuò)增引物，使得所述PCR擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增分離自香草蘭的枯草芽孢桿菌β -D-葡萄糖苷酶基因，具有較好的適用性。
[0008]本發(fā)明的另一個目的在于提供所述PCR擴(kuò)增引物在制備檢測枯草芽孢桿菌β -D-葡萄糖苷酶基因試劑盒中的應(yīng)用以及一種檢測枯草芽孢桿菌β -D-葡萄糖苷酶基因的試劑盒。
[0009]本發(fā)明的另一個目的在于提供所述PCR擴(kuò)增引物在檢測枯草芽孢桿菌β-D-葡萄糖苷酶基因中的應(yīng)用以及一種檢測枯草芽孢桿菌β-D-葡萄糖苷酶基因的方法。
[0010]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0011]一種PCR擴(kuò)增引物，由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQID Ν0:2所示核苷酸序列的下游引物組成。
[0012]利用本發(fā)明提供的上下游引物對分離自香草蘭的枯草芽孢桿菌基因組擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，將測序所得序列去除前端和末尾序列片段，并將結(jié)果整理成FASTA格式的文件，采用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST軟件進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，與擴(kuò)增產(chǎn)物序列同源性高的均為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.) β-D-葡萄糖苷酶基因。表明本發(fā)明所述PCR擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增枯草芽孢桿菌β -D-葡萄糖苷酶基因，具有較好的適用性。
[0013]基于此，本發(fā)明還提供所述PCR擴(kuò)增引物在制備檢測枯草芽孢桿菌β -D-葡萄糖苷酶基因試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述枯草芽孢桿菌分離自香草蘭。
[0014]同時，基于上述應(yīng)用，本發(fā)明提供一種檢測枯草芽孢桿菌β-D-葡萄糖苷酶基因的試劑盒，包括具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID Ν0:2所示核苷酸序列的下游引物。
[0015]作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括Taq酶、dNTP和PCR buffer。
[0016]此外，本發(fā)明還提供所述PCR擴(kuò)增引物在檢測枯草芽孢桿菌β -D-葡萄糖苷酶基因中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述枯草芽孢桿菌分離自香草蘭。
[0017]基于上述應(yīng)用，本發(fā)明提供一種檢測枯草芽孢桿菌β-D-葡萄糖苷酶基因的方法，用具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID Ν0:2所示核苷酸序列的下游引物對枯草芽孢桿菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0018]作為優(yōu)選，所述PCR擴(kuò)增體系為:
[0019]2.0 μ LlOXPCR buffer, 200 μ M dNTP，80nM 上游引物，80ηΜ 下游引物，1.0U Taqpolymerase及0.8 μ L枯草芽抱桿菌DNA。
[0020]作為優(yōu)選，所述枯草芽孢桿菌分離自香草蘭。 [0021]作為優(yōu)選，所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?
[0022]940C 3min ；
[0023]94°C 60s, 60-67°C 60s 或 54? 60s, 72°C 75s，共 30 個循環(huán)；
[0024]72O保持 IOmin。
[0025]本發(fā)明從香草蘭豆莢中分離出兩株經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的菌株一XY19與XY20，用本發(fā)明所述PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物均鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.) β-D-葡萄糖苷酶基因。
[0026]此外，本發(fā)明利用所述PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增芽孢桿菌屬解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株的DNA,瓊脂糖電泳無法檢測到擴(kuò)增條帶；同時,本發(fā)明采用現(xiàn)有的兩條(LUN-CHENG KUO 等 J.Agric.Food Chem.2008，56，119-125，序列見 SEQ ID NO: 3SEQ ID NO:4)用于檢測β -D-葡萄糖苷酶基因的引物對ΧΥ19與ΧΥ20的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖電泳無法檢測到擴(kuò)增條帶。
[0027]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的空白，在深入研究枯草芽孢桿菌β -D-葡萄糖苷酶的基礎(chǔ)上，提供了一對全新的PCR擴(kuò)增引物，能夠廣泛應(yīng)用到枯草芽孢桿菌β-D-葡萄糖苷酶基因的檢測以及檢測枯草芽孢桿菌β-D-葡萄糖苷酶基因試劑盒的制備中，特別是適合于分離自香草蘭的枯草芽孢桿菌，可以協(xié)助產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶菌株的篩選工作。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1所示為本發(fā)明所述擴(kuò)增引物擴(kuò)增菌株ΧΥ19和ΧΥ20的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為Maker，A為菌株XY19擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，B為XY20擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。
【具體實(shí)施方式】[0029]本發(fā)明公開了一種PCR擴(kuò)增引物及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述PCR擴(kuò)增引物已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0030]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0031]實(shí)施例1:從香草蘭中分離產(chǎn)β -D-葡萄糖苷酶的菌株
[0032]1、分離方法
[0033]取香草蘭豆莢熱水70°C殺青5min，殺青后豆莢50°C熱風(fēng)發(fā)汗25h，然后再經(jīng)室溫干燥I個月，最后室溫陳香半年即完成發(fā)酵處理。
[0034]取發(fā)酵完成的香草蘭豆莢置于無菌水中，充分震蕩后，將0.2mL混合液涂布于LB平板培養(yǎng)基(lL:10g NaCl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，15g瓊脂，pH為7.0)上，28°C培養(yǎng)24h后，固體平板上長出菌落。挑取單菌落經(jīng)3次劃線純化培養(yǎng)，獲取單一菌株。
[0035]分別將經(jīng)純化的菌株接種于含七葉苷和檸檬酸高鐵氨的LB固體培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基:IOg NaCl，IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，15g瓊脂，Ig七葉苷，2.5g檸檬酸高鐵氨，pH為
7.0)上28°C培養(yǎng)24h，挑取平板上產(chǎn)生黑色水解圈的菌落，命名為菌株XY19和XY20。
[0036]2、水解香蘭素葡萄糖苷的能力試驗(yàn)
[0037]配置以香蘭素葡萄糖苷為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(MM) =NH4NO3L 5g/L,K2HPO4L 5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCllg/L, pH7.0，其中香蘭素葡萄糖苷濃度為220mg/L。
[0038]將芽孢桿菌XY19和XY20分別接種于上述培養(yǎng)基中，28°C 170rpm搖床培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)基中香蘭素葡萄糖苷濃度均為0，被完全水解，同時培養(yǎng)基中檢測到香蘭素，表明所篩選的兩株菌株含有β -D-葡萄糖苷酶基因。
[0039]實(shí)施例2:分離菌株的鑒定
[0040]1、形態(tài)及生理生化檢測
[0041]分別檢測菌株ΧΥ19和ΧΥ20在LB平板上的生長情況、菌落形態(tài)與顏色、革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色等，方法參照沈萍主編的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第三版)》的方法進(jìn)行。所得菌株ΧΥ19和ΧΥ20在LB培養(yǎng)基平板上，菌落顏色均為不透明乳白色，圓形菌落邊緣整齊中間略微拱起。顯微觀察菌體為單細(xì)胞，桿狀。革蘭氏染色為陽性，芽孢橢圓或卵圓形。
[0042]檢測菌株ΧΥ19和ΧΥ20分別在不同溫度下、不同pH值條件下、不同NaCl濃度下進(jìn)行LB液體培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度最優(yōu)選擇為28-35°C;培養(yǎng)的pH值最優(yōu)選擇為5.0-7.0 ;培養(yǎng)的NaCl最優(yōu)濃度選擇為I %。
[0043]2、16S rDNA序列的測定
[0044]參照細(xì)菌基因組DNA提取方法(天根生化科技有限公司DP302-02)，用細(xì)菌16SrDNA通用引物A8-27f和B1523_1504r進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0045]25μ L 的反應(yīng)體系:2.5μ L10XPCR buffer, 200 μ M dNTP (each)，80nM A8_27f，80nM B1523-1504r, 1.25U Taq polymerase (Takara, Dalian, and PRC)和 IyL基因組DNA(approx.1Ong)。
[0046]PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件:94°C 3min ；94°C Imin，56°C Imin，72°C 2min,共 30 個循環(huán)；然后72°C保持lOmin。PCR產(chǎn)物委托華大基因有限公司進(jìn)行直接測序(XY19的16S rDNA序列參見SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列，XY20的16S rDNA序列參見SEQ ID NO:6所示核苷酸序列)。測得的序列用BLAST軟件進(jìn)行序列比對分析，并與GenBank中已知的16S rDNA進(jìn)行同源性比較。
[0047]檢測結(jié)果如下:
[0048]將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物在GenBank中(登錄號:KF986321，KF986322)進(jìn)行BLAST比對。結(jié)果表明，與菌株XY19和XY20同源性高的菌株均是芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，其同源性達(dá)99%以上，由此可推斷菌株XY19和XY20屬芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)。
[0049]采用多種生物學(xué)軟件對測得的序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用于系統(tǒng)發(fā)育分析的其它所有菌株序列及相關(guān)資料均來自GenBank數(shù)據(jù)庫。首先下載該數(shù)據(jù)庫中Bacillus屬與XY19和XY20親緣關(guān)系較近的種模式菌株序列，整理成FASTA格式的文件。根據(jù)用Clustalxl.81軟件進(jìn)行比對的結(jié)果，對所選擇出的序列長度進(jìn)行整理，使用于系統(tǒng)發(fā)育分析的序列長度基本一致。采用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0050]系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析顯示，菌株XY19和XY20與B.subtilis DSMlO聚為一支。16S rDNA序列同源性分析發(fā)現(xiàn)菌株XY19和XY20與B.subtilis DSMlO的序列相似性均為100%。
[0051]結(jié)合生理生化和16S rDNA分析結(jié)果，將菌株XY19和XY20鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
[0052]實(shí)施例 3:分離菌株DNA的擴(kuò)增和檢測
[0053]參照細(xì)菌基因組DNA提取方法(天根生化科技有限公司DP302-02)分別對菌株XY19和XY20進(jìn)行DNA提取，然后采用本發(fā)明所述PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Agarose gel進(jìn)行電泳分離后，DuGreen染色，UV下觀察,結(jié)果見圖1。
[0054]PCR擴(kuò)增體系為:
[0055]2.0 μ LlOXPCR buffer, 200 μ M dNTP，80nM 上游引物，80ηΜ 下游引物，1.0U Taqpolymerase 及 0.8 μ L 枯草芽抱桿菌 DNA (約 IOng)。
[0056]PCR擴(kuò)增程序?yàn)?
[0057]940C 3min ；
[0058]94°C 60s, 54°C 60s, 72°C 75s，共 30 個循環(huán)；
[0059]72?保持 IOmin。
[0060]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測產(chǎn)物濃度符合測序要求的樣品，委托華大基因有限公司進(jìn)行直接測序(XY19的擴(kuò)增產(chǎn)物序列參見SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列，XY20的擴(kuò)增產(chǎn)物序列參見SEQ ID N0:8所示核苷酸序列)。
[0061]將測序所得序列去除前端和末尾序列片段，并將結(jié)果整理成FASTA格式的文件，采用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST軟件進(jìn)行比對。結(jié)果表明，與擴(kuò)增產(chǎn)物序列同源性高的均為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.) β-D-葡萄糖苷酶基因。
[0062]實(shí)施例4:擴(kuò)增對比試驗(yàn)
[0063]以菌株ΧΥ19和ΧΥ20基因組DNA為模版，然后采用現(xiàn)有的兩條(LUN-CHENG KUO等 J.Agric.Food Chem.2008，56，119-125，序列見 SEQID NO: 3 和 SEQ ID NO:4)用于檢測β-D-葡萄糖苷酶基因的引物對XY19與XY20的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Agarosegel進(jìn)行電泳分離后，DuGreen染色，UV下觀察。[0064]同時，以芽孢桿菌屬解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株的DNA為模版，然后以本發(fā)明所述擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Agarose gel進(jìn)行電泳分離后，DuGreen染色，UV下觀察。
[0065]PCR擴(kuò)增體系為:
[0066]2.0 μ LlOXPCR buffer, 200 μ M dNTP，80nM 上游引物，80ηΜ 下游引物，1.0U Taqpolymerase 及 0.8 μ L 枯草芽抱桿菌 DNA (約 IOng)。
[0067]PCR擴(kuò)增程序?yàn)?
[0068]94°C 3min ；
[0069]94°C 60s, 60-67°C 60s 或 54? 60s, 72°C 120s，共 30 個循環(huán)；
[0070]72O保持 IOmin。
[0071]結(jié)果顯示，無論是哪一種對比試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測產(chǎn)物未能檢測到條帶，說明沒有擴(kuò)增出XY19、XY20的β-D-葡萄糖苷酶編碼基因。
[0072]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游引物組成。
2.權(quán)利要求1所述PCR擴(kuò)增引物在制備檢測枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)β -D-葡萄糖苷酶基因試劑盒中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌分離自香草蘭。
4.一種檢測枯草芽孢桿菌β-D-葡萄糖苷酶基因的試劑盒，其特征在于，包括具有SEQID NO:1所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，還包括Taq酶、dNTP和PCRbuffer。
6.權(quán)利要求1所述PCR擴(kuò)增引物在檢測枯草芽孢桿菌β-D-葡萄糖苷酶基因中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌分離自香草蘭。
8.—種檢測枯草芽孢桿菌β-D-葡萄糖苷酶基因的方法，其特征在于，用具有SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID Ν0:2所示核苷酸序列的下游引物對枯草芽孢桿菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增體系為: 2.0 μ LlO XPCR buffer, 200 μ M dNTP，80nM 上游引物，80nM 下游弓丨物，1.0U Taqpolymerase及0.8 μ L枯草芽抱桿菌DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌分離自香草蘭。
【文檔編號】C12Q1/68GK103923914SQ201410200539
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】谷風(fēng)林, 陳永敢, 王慶煌, 李積華, 賀書珍, 徐飛, 房一明, 譚樂和 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所