一種簡便高效的動物血液dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種簡便高效的動物血液DNA提取方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過稀釋液和裂解液Ⅰ很好的去除紅細(xì)胞，再通過裂解液Ⅱ和蛋白酶K破碎白細(xì)胞，并降解膜蛋白，核蛋白等蛋白質(zhì)，釋放基因組DNA。用乙酸銨中和蛋白質(zhì)所帶電荷，促進(jìn)蛋白沉淀，再通過無水乙醇沉淀DNA，75％乙醇洗滌沉淀后自然晾干，最后TE溶解保存。該方法操作簡單，所需試劑均為常規(guī)試劑，成本低，所得DNA質(zhì)量也比較好，適合于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大、中和小型規(guī)模的DNA提取或商業(yè)公司試劑盒的生產(chǎn)。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種簡便高效的動物血液DNA提取方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。 一種簡便高效的動物血液DNA提取方法

【背景技術(shù)】
[0002] DNA提取是分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)，涉及了基因克隆、基因序列分析、基因重組和 基因治療，以及遺傳育種等【技術(shù)領(lǐng)域】。血液DNA提取和純化的一般程序?yàn)椋浩扑榧t細(xì)胞、離 心沉淀白細(xì)胞、破碎白細(xì)胞、沉淀去蛋白、分離和純化DNA。經(jīng)典的血液DNA提取方法酚氯仿 抽提法。這種方法一般可以得到質(zhì)量和純化較好的能夠長時(shí)間保存的DNA，對滿足基本的小 規(guī)模分子實(shí)驗(yàn)工作需求已足夠，但是這種方法在實(shí)驗(yàn)過程所用到的苯酚、氯仿、異丙醇等試 劑對人體毒害較大。研究試驗(yàn)中，常用的除了酚氯仿抽提法，主要是用各種血液DNA抽提試 劑盒，這些DNA提取試劑盒往往價(jià)格不菲。目前許多科學(xué)研究和應(yīng)用，都受制于量大質(zhì)優(yōu)的 血液DNA提取技術(shù)的不足。所以一種低毒害、價(jià)格低廉、DNA提取效果好、而且能按照樣本 量的多少隨意設(shè)定DNA的提取規(guī)模的血液DNA提取方法有很大的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值，能 有效提高后續(xù)工作的效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種簡便、價(jià)格低廉、高效的動物血液DNA提 取方法。
[0004] 所述方法的具體步驟為：
[0005] (1)血液稀釋：在lmL全血樣本中加入稀釋液，血液與稀釋液的體積比為1 :5,顛 倒混勻；
[0006] (2)去除紅細(xì)胞：在上述溶液中加入與血液體積相同的甲醇-乙酸混合液（裂解 液I )，顛倒混勻，4000rpm離心5分鐘，棄上清，得到殘留細(xì)胞團(tuán)；向細(xì)胞團(tuán)中加入5倍血 液體積的甲醇-乙酸混合液，吹散混勻，3000rpm離心5分鐘，棄上清，重復(fù)加入5倍血液體 積的甲醇-乙酸混合液、吹散混勻離心棄上清2-3次，直至上清液變無色；
[0007] (3)裂解白細(xì)胞沉淀蛋白：將得到的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入1. 5ml微量離心管中，加入適量 的雙蒸水混勻，5000rpm離心5分鐘，棄上清，加入細(xì)胞裂解液（裂解液II )0· 4ml、10 μ 1濃 度為20mg/ml的蛋白酶Κ，56°C孵育3小時(shí)；再加入100 μ 18Μ的乙酸銨混勻，8000rpm離心 15min ；
[0008] (4)分離純化DNA :吸取0. 4ml上清液，加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，輕輕混 勻，待出現(xiàn)絮狀沉淀后，12000rpm離心15min，棄上清；再加入lml70 %乙醇洗漆沉淀， 12000rpm，離心15min，棄上清；干燥沉淀5-10min，加入30-50 μ 1TE溶解DNA。
[0009] 所述的離心與操作步驟均在室溫下進(jìn)行。
[0010] 所述稀釋液為0.068Μ的KC1溶液。
[0011] 所述甲醇-乙酸混合液是由甲醇與乙酸等體積混合。
[0012] 所述細(xì)胞裂解液成分為：0. 01Μ Tris-HCl、lmM EDTA、1% SDS(m/v)的混合液。
[0013] 本發(fā)明提供的方法步驟簡單，所需試劑均為常規(guī)試劑，價(jià)格低廉。此外，操作過程 對設(shè)備要求低，操作簡單，對操作人員要求較低，也在很大程度上避免了使用酚、氯仿等毒 性較高試劑對操作人員的傷害；采用本方法提取的DNA濃度和質(zhì)量都很好，可直接用于PCR 和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1貉血液DNA提取過程中無水乙醇沉淀。
[0015] 圖2貉血液DNA提取及PCR結(jié)果，Lanel，2為貉基因組；Lane3和Lane6都是 DL-2000 ;Lane4, 5, 7-15是不同引物的PCR結(jié)果。
[0016] 圖3通過國產(chǎn)某DNA試劑盒和傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取貉血液DNA，Lanel是酚-氯 仿法；Lane2是DL-2000Marker ;Lane3是國產(chǎn)某試劑盒。
[0017] 圖4銀狐血液DNA提取，Lanel和Lane2都是銀狐基因組，Lane2上樣量減半。
[0018] 圖5銀狐不同基因的PCR結(jié)果，Lane7, 14, 21是：DL-2000Marker ;其余孔道是不同 基因引物的梯度PCR結(jié)果。
[0019] 圖6通過國產(chǎn)某DNA試劑盒和傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取銀狐血液DNA，Lanel是國產(chǎn) 試劑盒提取結(jié)果；Lane2是傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取法。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實(shí)施例用于說明目的而非用于限制本 發(fā)明范圍。
[0021] 材料和試劑：
[0022] 稀釋液：0· 068M KC1
[0023] 裂解液 I :V_ :Viig= 1 :1
[0024] 裂解液 Π :0· 01M Tris-HCl
[0025] ImM EDTA
[0026] 1% (m/v)SDS
[0027] 無水乙醇，8M乙酸銨。
[0028] 配制制劑的水均為ddH20 ;所用的槍頭和EP管也均經(jīng)高壓滅菌。
[0029] 實(shí)施例1貉基因組DNA的提取
[0030] 1、取lmL貉血液放入10ml離心管中，加入稀釋液5ml，混勻，靜置片刻；
[0031] 2、向稀釋后的血液中加入1ml裂解液I，混勻，4000rpm離心5min，棄上清；
[0032] 3、加入5ml裂解液I，混勻，3000rpm離心5min，棄上清；可重復(fù)此步驟1-2次，直 至上清液變無色；
[0033] 4、將步驟3所得到的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入1. 5ml微量離心管中，加入ddH20混勻，5000rpm， 離心5分鐘，棄上清；
[0034] 5、加入0. 4ml裂解液II、10 μ 1濃度為20mg/ml的蛋白酶K，56°C孵育3小時(shí)；
[0035] 6、在步驟5所得溶液中加入100μ 18M的乙酸銨混勻，8000rpm，離心lOmin ;
[0036] 7、取步驟6所得溶液的上清液0. 4ml，置于新的1. 5ml微量離心管中，再加入 0. 8ml無水乙醇，輕輕顛倒混勻；
[0037] 8、在室溫下放置5-10min，待出現(xiàn)絮狀沉淀時(shí)，12000rpm，離心15min，棄上清液；
[0038] 9、加入lmUO%乙醇洗漆沉淀，12000rpm、離心15mi，棄上清；
[0039] 10、干燥沉淀 5-10min，加入 30-50 μ 1TE 溶解 DNA。
[0040] 結(jié)果：以此貉血液提取基因組DNA，在無水乙醇沉淀時(shí)，可見明顯的絮狀沉淀，如 圖1所示。所得基因組DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，完整性好，如圖2所示。經(jīng)過 核酸定量儀的測定，終濃度約〇. 2yg/y 1，0D260/280在1.7到1.9之間。提取的DNA經(jīng) PCR擴(kuò)增得到所需目的條帶，如圖2所示。
[0041] 本樣品同時(shí)采用了國內(nèi)某廠家的試劑盒和傳統(tǒng)的酚-氯仿提取法。結(jié)果如圖3所 示，采用試劑盒提取的DNA容易降解，產(chǎn)生彌散帶；而采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取DNA，殘留 的蛋白量多，提取的DNA量較少。
[0042] 實(shí)施例2銀狐基因組DNA的提取
[0043] 1、取lmL銀狐血液放入10ml離心管中，加入稀釋液5ml，混勻，靜置片刻；
[0044] 2、向稀釋后的血液中加入1ml裂解液I，混勻，4000rpm離心5min，棄上清；
[0045] 3、加入5ml裂解液I ,混勻，3000rpm離心5min，棄上清；可重復(fù)此步驟1-2次，直 至上清液變無色；
[0046] 4、將步驟3所得到的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入1. 5ml微量離心管中，加入ddH20混勻，5000rpm， 離心5分鐘，棄上清；
[0047] 5、加入0.41111裂解液11、1(^1濃度為2〇11^/1111的蛋白酶1(，561：孵育3小時(shí) ；
[0048] 6、在步驟5所得溶液中加入ΙΟΟμ 18M的乙酸銨混勻，8000rpm，離心lOmin ;
[0049] 7、取步驟6所得溶液的上清液0. 4ml，置于新的1. 5ml微量離心管中，再加入 0. 8ml無水乙醇，輕輕顛倒混勻；
[0050] 8、在室溫下放置5-10min，待出現(xiàn)絮狀沉淀時(shí)，12000rpm，離心15min，棄上清液；
[0051] 9、加入lmUO%乙醇洗漆沉淀，12000rpm、離心15mi，棄上清；
[0052] 10、干燥沉淀 5-10min，加入 30-50 μ 1TE 溶解 DNA。
[0053] 結(jié)果：此以銀狐血液提取基因組DNA，所得基因組DNA經(jīng)0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳 檢測，完整性好，如圖4所示。經(jīng)過核酸定量儀的測定，終濃度約0. 1μ g/μ l，0D260/280在 1. 7到1. 9之間。提取的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增得到所需目的條帶，如圖5所示。
[0054] 本樣品同時(shí)采用了國內(nèi)某廠家的試劑盒和傳統(tǒng)的酚-氯仿提取法。結(jié)果如圖6所 示，采用試劑盒提取的DNA發(fā)生降解，易產(chǎn)生彌散帶；而采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取DNA，殘 留的蛋白量多，提取的DNA量較少。
【權(quán)利要求】
1. 一種簡便高效的動物血液DNA提取方法，其特征在于， (1) 血液稀釋：在lmL全血樣本中加入稀釋液，血液與稀釋液的體積比為1 :5,顛倒混 勻； (2) 去除紅細(xì)胞：向上述溶液中加入與血液體積相同的甲醇-乙酸混合液，顛倒混勻， 離心棄上清，得到殘留細(xì)胞團(tuán)；向細(xì)胞團(tuán)中加入5倍血液體積的甲醇-乙酸混合液，吹散混 勻，離心棄上清，重復(fù)2-3次，直至上清液變無色； (3) 裂解白細(xì)胞沉淀蛋白：將得到的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入1. 5ml微量離心管中，加入適量的雙 蒸水混勻，離心棄上清，加入細(xì)胞裂解液〇.4πι1、1〇μ 1濃度為20mg/ml的蛋白酶K，56°C孵 育3小時(shí)；再加入ΙΟΟμ 18M的乙酸銨混勻、離心；所述細(xì)胞裂解液是0. 01M Tris-HCl、lmM EDTA、1% SDS的混合液； (4) 分離純化DNA :用無水乙醇沉淀DNA，并用70%乙醇洗滌沉淀。
2. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟（1)所述稀釋液為0. 068M的KC1 溶液。
3. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟（2)所述甲醇與乙酸混合液中甲醇 與乙酸的體積比為1 :1。
4. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟（4)分離純化DNA是吸取 0. 4ml上清液，加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，輕輕混勻，待出現(xiàn)絮狀沉淀后，離心棄上清； 再加入lml70 %乙醇洗滌沉淀，離心棄上清；干燥沉淀，加入30-50 μ 1 TE溶解DNA。
【文檔編號】C12N15/10GK104109663SQ201410201162
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】楊福合, 鮑加榮, 王桂武, 王雷, 劉宗岳 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所