用于檢測傳染性胰臟壞死病毒的lamp引物組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測傳染性胰臟壞死病毒的LAMP引物組合物及其應(yīng)用，該LAMP引物組合物由序列為SEQ?ID?No.1所示的正向內(nèi)引物FIP、序列為SEQ?ID?No.2所示的反向內(nèi)引物BIP、序列為SEQ?ID?No.3所示的正向外引物F3、序列為SEQ?ID?No.4所示的反向外引物B3組成。本發(fā)明的LAMP引物組合物用于快速檢測樣品中的傳染性胰臟壞死病毒，對于傳染性胰臟壞死病毒具有良好的特異性和靈敏度，所需檢測儀器簡單，能夠快速、高效、準確檢測傳染性胰臟壞死病毒，適合口岸檢驗檢疫機構(gòu)和基層實驗室推廣。
【專利說明】用于檢測傳染性胰臟壞死病毒的LAMP引物組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及用于檢測傳染性胰臟壞死病毒的LAMP引物組合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]傳染性膜臟壞死病毒(Infectiouspancreatic necrosis virus,IPNV)是一種經(jīng)濟上非常重要的魚病病原體，在鮭科魚類中能夠引起及其嚴重的感染，導(dǎo)致高的死亡率。最初只在北美及歐洲的一些國家流行，近年來隨著水生動物進口貿(mào)易的增加，傳染性胰臟壞死病已傳入我國并在一些地區(qū)流行，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。目前，我國對該病病原IPNV的檢測方法主要有病毒分離與鑒定方法、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)方法、酶聯(lián)免疫吸附試驗方法等，這些檢測方法雖已達到準確的診斷，但是耗時長、成本高、儀器設(shè)備要求高，檢測步驟復(fù)雜，不能滿足快速、準確檢測該病毒的需求。因此，需要建立一種針對IPNV的快速、有效、準確且適合野外現(xiàn)場操作的方法，為我國的鮭鱒魚類養(yǎng)殖提供科學(xué)有效的疫病疫情預(yù)防思路。
[0003]LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)法是 2000 年由 Notomi 等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。該方法采用特異地識別靶序列上六個區(qū)域的四條引物(兩條外引物，兩條內(nèi)引物)及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在65°C左右進行核酸的指數(shù)級擴增，其擴增效率可達到IO9-1Oltl個拷貝數(shù)量級。整個反應(yīng)僅需I小時，在擴增反應(yīng)中副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀與鈣黃綠素結(jié)合，產(chǎn)生黃綠色熒光，不需要借助其他儀器便可辨別實驗結(jié)果。但目前該方法還沒有應(yīng)用于IPNV的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種用于快速、準確檢測傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)的LAMP引物組合物。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于該LAMP引物組合物的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0007]一種用于檢測傳染性胰臟壞死病毒的LAMP引物組合物，該引物組合物由序列為SEQ ID N0.1所示的正向內(nèi)引物FIP、序列為SEQ ID N0.2所示的反向內(nèi)引物BIP、序列為SEQ ID N0.3所示的正向外引物F3、序列為SEQ ID N0.4所示的反向外引物B3組成。
[0008]本發(fā)明還提供上述LAMP引物組合物在檢測傳染性胰臟壞死病毒中的應(yīng)用，包括以下步驟:
[0009](I)提取樣品中的RNA ；
[0010](2)以步驟⑴中提取的RNA為模板，進行RT-LAMP擴增反應(yīng)；
[0011 ] (3)對步驟(3)得到的RT-LAMP擴增產(chǎn)物進行檢測。
[0012] 在上述步驟⑵中，RT-LAMP擴增反應(yīng)條件為:60_65°C下反應(yīng)30_90分鐘，停止反應(yīng)；最為優(yōu)選的反應(yīng)條件為:62°C下反應(yīng)60分鐘，停止反應(yīng)。
[0013]在上述步驟(3)中LAMP擴增產(chǎn)物可以采用如下方法判定樣品中是否含有傳染性胰臟壞死病毒:①擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察，如果在遠離點樣孔出現(xiàn)梯狀條帶，則證明所檢測的病毒為傳染性胰臟壞死病毒，樣品中含有該病毒；②擴增產(chǎn)物中加入雙鏈DNA(dsDNA)染料PicoGreen顯色劑后觀察熒光顏色變化，如果反應(yīng)后的反應(yīng)液顯示綠色熒光，則證明所檢測的病毒為傳染性胰臟壞死病毒，樣品中含有該病毒；③從LAMP擴增反應(yīng)開始時刻即通過Loopamp池度儀檢測反應(yīng)液,至擴增反應(yīng)結(jié)束，觀察LAMP池度儀檢測圖，如果濁度逐漸增加，模塊的顏色由綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，則證明所檢測的病毒為傳染性胰臟壞死病毒，樣品中含有該病毒。
[0014]相對于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的LAMP引物組合物，可以快速檢測樣品中的傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)，該LAMP引物組合物只對IPNV進行特異性的擴增，與其他病毒并無交叉反應(yīng)，對IPNV的特異性和靈敏度較常規(guī)PCR方法高。利用本發(fā)明的LAMP引物組合物檢測IPNV，檢測時間短，對IPNV的特異性和靈敏度高，所需檢測儀器簡單，能夠快速、高效、準確檢測傳染性胰臟壞死病毒，適合口岸檢驗檢疫機構(gòu)和基層實驗室推廣。本發(fā)明的方法，為我國魚類能夠順利出口歐盟、美國等國家及地區(qū)奠定基礎(chǔ)，也為及時發(fā)現(xiàn)魚病疫情隱患， 提高疫情預(yù)警和防控能力提供理論依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為利用本發(fā)明LAMP組合物在不同溫度下進行的LAMP擴增反應(yīng)結(jié)果的瓊脂糖電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker，泳道1-6依次為反應(yīng)溫度60°C、61°C、62°C、63°C、64°C和65°C時的LAMP擴增結(jié)果。
[0016]圖2為利用本發(fā)明LAMP引物組合物在不同反應(yīng)時間下進行的LAMP擴增反應(yīng)結(jié)果的瓊脂糖電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker，泳道1_5依次分別為恒溫反應(yīng)30min、45min、60min、75min 和 90min 時的 LAMP 擴增結(jié)果。
[0017]圖3為利用本發(fā)明LAMP引物組合物進行的LAMP擴增反應(yīng)結(jié)果的檢測結(jié)果，其中圖3A是通過瓊脂糖凝膠電泳判讀的結(jié)果:在電泳圖中泳道M為DL2000Marker，泳道I和2分別為IPNV樣品和陰性對照；圖3B是通過檢測濁度變化判讀的結(jié)果:從LAMP擴增反應(yīng)開始時刻即通過Loopamp濁度儀檢測反應(yīng)液，至擴增反應(yīng)結(jié)束，圖3B中橫坐標I和2分別為IPNV樣品和陰性對照。
[0018]圖4為利用本發(fā)明LAMP引物組合物檢測IPNV的特異性分析的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker,泳道1-5依次分別為IPNV、IHNV、SVCV、IPNV和ISA的RT-LAMP的擴增產(chǎn)物，泳道6為陰性對照。
[0019]圖5為利用本發(fā)明LAMP引物組合物檢測IPNV的靈敏度分析的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker，泳道1_8依次分別為反應(yīng)體系中IPNV RNA含量1.0 μ g、
0.1 μ g、0.01 μ g、l.0ng、0.lng、0.01ng、0.01pg、0.0Olpg 時的擴增產(chǎn)物。
【具體實施方式】
[0020]下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所用試劑等均可從生物或化學(xué)試劑公司購買。
[0021 ] 實施例1本發(fā)明LAMP引物組合物的設(shè)計和合成
[0022]根據(jù)Genbank IPNV基因組中編碼A片段多聚蛋白的核苷酸序列(Genbank NO:AF342728.1),使用 Primer Explore V3 和 Primer Premier5.0 軟件針對其中的 6 個區(qū)域(3，端的F3c、F2c、Flc以及5，端的B1、B2、B3)設(shè)計LAMP引物，對不同引物組進行LAMP擴增實驗和檢測分析，最終篩選出擴增速率高、特異性好的一組LAMP引物，分別為正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，其序列如表1。引物由大連寶生物工程有限公司合成。
[0023]表1.IPNV RT-LAMP 檢測引物組
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測傳染性胰臟壞死病毒的LAMP引物組合物，其特征在于，該LAMP引物組合物由序列為SEQ ID N0.1所示的正向內(nèi)引物FIP、序列為SEQ ID N0.2所示的反向內(nèi)引物BIP、序列為SEQ ID N0.3所示的正向外引物F3、序列為SEQ ID N0.4所示的反向外引物B3組成。
2.權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物在檢測傳染性胰臟壞死病毒中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取樣品中的RNA； (2)以步驟(1)中提取的RNA為模板，進行RT-LAMP擴增反應(yīng)； (3)對步驟(2)得到的LAMP擴增產(chǎn)物進行檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟(2)中RT-LAMP擴增反應(yīng)條件為:60-65 °C下反 應(yīng)30-90分鐘，停止反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述RT-LAMP擴增反應(yīng)條件為:62°C下反應(yīng)60分鐘，停止反應(yīng)。
【文檔編號】C12N15/11GK103937912SQ201410201046
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】吳斌, 肇慧君, 張雪, 蔡曉萍 申請人:吳斌, 肇慧君, 張雪, 蔡曉萍