用于快速鑒定小麥主效抗病害基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于快速鑒定小麥主效抗病害基因的方法，包括下述步驟：1)利用小麥苗期分小種鑒定和抗病基因分子檢測篩查抗病基因的存在性；2)在步驟1的基礎上，結合小麥成株期抗病表型進行對比驗證。本發(fā)明公開的鑒定方法將小麥品種的宏觀表型和微觀檢測相結合，能夠有效確定小麥品種的抗病性。
【專利說明】用于快速鑒定小麥主效抗病害基因的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及小麥抗病害基因的準確鑒定，屬于生物育種和農(nóng)業(yè)生物學領域。
【背景技術】
[0002]小麥條銹病、白粉病等是常見的小麥病害，近年來各種常見小麥病害在我國的發(fā)生有不斷上升趨勢，成為影響我國小麥生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的限制因素。對于常見的小麥病害，種植抗病的小麥品種是控制最經(jīng)濟、有效和環(huán)保的方法。在這種情況下，小麥品種(系)抗病性水平和攜帶何種抗病基因，決定著其育種價值和生產(chǎn)利用價值，對小麥安全生產(chǎn)有著
重要影響。
[0003]因此，建立小麥品種(系)抗病害及其相關基因(例如抗條銹性及抗條銹基因)的規(guī)?；b定技術體系，快速地評價小麥品種(系)抗病害水平并準確分析其抗病基因型，不僅可以避免抗條銹基因資源的浪費，而且對有效評估新品系生產(chǎn)利用價值和開展抗病基因合理布局也具有重要意義。 [0004]目前，對小麥抗病害的鑒定主要包括如下幾種方法:
[0005]1.對小麥材料進行田間表型鑒定是當前最普遍的鑒定方法，這種方法可以直觀地發(fā)現(xiàn)小麥材料的農(nóng)藝性狀以及抗病性好壞，但客觀表型并不能反映抗病的本質屬性。
[0006]2.利用常規(guī)雜交分析的方法評價材料抗病性，該方法通常是將抗病材料與感病材料雜交后得到的Fl代、F2代、F3代以及回交的BCl代，菌系接種對其進行抗病性鑒定。這種常規(guī)雜交分析的方法盡管可以對小麥品系進行抗性分析，但遺傳分析研究的周期比較長，工作量繁瑣，在分析含有多基因的抗病材料時存在困難，其實際應用受到很大限制。
[0007]3.利用已知的病源菌系接種含有抗性基因的材料對小麥抗性基因進行快速的鑒定，基于植物一病原菌相互作用產(chǎn)生的表型推測雙方可能的基因型。此法用于抗性基因分析歸類，簡單快速，不受生長季節(jié)限制，能在短期內分析大量品種，但是基因表達受基因間互作、基因連鎖、遺傳背景和環(huán)境因素等方面的影響，容易出現(xiàn)推導誤差；在測試菌株選擇失誤時不能檢出小麥品種所具有的抗病基因。
[0008]4.利用與抗病基因緊密連鎖的分子標記進行抗病基因鑒定，在不受環(huán)境條件影響的情況下可快速確定待測品種是否含有特定抗病基因，對抗病基因進行精確定位，確定抗病基因在遺傳圖譜上的位置，但此種方式存在盲目性，由于DNA交換的存在，部分含有該抗病基因且抗性良好的材料卻檢測不到該基因片段。
[0009]因此，已有的方法在檢測小麥抗病害基因方面均存在一定的缺陷，本領域依舊存在快速準確檢測并對小麥抗病性進行評價的需要。

【發(fā)明內容】

[0010]針對現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明公開了一種用于快速鑒定小麥主效抗病害基因的方法，所公開的方法結合了傳統(tǒng)的表型鑒定和現(xiàn)代生物學中的分子標記，通過將二者結合，能夠克服表型鑒定時人為和環(huán)境影響導致的誤差，而且可以有效追蹤系譜來源，為小麥品種(系)的有效利用提供幫助，避免個別材料因農(nóng)藝性狀不佳而被淘汰所造成的抗性資源浪費。
[0011]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的:
[0012]用于快速鑒定小麥主效抗病害基因的方法，包括下述兩個階段:1)利用小麥苗期分小種鑒定和抗病基因分子檢測篩查抗病基因的存在性；2)在步驟I的基礎上，結合小麥成株期抗病表型進行對比驗證。
[0013]其中，上述所稱的小麥病害包括目前常見的小麥病害，包括但不限于條銹病、白粉病、赤霉病等，主要是針對條銹病，這是目前小麥生長過程中面臨的最普遍病害之一；因此，在本發(fā)明中，所述的小麥抗病害基因包括小麥抗條銹病基因、小麥抗白粉病基因或小麥抗赤霉病基因，主要針對的是小麥抗條銹病基因。
[0014]其中，所述小麥苗期分小種鑒定包括下述步驟:種植鑒別寄主對所選病害小麥小種進行鑒定；確認后將所選材料進行接種，以感病品種和已知的抗病害基因的單基因系為對照。接種后待感病對照充分發(fā)病時重復進行多次鑒定，并記載反應型。
[0015]通過對比 感病品種并參照已知的抗條銹病單基因系，通過苗期分小種鑒定，能夠用來確定和評價抗源抗病類型。
[0016]在上述方法中，對反應型的記載按照本領域常用的0-9級標準記載，本領域多年來已經(jīng)形成了成熟的主要小麥病害反應型記載標準，以0、1%、5%、10%、30%、60%、80%和100%八級標準記載嚴重度，具體細節(jié)可參考國家標準GB/T15795-1995的記載；同樣的，小麥白粉病、赤霉病的劃分也采用本領域公知的方案。
[0017]當檢測的對象是小麥抗條銹病基因品種的小麥時，采用的感病品種為銘賢169，已知抗條銹病基因為Yr5、Yr9、YrlO、Yrl5、Yrl7、Yrl8和Yr26的單基因系。
[0018]其中，所述抗病基因分子檢測是選用已知的用于檢測小麥抗病害基因的分子標記進行分子檢測，首先提取小麥幼葉的DNA，然后用分子標記進行PCR擴增；最后，跑膠，觀察分析得出結論。
[0019]當檢測的對象是小麥抗條銹病基因品種的小麥時，所用分子標記為Yr5、Yr9、YrlO、Yrl5、Yrl7、Yrl8、Yr26 等 7 個基因標記。
[0020]目前，本領域對這七個基因作為分子標記的使用已經(jīng)普遍掌握，對應的引物設計和使用也易于實現(xiàn)。
[0021]通過采用已知抗病基因分子標記檢測和抗譜比較，能夠檢測和分析抗源是否攜帶抗病新基因，為新的具有抗病害基因的小麥培育提供定量支持。
[0022]其中，小麥成株期抗病表型的驗證包括通過在田間對小麥進行人工接種統(tǒng)計發(fā)病表型的步驟和在小麥病害發(fā)生自然條件下進行成株期抗病害鑒定的步驟。
[0023]上述兩種方式的結果相結合能夠穩(wěn)定、準確、定性評價小麥品種的抗病害性能，尤其是在檢測小麥抗條銹病性能夠提供非常明確的檢測結果。
[0024]上述的人工接種是指在特定條件下種植多株小麥做為感病指不品種。以感病品種為誘發(fā)，然后接種小麥，并在合適的生長時間開始監(jiān)測相關病害的流行狀況，在盛發(fā)期記載各供試小麥品種頂三葉的抗病反應型和嚴重度。按0-9九級標準記載反應型(infectiontype, IT)，以 0、1%、5%、10%、30%、60%、80%和 100%八級標準記載嚴重度。
[0025]上述的小麥自然發(fā)病的田間鑒定是指在中國小麥條銹菌菌源易變區(qū)設置自然發(fā)病圃的鑒定工作，種植方式同上。待感病對照材料充分發(fā)病時，進行成株期抗條銹性鑒定，鑒定標準同上。
[0026]通過上述方案，本發(fā)明取得了如下技術進步:
[0027]1.利用苗期分小種鑒定和分子標記檢測有效追蹤系譜來源，為小麥品種(系)的有效利用提供幫助，既可以避免個別材料因農(nóng)藝性狀不佳而被淘汰所造成的抗性資源浪費，又為將來該材料的利用提供方便。
[0028]2.將微觀檢測與傳統(tǒng)的宏觀表征檢測相結合，廣泛適用于多種病害的抗性分析和評價。
[0029]3.采用分子標記輔助鑒定提高鑒定篩選效率，通過表型鑒定快速直觀地推測材料的抗性，二者有效結合，既彌補了表型鑒定的時候由于個人見解上的差異以及環(huán)境條件的影響所造成的誤差，也可以互相補充，從不同角度、不同層次進行全方位評價。這種基于現(xiàn)代生物技術手段與傳統(tǒng)表型分析手段相結合的快速評價體系可以在短時間內對要篩選的抗病害小麥品種(系)的取舍以正確指導。
【具體實施方式】
[0030]下面以小麥 條銹病為例，說明本發(fā)明的方法。
[0031]1.人工接種病圃設置與田間鑒定
[0032]在適宜地區(qū)設置已知條銹菌小種的混合鑒定圃，如陜西楊凌等地區(qū)。每份供試小麥品種材料種植兩行(行長100cm，行距25cm)，每隔20個品種種植兩行小偃22做為感病指不品種，以感病品種銘賢169為誘發(fā)打。
[0033]三月中旬在田間接種CYR32和CYR33混合小種(中國小麥條銹菌當前優(yōu)勢小種)，從五月份開始監(jiān)測條銹病流行狀況，在條銹病盛發(fā)期記載各供試小麥品種頂三葉的抗病反應型和嚴重度。按0-9九級標準記載反應型(infection type, IT),以O、I %、5 %、10 %、30%、60%、80%和100%八級標準記載嚴重度(表1)。
[0034]表1小麥條銹菌反應型0-9級標準
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【權利要求】
1.用于快速鑒定小麥主效抗病害基因的方法，其特征在于包括下述兩個階段:1)利用小麥苗期分小種鑒定和抗病基因分子檢測篩查抗病基因的存在性；2)在步驟I的基礎上，結合小麥成株期抗病表型進行對比驗證。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述小麥抗病害基因包括小麥抗條銹病基因、小麥抗白粉病基因或小麥抗赤霉病基因。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述小麥苗期分小種鑒定包括下述步驟:種植鑒別寄主對所選病害小麥小種進行鑒定；確認后將所選材料進行接種，以感病品種和已知的抗病害基因的單基因系為對照。接種后待感病對照充分發(fā)病時重復進行多次鑒定，并記載反應型。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述抗病基因分子檢測是選用已知的用于檢測小麥抗病害基因的分子標記進行分子檢測，首先提取小麥幼葉的DNA，然后用分子標記進行PCR擴增；最后，跑膠，觀察分析得出結論。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于小麥成株期抗病表型的驗證包括通過在田間對小麥進行人工接種統(tǒng)計發(fā)病表型的步驟和在小麥病害發(fā)生自然條件下進行成株期抗病害鑒定的步驟。
6.根據(jù)權利要求3所述的方法,其特征在于所述小麥抗病害基因為小麥抗條銹病基因，感病品種為銘賢169和已知抗條銹病基因為Yr5、Yr9、YrlO、Yrl5、Yrl7、Yrl8和Yr26的單基因系。
7.根據(jù)權利要求所述的方法，其特征在于所述小麥抗病害基因為小麥抗條銹病基因，所用分子標記為Yr5, Yr9, YrlO, Yrl5, Yrl7, Yrl8, Yr26等7個基因標記。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004834SQ201410202259
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權日:2014年5月14日
【發(fā)明者】韓德俊, 康振生, 薛文波, 王琪琳, 吳建輝, 許鑫, 穆京妹, 詹剛明, 王保通, 黃麗麗 申請人:西北農(nóng)林科技大學