一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法
【專利摘要】一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法，首先在培養(yǎng)皿中制作細(xì)胞生長附著物，然后在細(xì)胞生長附著物上面培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞來源細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞來源細(xì)胞。接著將生長有細(xì)胞的其中一種細(xì)胞生長附著物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)生長有另一種細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，使不同細(xì)胞面相互接觸，從而模擬早期胚胎植入時(shí)胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞與子宮內(nèi)膜細(xì)胞相互接觸，發(fā)生植入時(shí)的狀態(tài)。24小時(shí)后，將相互接觸的細(xì)胞生長附著物破碎，分別提純子宮內(nèi)膜細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞，分別用于分子生物學(xué)檢測。本發(fā)明解決了研究胚胎植入目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量少的瓶頸問題，為有效研究早期胚胎植入提供了方便有效的技術(shù)和工具。
【專利說明】一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明專利涉及一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法，該模型模擬胚胎植入子宮內(nèi)膜的早期過程，用于胚胎植入研究。
【背景技術(shù)】
[0002]近年，由于全球范圍內(nèi)不孕人群數(shù)量持續(xù)增加，使輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用不斷推廣、生殖醫(yī)學(xué)臨床的快速發(fā)展，但是臨床妊娠率提高并不明顯，這就對(duì)生殖醫(yī)學(xué)研究提出了新的要求。胚胎植入子宮內(nèi)膜是妊娠建立的關(guān)鍵步驟，因此胚胎植入子宮內(nèi)膜已經(jīng)成為生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。由于植入時(shí)與內(nèi)膜相互作用的胚胎細(xì)胞數(shù)量少、變化迅速，對(duì)植入相關(guān)生物分子進(jìn)行檢測困難，有關(guān)胚胎植入子宮內(nèi)膜的具體機(jī)制仍不清楚。因此，建立有效的體外胚胎植入子宮內(nèi)膜模型，方便地對(duì)目標(biāo)細(xì)胞中生物活性分子進(jìn)行檢測是研究胚胎植入子宮內(nèi)膜的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法，旨在應(yīng)用生物工程技術(shù)建立一種新型的體外胚胎植入模型，即胚胎植入子宮內(nèi)膜過程中滋養(yǎng)細(xì)胞與子宮內(nèi)膜細(xì)胞相互作用的模型，解決胚胎植入過程中胚胎來源細(xì)胞數(shù)量少，又無從有效分離的難題，為胚胎植入子宮內(nèi)膜的研究提供有效的方法和工具。
[0004]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法，包括以 下步驟:
(I)在培養(yǎng)皿A、B中制作兩個(gè)細(xì)胞生長附著物:將凝膠點(diǎn)為30度的瓊脂糖溶解在TAE緩沖液中，瓊脂糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5% ;溶解后將其鋪在兩個(gè)直徑為1cm的培養(yǎng)皿A、B中，凝膠厚度為0.5cm，在4°C下凝固，使用前置室溫復(fù)溫lh。
[0005](2)向培養(yǎng)皿A中加入5ml RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿B中加入8ml囊胚培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)基用于子宮內(nèi)膜培養(yǎng)；囊胚培養(yǎng)液用于滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，置入37°C，體積百分比濃度為5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)浸洗平衡3次,每次I個(gè)小時(shí)。
[0006](3)子宮內(nèi)膜蛻膜化處理:將分離純化的個(gè)數(shù)在5X 16的子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞或高分化子宮內(nèi)膜細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿A，加入含有β-雌二醇(E2)200pg/mL、孕酮(P)20ng/mL的、體積百分比為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液8ml進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行子宮內(nèi)膜分泌化培養(yǎng)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谄谏掀ぁ⒎蛛x純化的個(gè)數(shù)在5 X 16的滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿B進(jìn)行培養(yǎng)至滋養(yǎng)層細(xì)胞面積占整個(gè)培養(yǎng)皿面積50%-80%。
[0007](4)將長滿細(xì)胞的其中一種細(xì)胞生長附著物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)生長有另一種細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞面兩兩相扣，建立胚胎植入時(shí)的兩種細(xì)胞相互作用的狀態(tài)。
[0008](5) 24小時(shí)后將兩兩相扣的細(xì)胞生長附著物取出置于冰塊上，用PBS緩沖液洗滌后剪碎至直徑小于I mm的小塊(肉眼呈糊狀)。
[0009](6)加入D/F培養(yǎng)基洗滌I次后，依次通過100目(150興)和400目(38/flfl)篩網(wǎng)。
[0010](7) 400目篩網(wǎng)上主要為內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞或二者形成的細(xì)胞團(tuán)，翻轉(zhuǎn)篩網(wǎng)后，用D/F培養(yǎng)基沖洗，所有沖洗液合并后，1000r/min離心5 min。
[0011](8)用2 ml含體積百分比為0.0296EDTA和體積百分比為0.25%胰蛋白酶消化5_10min，使細(xì)胞團(tuán)分散成為單個(gè)細(xì)胞。立即加入2ml含體積百分比為10%胎牛血清的滋養(yǎng)層培養(yǎng)基終止消化，1000 r/min離心5 min后,應(yīng)用免疫磁珠法(已有專用技術(shù))分別分離子宮內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞，用于后續(xù)的分子生物學(xué)檢測。
[0012]本發(fā)明的有益效果在于:應(yīng)用瓊脂糖制作子宮內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞生長附著物，建立胚胎植入時(shí)的子宮內(nèi)膜面和胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞面，兩兩相互接觸建立胚胎植入時(shí)的細(xì)胞相互作用狀態(tài)，破碎后分別分離純化兩種細(xì)胞，用于早期胚胎植入研究，從而解決研究胚胎植入目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量少的瓶頸，為有效研究早期胚胎植入提供了方便有效的技術(shù)和工具。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0014]實(shí)施例1，一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法，包括以下步驟:
(I)在培養(yǎng)皿A、B中制作兩個(gè)細(xì)胞生長附著物:將凝膠點(diǎn)為30度的瓊脂糖溶解在TAE緩沖液中，瓊脂糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5% ;溶解后將其鋪在兩個(gè)直徑為1cm的培養(yǎng)皿A、B中，凝膠厚度為0.5cm，在4°C下凝固，使用前置室溫復(fù)溫lh。
[0015](2)向培養(yǎng) 皿A中加入5ml RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿B中加入8ml囊胚培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)基用于子宮內(nèi)膜培養(yǎng)；囊胚培養(yǎng)液用于滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，置入37°C，體積百分比濃度為5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)浸洗平衡3次,每次I個(gè)小時(shí)。
[0016](3)子宮內(nèi)膜蛻膜化處理:將分離純化的個(gè)數(shù)在5X 16的子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞或高分化子宮內(nèi)膜細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿A，加入含有β-雌二醇(E2)200pg/mL、孕酮(P)20ng/mL的、體積百分比為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液8ml進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行子宮內(nèi)膜分泌化培養(yǎng)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谄谏掀ぁ⒎蛛x純化的個(gè)數(shù)在5 X 16的滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿B進(jìn)行培養(yǎng)至滋養(yǎng)層細(xì)胞面積占整個(gè)培養(yǎng)皿面積50%-80%。
[0017](4)將長滿細(xì)胞的其中一種細(xì)胞生長附著物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)生長有另一種細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞面兩兩相扣，建立胚胎植入時(shí)的兩種細(xì)胞相互作用的狀態(tài)。
[0018](5) 24小時(shí)后將兩兩相扣的細(xì)胞生長附著物取出置于冰塊上，用PBS緩沖液洗滌后剪碎至直徑小于I mm的小塊(肉眼呈糊狀)。
[0019](6)加入D/F培養(yǎng)基洗滌I次后，依次通過100目(150辦)和400目(38,)篩網(wǎng)。
[0020](7) 400目篩網(wǎng)上主要為內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞或二者形成的細(xì)胞團(tuán)，翻轉(zhuǎn)篩網(wǎng)后，用D/F培養(yǎng)基沖洗，所有沖洗液合并后，1000r/min離心5 min。
[0021](8)用2 ml含體積百分比為0.0296EDTA和體積百分比為0.25%胰蛋白酶消化5_10min，使細(xì)胞團(tuán)分散成為單個(gè)細(xì)胞。立即加入2ml含體積百分比為10%胎牛血清的滋養(yǎng)層培養(yǎng)基終止消化，1000 r/min離心5 min后,應(yīng)用免疫磁珠法(已有專用技術(shù))分別分離子宮內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞，用于后續(xù)的分子生物學(xué)檢測。
【權(quán)利要求】
1.一種早期胚胎體外植入子宮內(nèi)膜模型的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)在培養(yǎng)皿A、B中加入瓊脂糖凝膠，制作細(xì)胞生長附著物:將凝膠點(diǎn)為30度的瓊脂糖溶解在TAE緩沖液中至瓊脂糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5% ;溶解后將溶液鋪在兩個(gè)直徑為1cm的培養(yǎng)皿A、B中，凝膠厚度均為0.5cm，在4°C下凝固，使用前置室溫復(fù)溫Ih ； (2)向培養(yǎng)皿A中加入5mlRPMI1640培養(yǎng)基，RPMI1640培養(yǎng)基用于子宮內(nèi)膜培養(yǎng)；向培養(yǎng)皿B中加入8ml囊胚培養(yǎng)液，囊胚培養(yǎng)液用于滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)；將培養(yǎng)皿A、B均置于37°C，CO2體積百分比濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)浸洗平衡3次，每次I個(gè)小時(shí)； (3)子宮內(nèi)膜蛻膜化處理:將分離純化的個(gè)數(shù)在5xl06的子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞或高分化子宮內(nèi)膜細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿A，加入含有β -雌二醇(E2) 200pg/mL、孕酮(P) 20ng/mL、體積百分比為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液8ml進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行子宮內(nèi)膜分泌化培養(yǎng)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谄谏掀?；將分離純化的個(gè)數(shù)在5xl06的滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿B進(jìn)行培養(yǎng)至滋養(yǎng)層細(xì)胞面積占整個(gè)培養(yǎng)皿面積50%-80% ； (4)將長滿細(xì)胞的其中一種細(xì)胞生長附著物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)生長有另一種細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞面兩兩相扣，建立胚胎植入時(shí)的兩種細(xì)胞相互作用的狀態(tài)； (5)24小時(shí)后將兩兩相扣的細(xì)胞生長附著物取出置于冰塊上，用PBS緩沖液洗滌后剪碎至直徑小于1_的小塊； (6)加入D/F培養(yǎng)基洗滌I次后，依次通過100目和400目篩網(wǎng)； (7)400目篩網(wǎng)上主要為內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞或二者形成的細(xì)胞團(tuán)，翻轉(zhuǎn)篩網(wǎng)后，用D/F培養(yǎng)基沖洗，所有沖洗液合并后，1000r/min離心5 min ； (8)用2ml含體積百分比為0.02% EDTA和體積百分比為0.25%胰蛋白酶消化5_10min，使細(xì)胞團(tuán)分散成為單個(gè)細(xì)胞；加入2ml含體積百分比為10%胎牛血清的滋養(yǎng)層培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心5min后，應(yīng)用免疫磁珠法分別分離子宮內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104031877SQ201410202543
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】楊靜, 盧永超, 黃荷鳳, 盛建中 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)