對綠盲蝽進(jìn)行rna干擾的注射方法及其在基因篩選上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及對綠盲蝽進(jìn)行RNA干擾的注射方法及其在基因篩選上的應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。一種對綠盲蝽進(jìn)行RNA干擾的注射方法，其特征在于：注入dsRNA的注射位置為后胸與腹部節(jié)間膜的最外側(cè)。首次建立了用于綠盲蝽基因功能研究的RNAi平臺；創(chuàng)造性采用注射法對綠盲蝽進(jìn)行RNAi時的最佳注射位置和特定dsRNA濃度下的最佳注射體積進(jìn)行確定，檢測并記錄注射后綠盲蝽表現(xiàn)型的改變。該方法為篩選新的抗蟲基因提供新的技術(shù)手段和平臺，為發(fā)展抗綠盲蝽轉(zhuǎn)基因作物提供新的基因資源進(jìn)而依此達(dá)到發(fā)展經(jīng)濟有效，環(huán)境友好的新的方法來控制綠盲蝽的危害。
【專利說明】對綠盲蝽進(jìn)行RNA干擾的注射方法及其在基因篩選上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及對綠盲蝽進(jìn)行RNAi的注射方法以及利用該方法在篩選綠盲蝽生長發(fā)育關(guān)鍵基因上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著Bt棉花的大面積種植，棉鈴蟲的為害得到了有效地控制，然而綠盲蝽逐漸成為為害我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，尤其是棉田的重要害蟲，發(fā)生面積占種植面積的90%左右，嚴(yán)重威脅棉花生產(chǎn)，導(dǎo)致棉花產(chǎn)量損失10%~20%。此外，綠盲蝽在為害棉花的同時，還影響棗、桃、櫻桃、蘋果和葡萄等農(nóng)作物的生產(chǎn)。目前，對綠盲蝽的防治措施主要依靠化學(xué)防治。然而，長期大量使用農(nóng)藥進(jìn)行害蟲防治不僅會殺傷天敵、降低田間作物的自然調(diào)節(jié)能力、對自然環(huán)境造成污染、破壞生態(tài)平衡，而且長此以往，會增加綠盲蝽對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的風(fēng)險。因此，開發(fā)一條經(jīng)濟有效、環(huán)境友好的綠色防治途徑來控制綠盲蝽的危害成為當(dāng)前迫在眉睫的重要任務(wù)之一。
[0003]RNA干擾(RNAi)技術(shù)是當(dāng)今研究基因功能以及健康有效防治害蟲的一個重要手段和研究熱點。利用注射的方法進(jìn)行RNAi實驗用以篩選昆蟲生長發(fā)育關(guān)鍵基因，在此基礎(chǔ)上發(fā)展有效的抗蟲轉(zhuǎn)基因作物，可以為害蟲防治提供一條新的可行途徑。RNAi是由雙鏈RNA引發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其作用機制是通過誘發(fā)對同源mRNA的高效特異性降解來干擾目標(biāo)基因的表達(dá)。當(dāng)與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞時，其被降解成21-23bp長度的小分子 RNA 即 siRNA,RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-1nduced silencing complex, RISC)結(jié)合siRNA并將其解旋成單鏈，引導(dǎo)單鏈SiRNA根據(jù)堿基互補配對原則特異性地結(jié)合同源mRNA (靶標(biāo))，使mRNA發(fā)生斷裂而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。
[0004]RNAi是基因功能研究的一個革命性的發(fā)現(xiàn)，它極大的擴展了基因研究的思路和方法。從發(fā)現(xiàn)至今，RNAi技術(shù)在人類醫(yī)學(xué)，基因工程以及農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域得以應(yīng)用，并取得了很多突破。在醫(yī)學(xué)方面，此技術(shù)已被用于臨床疾病治療，如老年視黃斑退化、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肥胖癥等。在農(nóng)業(yè)害蟲防治領(lǐng)域，2007年Baum等人在鞘翅目昆蟲西方玉米根蟲(WCR)中利用RNAi技術(shù)沉默290個基因后，發(fā)現(xiàn)其中125個基因有明顯致死效果。至今為止，RNAi技術(shù)主要在雙翅目、膜翅目、同翅目、鞘翅目、等翅目、鱗翅目和直翅目7個目中的15種昆蟲中得到成功應(yīng)用。由于RNAi現(xiàn)象在昆蟲綱中是存在的，某些基因RNAi沉默后能夠?qū)е吕ハx的死亡，所以如果能夠利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)出特異的dsRNA，讓昆蟲在取食過程中攝入，對某些農(nóng)業(yè)害蟲的生長發(fā)育進(jìn)行控制，從而能夠?qū)⑦@種RNAi介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物發(fā)展成一種害蟲控制的新策略，為有效控制和防治農(nóng)業(yè)害蟲提供一條可行的途徑和良好的前景。
[0005]然而，由于利用RNAi技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物，周期長，成本高，不能實現(xiàn)從大量基因中篩選功能基因，所以在成功發(fā)展轉(zhuǎn)基因植物之前能夠?qū)ふ壹冉?jīng)濟又簡單快捷的方法篩選鑒定大量基因從而找到候選基因顯得尤為重要。[0006]同時，有關(guān)半翅目昆蟲RNAi實驗的報道中，尚未有任何關(guān)于綠盲蝽抗蟲基因及綠盲蝽RNAi的實驗報告。因此，從綠盲蝽的大量基因中篩選鑒定對其生長發(fā)育起關(guān)鍵作用并在RNAi后能夠影響其生長并導(dǎo)致死亡的基因，可以為接下來利用RNAi發(fā)展轉(zhuǎn)基因植物，用以防治當(dāng)前棉花重要害蟲綠盲蝽提供重要的依據(jù)和基礎(chǔ)，從而降低殺蟲藥劑使用量以及綠盲蝽抗藥性的產(chǎn)生，避免新的生態(tài)問題產(chǎn)生，具有重要的經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益。
[0007]雖然目前已經(jīng)有關(guān)于，但是在技術(shù)方案之前，向綠盲蝽導(dǎo)入dsRNA能否引發(fā)RNAi效果并產(chǎn)生致死表型不得而知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供一種對綠盲蝽進(jìn)行RNAi實驗的注射方法，對綠盲蝽進(jìn)行RNAi實驗的注射參數(shù)(包括注射位置、注射體積，注射dsRNA總量)進(jìn)行確定，并挑選了綠盲蝽持家基因β -actin驗證綠盲蝽導(dǎo)入dsRNA能否引發(fā)RNAi效果并產(chǎn)生致死表型，結(jié)果表明導(dǎo)入β-actin基因dsRNA可以導(dǎo)致綠盲蝽生長發(fā)育受到嚴(yán)重不利的影響，甚至死亡的結(jié)論。該方法為篩選新的抗蟲基因提供新的技術(shù)手段和平臺，為發(fā)展抗綠盲蝽轉(zhuǎn)基因作物提供新的基因資源進(jìn)而依此達(dá)到發(fā)展經(jīng)濟有效，環(huán)境友好的新的方法來控制綠盲蝽的危害。
[0009]對綠盲蝽進(jìn)行RNAi實驗的注射方法，其特征在于:注射位置為后胸與腹部節(jié)間膜的最外側(cè)。
[0010]所述用于注射的dsRNA濃度為10 μ g/ μ 1，注射體積為41.4nl。
[0011]所述綠盲蝽為3L若 蟲。
[0012]一種建立綠盲蝽生長發(fā)育關(guān)鍵基因的篩選方法，包括如下步驟:(I)取綠盲蝽總RNA,通過RT-PCR得到cDNA ； (2)選定目標(biāo)基因一段特異性片段，設(shè)計帶有T7序列的特異性引物；(3)通過PCR技術(shù)擴增目的基因片段:以第一步得到的cDNA為模板，第二步設(shè)計的特異引物擴增，得到帶有T7序列和目的基因片段的PCR產(chǎn)物；(4)構(gòu)建含有選定目的基因片段的載體:將目的基因片段用T4DNA連接酶插入載體PGM-T中，轉(zhuǎn)入宿主大腸桿菌中，富集培養(yǎng)，提取含有目的基因片段的質(zhì)粒；(5)以上一步所提取含有目的基因片段的質(zhì)粒為模板，第二步設(shè)計的特異性引物擴增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR產(chǎn)物；(6)利用T7RNA聚合酶將上一步得到的PCR產(chǎn)物合成為目的基因片段dsRNA ; (7)將dsRNA按上述注射方法導(dǎo)入綠盲蝽的體內(nèi)，持續(xù)飼養(yǎng)記錄若蟲經(jīng)RNAi后的表現(xiàn)型；(8)統(tǒng)計死亡率，確認(rèn)該目的基因與生長發(fā)育的關(guān)系。
[0013]所述特異性片段為400_500bp。
[0014]所述目的基因為綠盲蝽β -actin基因，其序列如SEQ ID NOl所示。
[0015]所述綠盲蝽β -actin基因的特異性片段序列如SED ID N04所示。
[0016]所述步驟(7)的同時，將GFP基因的dsRNA作為對照組注射入綠盲蝽體內(nèi)，所述GFP基因序列如SEQ ID N02所示。
[0017]所述GFP基因的特異性片段序列如SEQ ID N03所示。
[0018]所述持續(xù)飼養(yǎng)時間為5-10天。
[0019]本發(fā)明用注射法對綠盲蝽進(jìn)行RNAi實驗的注射參數(shù)(包括注射位置、注射體積，注射dsRNA總量)進(jìn)行確定，并挑選了綠盲蝽持家基因β -actin驗證綠盲蝽導(dǎo)入dsRNA能否引發(fā)RNAi效果并產(chǎn)生致死表型，結(jié)果表明導(dǎo)入β-actin基因dsRNA可以導(dǎo)致綠盲蝽生長發(fā)育受到嚴(yán)重不利的影響，甚至死亡的結(jié)論。
[0020]本發(fā)明首次建立了用于綠盲蝽基因功能研究的RNAi平臺；同時利用建立的RNAi平臺篩選得到了持家基因、能量代謝相關(guān)基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因等多個與綠盲蝽生長發(fā)育密切相關(guān)的基因。本研究為篩選新的抗蟲基因提供了新的技術(shù)手段和平臺，為發(fā)展抗綠盲蝽轉(zhuǎn)基因作物提供了新的基因資源。實踐表明，發(fā)展轉(zhuǎn)基因抗蟲作物能有效地控制害蟲危害，RNAi是由雙鏈RNA引發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其作用機制是通過阻止同源基因的翻譯或者轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)基因沉默。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1 3齡綠盲蝽的注射位置
[0022]其中:1:前胸和中胸的節(jié)間膜 [0023]I1:后胸與腹部節(jié)間膜的最外側(cè)
[0024]II1:腹部第2和第3節(jié)間膜最外側(cè)
[0025]圖2注射dsGFP與注射ds β -actin綠盲蝽7天內(nèi)生存率。
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。下面涉及到的化學(xué)試劑均為市
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[0027]1、綠盲蝽總RNA的提取
[0028]綠盲蝽總RNA提取的過程在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行(離心除外)，以避免RNA酶(RNase)污染降解RNA。整個提取步驟如下所示:
[0029]1.取3-5頭經(jīng)過72小時饑餓處理的綠盲蝽，加入經(jīng)液氮冷卻的玻璃勻漿器中，立即向勻漿器內(nèi)加入1ml RNA提取試劑(Trizol)，將組織磨碎；將研磨好的組織溶液倒入
1.5ml無RNA酶的離心管中，置于冰上；
[0030]2.40C，12000g離心15min，將上清液體轉(zhuǎn)移到新的1.5ml無RNA酶離心管中；
[0031]3.將上清在室溫下放置5min后，向離心管中加入200 μ I氯仿，用手劇烈震蕩15s，再室溫靜置2-3min ；
[0032]4.4°C，12000g離心15min，混合物在此時分層，下層為有機相，上層為水相(RNA在水相中);將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5ml無RNA酶離心管中，向離心管中加入500 μ I異丙醇，室溫靜置IOmin ；
[0033]5.4°C，12000g離心10min后，棄掉上清(盡量吸凈)，向離心管中加入lml75%的乙醇(用無RNA酶的H2O配置，現(xiàn)用現(xiàn)配)，震蕩離心管以洗滌沉淀；
[0034]6.4°C，7500g離心10min后，棄掉上清(盡量吸凈)，在超凈工作臺中干燥5-10min ；
[0035]7.加入20 μ I無RNA酶的H2O,震蕩離心，使沉淀充分溶解；
[0036]8.60°C溫育IOmin后，取I μ I樣品稀釋至5μ1,其中2.5μ1進(jìn)行電泳檢測，
2.5μ I用濃度測量儀器(NanoDiOP)檢測濃度；如果凝膠電泳檢測結(jié)果合格且樣品OD值如下:
[0037]260/280:1.80 ~2.00[0038]260/230:1.80 ~2.00
[0039]則說明RNA質(zhì)量良好，存于_80°C備用。
[0040]2、第I鏈cDNA的合成
[0041]整個反轉(zhuǎn)錄過程盡量保證在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，操作步驟按第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行，具體操作如下:
[0042]1.在新的1.5ml無RNA酶離心管中加入2 μ g RNA (根據(jù)濃度測量的結(jié)果計算需加入RNA的體積數(shù))，再加入I μ I引物(oligo-dT)，用無RNA酶的H2O補至12 μ I ;
[0043]2.65°C溫育5min,之后馬上置于冰上；
[0044]3.在離心管中分別加入下列試劑，使體系達(dá)到20μ 1:4μ I的5Χ反應(yīng)緩沖液；2 μ I的dNTP混合物(IOmM) ；1μ I的反轉(zhuǎn)錄酶和I μ I的RNA酶抑制劑；簡單混勻后，離心片刻；
[0045]4.42°C溫育lh，然后再70°C溫育5min ;合成后存于_20°C冰箱,使用前稀釋10倍。
[0046]3、靶標(biāo)基因的克隆
[0047]本發(fā)明選取了持家基因、能量代謝相關(guān)基因和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因上的基因片段，通過注射法研究其對昆蟲的影響，GFP基因上的片段作為對照。持家基因又稱管家基因，是指所有細(xì)胞中均要表達(dá)的一類基因，其產(chǎn)物是對維持細(xì)胞基本生命活動所必需的；而能量代謝相關(guān)基因和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因也在綠盲蝽生長發(fā)育和生理過程中起著非常重要的作用。本發(fā)明選取此類基因上的片段，利用注射法進(jìn)行RNAi將其沉默，研究觀察沉默該基因后，對綠盲蝽個體發(fā)育造成的影響。GFP即綠色熒光蛋白，在昆蟲體內(nèi)并不存在，故大量研究中將其作為對照基因合成dsRNA。
[0048]1.靶標(biāo)基因引物的設(shè)計:
[0049](I)利用BLAST檢索數(shù)據(jù)庫，搜索綠盲蝽的相近物種同一靶標(biāo)基因的蛋白或者cDNA編碼的氨基酸序列，用綠盲蝽成蟲若蟲轉(zhuǎn)錄組組建的本地BLAST庫進(jìn)行比對查詢，確定所選基因的序列。
[0050](2)根據(jù)祀標(biāo)基因的片段,用Primer Premier5.0軟件設(shè)計帶T7啟動子的引物，弓丨物設(shè)計原則如下:
[0051]a.引物設(shè)計的區(qū)間要在靶標(biāo)基因的編碼區(qū)，中間片段大小在400~500bp左右。[0052]b.中間片段盡量選在靶標(biāo)基因的特異區(qū)域。
[0053]c.引物之間不能形成引物二聚體，交叉二聚體。
[0054]2.根據(jù)以上引物設(shè)計原則設(shè)計引物后，送至華大基因進(jìn)行引物合成。
[0055]3.相關(guān)靶標(biāo)基因的引物序列見表1-1。
[0056]表1.實驗所用引物
[0057]
【權(quán)利要求】
1.對綠盲蝽進(jìn)行RNAi實驗的注射方法，其特征在于:注入dsRNA的注射位置為后胸與腹部節(jié)間膜的最外側(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射方法,其中用于注射的dsRNA濃度為10μg/μ 1，注射體積為 41.4nl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的注射方法，所述綠盲蝽為3L若蟲。
4.一種建立綠盲蝽生長發(fā)育關(guān)鍵基因的篩選方法，包括如下步驟:(I)取綠盲蝽總RNA,通過RT-PCR得到cDNA ； (2)選定目標(biāo)基因一段特異性片段，設(shè)計帶有T7序列的特異性引物；(3)通過PCR技術(shù)擴增目的基因片段:以第一步得到的cDNA為模板，第二步設(shè)計的特異引物擴增，得到帶有T7序列和目的基因片段的PCR產(chǎn)物；(4)構(gòu)建含有選定目的基因片段的載體:將目的基因片段用T4DNA連接酶插入載體PGM-T中，轉(zhuǎn)入宿主大腸桿菌中，富集培養(yǎng)，提取含有目的基因片段的質(zhì)粒；(5)以上一步所提取含有目的基因片段的質(zhì)粒為模板，第二步設(shè)計的特異性引物擴增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR產(chǎn)物；(6)利用T7RNA聚合酶將上一步得到的PCR產(chǎn)物合成為目的基因片段dsRNA ； (7)將dsRNA按權(quán)利要求1-3任一所述的注射方法導(dǎo)入綠盲蝽的體內(nèi)，持續(xù)飼養(yǎng)記錄若蟲經(jīng)RNAi后的表現(xiàn)型；(8)統(tǒng)計死亡率，確認(rèn)該目的基因與生長發(fā)育的關(guān)系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，所述特異性片段為400-500bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，所述目的基因為綠盲蝽β-actin基因，其序列如SEQ ID NOl 所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6 所述的篩選方法，所述綠盲蝽β-actin基因的特異性片段序列如SED ID N04 所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，所述步驟(7)的同時，將GFP基因的dsRNA作為對照組注射入綠盲蝽體內(nèi)，所述GFP基因序列如SEQ ID N02所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的篩選方法，所述GFP基因的特異性片段序列如SEQID N03所/Jn ο
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，持續(xù)飼養(yǎng)時間為5-10天。
【文檔編號】C12Q1/68GK103993079SQ201410201539
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】王桂榮, 劉方舟, 楊婷, 劉楊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所