一種裂殖壺菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種裂殖壺菌及其應(yīng)用。裂殖壺菌，其分類命名為裂殖壺菌(Aurantiochytrium?sp)SD006，已于2013年10月21日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號(hào)為CGMCC?No.8383。所述裂殖壺菌應(yīng)用于制備二十二碳六烯酸中。本發(fā)明所得菌株生長速度快，發(fā)酵時(shí)間短。利用裂殖壺菌菌株高密度發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸。在上述發(fā)酵條件下，60-70小時(shí)即能獲得最大產(chǎn)量。經(jīng)70小時(shí)發(fā)酵后獲得生物量為180-200g/L，DHA產(chǎn)量為50-65g/L。
【專利說明】一種裂殖壺菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種裂殖壺菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid, DHA)是一種人體必需的多不飽和脂肪酸，必須從膳食中補(bǔ)充。DHA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜的重要結(jié)構(gòu)脂成分，具有健腦、提高記憶力和視力的功能，尤其是可以促進(jìn)胎兒和嬰幼兒腦細(xì)胞發(fā)育生長，提高青少年記憶力，防治老年性癡呆等等。傳統(tǒng)上，DHA主要來源于深海魚油，但由于受過度捕撈、環(huán)境污染、季節(jié)變化等的影響很大，逐漸被利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)所取代。在現(xiàn)階段，工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)DHA最
主要的菌種是一種海洋微生物-裂殖壺菌(Aurant1chytrium sp.),其總脂肪酸中DHA
含量高達(dá)40% -60%。2010年利用裂殖壺菌生產(chǎn)的DHA藻油已被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品。然而，目前限制其進(jìn)一步推廣的主要瓶頸是單位成本上的DHA產(chǎn)量較低。
[0003]目前國內(nèi)涉及裂殖壺菌菌種篩選及發(fā)酵制備DHA油脂的專利主要有二十篇，主要分為三方面內(nèi)容:(I)優(yōu)良菌種的選育。如專利CN 1264967 CXN 101892160 BXN 103602591A、CN 101575584 B、CN 102199541 B、CN 102899254 A、CN 102888348 A 以及 CN 102864111B，這些專利通過篩選、培養(yǎng)高生長速率和高DHA含量的裂殖壺菌菌株獲得到生物量最高為120-130g/L，DHA產(chǎn)量最高為25_35g/L ; (2)培養(yǎng)基配方的優(yōu)化。主要包括的專利有:CN 101993824 A、CN 101831387 B、CN 101886044A、CN 101914581 B 和 CN 103627640 A,這些專利通過改變培養(yǎng)基中的組分，如制備全合成培養(yǎng)基，優(yōu)化維生素及微量元素含量，降低氯含量和添加外源脂相容性物質(zhì)如海藻糖、甜菜堿等方式，達(dá)到提高DHA產(chǎn)量的目的；(3)通過優(yōu)化發(fā)酵工藝方式降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)物得率。此類專利包括CN 101519676 B、CN101812484 B、CN 101824442 B、CN 102972533 A、CN103146584 A 以及 CN 103614427 A。綜合上述專利，裂殖壺菌的最高生物量達(dá)到125.2g/L，DHA產(chǎn)量最高為33.5g/L。因此，獲得DHA的高產(chǎn)菌株，并結(jié)合優(yōu)良的發(fā)酵工藝，獲得較高的生物量和油脂含量，是DHA的工業(yè)化推廣的關(guān)鍵所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵周期短、生長速度快、并高產(chǎn)二十二碳六烯酸的裂殖壺菌及其應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種裂殖壺菌,裂殖壺菌,其分類命名為裂殖壺菌(Aurant1chytrium sp) SD006,已于2013年10月21日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號(hào)為CGMCC No:8383。
[0007]裂殖壺菌Aurant1chytrium sp.SD006菌株最適溫度高、生長速度快。其最適生長溫度為28°C _35°C，發(fā)酵70小時(shí)后能獲得最大的生物量與DHA產(chǎn)量。
[0008] 一種裂殖壺菌的應(yīng)用，所述裂殖壺菌應(yīng)用于制備二十二碳六烯酸中。具體，以所述裂殖壺菌為出發(fā)菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)基中高密度發(fā)酵獲得制備DHA油脂。
[0009]所述發(fā)酵溫度為28°C _35°C，發(fā)酵時(shí)間為60-80小時(shí)，發(fā)酵過程中，采用了補(bǔ)氮操作，在發(fā)酵的24-48小時(shí)區(qū)間內(nèi)流加50% (w/v)的玉米漿溶液。整個(gè)發(fā)酵過程中采用了補(bǔ)糖操作，控制體系中葡萄糖濃度在20-60g/L之間，發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄糖濃度不高于10g/L。
[0010]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖60-120g/L，酵母提取物5-30g/L，玉米漿5_20g/L，磷酸二氫鉀0.5-8g/L，硫酸鎂0.5-5g/L，檸檬酸鈉0.5_5g/L，海水晶5_30g/L，維生素B^O^OOmg/L,維生素B630-200mg/L，維生素B125_50mg/L和生物素2_50mg/L，用水定容至IL0
[0011]一種制備生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法:以所述裂殖壺菌為出發(fā)菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)基中高密度發(fā)酵獲得制備二十二碳六烯酸。
[0012]所述發(fā)酵溫度為28°C _35°C，發(fā)酵時(shí)間為60-80小時(shí)，發(fā)酵過程中，采用了補(bǔ)氮操作，在發(fā)酵的24-48小時(shí)區(qū)間內(nèi)流加50% (w/v)的玉米漿溶液。整個(gè)發(fā)酵過程中采用了補(bǔ)糖操作，控制體系中葡萄糖濃度在20-60g/L之間，發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄糖濃度不高于10g/L。
[0013]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖60_120g/L，酵母提取物5_30g/L，玉米漿5_20g/L，磷酸二氫鉀0.5-8g/L，硫酸鎂0.5-5g/L，檸檬酸鈉0.5_5g/L，海水晶5_30g/L，維生素B^O^OOmg/L,維生素B630-200mg/L，維生素B125_50mg/L和生物素2_50mg/L，用水定容至IL0
[0014]本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下顯著特點(diǎn)和積極效果: [0015]1.本發(fā)明篩選得到一株在較高溫度下高產(chǎn)DHA的裂殖壺菌菌株，該菌株能在280C _35°C條件下快速生長，并大量積累二十二碳六烯酸。
[0016]2.本發(fā)明所得菌株生長速度快，發(fā)酵時(shí)間短。利用裂殖壺菌菌株高密度發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸。在上述發(fā)酵條件下，60-70小時(shí)即能獲得最大產(chǎn)量。經(jīng)70小時(shí)發(fā)酵后獲得生物量為180-200g/L，DHA產(chǎn)量為50_65g/L。
[0017]3.本發(fā)明所得菌株從廣東省湛江市紅樹林水域中篩選得到可高產(chǎn)二十二碳六烯酸的裂殖壺菌Aurant1chytrium sp.SD006菌株,具有很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。所篩選能高產(chǎn)DHA的裂殖壺菌，以及利用其高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA油脂的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的裂殖壺菌SD006菌株在顯微鏡下的形態(tài)，a為光學(xué)顯微鏡下觀察，b為透射電鏡觀察，c為掃描電鏡觀察。
[0019]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的利用MEGA5軟件得到的裂殖壺菌SD006菌株18S rRNA基因的進(jìn)化樹。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1
[0021]裂殖壺菌,其分類命名為裂殖壺菌(Aurant1chytrium sp) SD006,已于2013年10月21日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo:8383。
[0022]所述裂殖壺菌菌株是從廣東省湛江市紅樹林水域收集的腐葉上采用松花粉垂釣法分離得到。在光學(xué)顯微鏡下觀察:菌體為圓球形或橢球形，直徑在10-20微米，主要采用分裂方式進(jìn)行繁殖。有側(cè)生不等長的雙鞭毛(參見圖1)。胞內(nèi)脂肪酸組成主要為十四烷酸、十六烷酸、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，其中DHA含量占總脂肪酸的55%以上。用分子生物學(xué)手段對其18S rDNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該菌株與裂殖壺菌的18SrDNA序列的同源性大于99%，因此判定本菌株屬于裂殖壺菌，該序列記作SEQ ID N0.1 (參見圖2)。
[0023]SEQ ID N0.1
[0024]ccaacctggt tgatcctgcc agtagtcata tcctcgtctc aaagattaag ccatgcatgt 60
[0025]gtaagtataa gcgattgtac tgtgagactg cgaacggctc attatatcag taataatttc 120
[0026]ttcggtagtt tcttttatat ggatacctgc agtaattctg gaaataatac atgctgtaag 180
[0027]agccctgtat ggggctgcac ttattagatt gaaggcgatt ttattggtga atcatgataa 240
[0028]ttgagcagat tgacttttta gtcgatgaat cgtttgagtt tctgccccat cagttgtcga 300
[0029]cggtagtgta ttggactacg gtgactataa cgggtgacgg agagttaggg ctcgactccg 360
[0030]gagagggagc ctgagagacg gctaccatat ccaaggatag cagcaggcgc gtaaattacc 420
[0031]cactgtggac tccacgaggt agtgacgaga aatatcgatg cgaagcgtgt atgtgttttg 480
[0032]ctatcggaat gagagcaatg taaaaccctc atcgaggatc aactggaggg caagtctggt 540
[0033]gccagcagcc gcggtaattc cagctccaga agcatatgct aaagttgtcg cagttaaaaa 600
[0034]gctcgtagtt gaatttctgg catgggcgac cggtgctttc cctgaatggg gattgattgt 660
[0035]ctgtgttgcc ttggccatct ttttcttttc tttattgggg agaaatcttt cactgtaatc 720
[0036]aaagcagagt gttccaagca ggtcgtatga ccggtatgtt tattatggga tgataagata 780
[0037]ggacttgggt gctatttttg ttggtttgca cgcctgagta atggttaata ggaacagttg 840
[0038]ggggtattcg tatttaggag ctagaggtga aattcttgga tttccgaaag acgaactaga 900
[0039]gcgaaggcat ttaccaagca tgttttcatt aatcaagaac gaaagtctgg ggatcgaaga 960
[0040]tgattagata ccatcgtagt ctagaccgta aacgatgccg acttgcgatt gttgggtgct 1020
[0041]ttattaatgg gcctcagcag cagcacatga gaaatcaaag tctttgggtt ccggggggag 1080
[0042]tatggtcgca aggctgaaac ttaaaggaat tgacggaagg gcaccaccag gagtggagcc 1140
[0043]tgcggcttaa tttgactcaa cacgggaaaa cttaccaggt ccagacatag gtaggattga 1200
[0044]cagattgaga gctctttcat gattctatgg gtggtggtgc atggccgttc ttagttggtg 1260
[0045]gagtgatttg tctggttaat tccgttaacg aacgagacct cggcctacta aatagtgcgt 1320
[0046]ggtatggcaa catagtgcgt tttaacttct tagagggaca tgtccggttt acgggcagga 1380
[0047]agttcgaggc aataacaggt ctgtgatgcc cttagatgtt ctgggccgca cgcgcgctac 1440
[0048]actgatgggt tcatcgggtt ttaattctaa tttttggaat tgagtgcttg gtcggaaggc 1500
[0049]ctggctaatc cttggaacgc tcatcgtgct ggggctagat ttttgcgatt attaatctcc 1560
[0050]agcgaggaat tcctagtaaa cgcaagtcat cagcttgcat tgaatacgtc cctgcccttt 1620
[0051]gtacacaccg cccgtcgcac ctaccgattg aacggtccga tgaaaccatg ggatgtttct 1680
[0052]gtttggattc atttttggac agaggcagaa ctcgggtgaa tcttattgtt tagaggaagg 1740
[0053]tgaagtcgta acaagg1756
[0054]裂殖壺菌Aurant1chytrium sp.SD006菌株可利用的碳源包括葡萄糖，甘油，果糖，糖蜜，淀粉糖化液及木質(zhì)纖維素糖化液。最適碳源為葡萄糖，濃度為60g/L-120g/L ;對有機(jī)氮源和無機(jī)氮源均可利用，其中有機(jī)氮源包括酵母提取物，蛋白胨，胰蛋白胨，玉米漿，尿素；無機(jī)氮源包括無機(jī)銨鹽與無機(jī)硝酸鹽。最適氮源為酵母提取物，濃度為10g/L-30g/L。另外，玉米漿也是較合適的氮源，濃度為2g/L-10g/L。
[0055]將保存在甘油管的菌株接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在30°C的搖床中，以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24h，獲得一級種子；將一級種子接入裝有10ml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在30°C的搖床中，以200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)12h，獲得二級種子；向3L生物反應(yīng)器中加入1.2L發(fā)酵培養(yǎng)基，接入活化的二級種子液。發(fā)酵過程中，溫度控制在28°C。發(fā)酵過程中，采用了補(bǔ)氮操作，發(fā)酵的24-48小時(shí)內(nèi)流加50% (w/v)的玉米漿溶液。自動(dòng)添加2M NaOH或14%檸檬酸使pH值保持在6.5。發(fā)酵時(shí)間80小時(shí)。
[0056]發(fā)酵結(jié)束后，3L發(fā)酵罐獲得裂殖壺菌的產(chǎn)量(參見表1)為180.43g/L，獲得生物油脂 94.lg/L，DHA 產(chǎn)量為 53.5g/L。
[0057]種子培養(yǎng)基為葡萄糖60g/L,酵母提取物5g/L,玉米衆(zhòng)5g/L,磷酸二氫鉀0.5g/L,硫酸鎂0.5g/L,檸檬酸鈉0.5g/L,海水晶5g/L,維生素BJOmg/L,維生素B630mg/L,維生素B125mg/L 和生物素 2mg/L。
[0058]發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖120g/L，酵母提取物30g/L，玉米漿20g/L，磷酸二氫鉀Sg/L，硫酸鎂5g/L，檸檬酸鈉5g/L，海水晶30g/L，維生素BfOOmg/L，維生素B6200mg/L，維生素B1250mg/L 和生物素 50mg/L。
[0059]表1發(fā)酵后裂殖壺菌SD006胞內(nèi)脂肪酸組成情況
【權(quán)利要求】
1.一種裂殖壺菌，其特征在于:裂殖壺菌，其分類命名為裂殖壺菌(Aurant1chytriumsp) SD006,已于2013年10月21日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo:8383。
2.—種權(quán)利要求1所述的裂殖壺菌的應(yīng)用，其特征在于:所述裂殖壺菌應(yīng)用于制備二十二碳六烯酸中。
3.按權(quán)利要求2所述的裂殖壺菌的應(yīng)用，其特征在于:以所述裂殖壺菌為出發(fā)菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)基中高密度發(fā)酵獲得制備DHA油脂。
4.按權(quán)利要求2或3所述的裂殖壺菌的應(yīng)用，其特征在于:所述發(fā)酵溫度為280C _35°C，發(fā)酵時(shí)間為60-80小時(shí)，發(fā)酵過程中，采用了補(bǔ)氮操作，在發(fā)酵的24-48小時(shí)區(qū)間內(nèi)流加50 % (w/V)的玉米衆(zhòng)溶液。
5.按權(quán)利要求2或3所述的裂殖壺菌的應(yīng)用，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖60-120g/L,酵母提取物5-30g/L，玉米漿5_20g/L，磷酸二氫鉀0.5_8g/L，硫酸鎂0.5_5g/L，檸檬酸鈉0.5-5g/L，海水晶5-30g/L，維生素BJO10mg/L，維生素B630_200mg/L，維生素B125-50mg/L 和生物素 2_50mg/L。
6.一種制備生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其特征在于:以所述裂殖壺菌為出發(fā)菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)基中高密度發(fā)酵獲得制備二十二碳六烯酸。
7.按權(quán)利要求6所述的制備生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其特征在于:所述發(fā)酵溫度為28°C -35°C，發(fā)酵時(shí)間為60-80小時(shí)，發(fā)酵過程中，采用了補(bǔ)氮操作，在發(fā)酵的24-48小時(shí)區(qū)間內(nèi)流加50% (w/v)的玉米衆(zhòng)溶液。
8.按權(quán)利要求6所述的制備生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖60-120g/L，酵母提取物5-30g/L，玉米漿5_20g/L，磷酸二氫鉀0.5_8g/L,硫酸鎂0.5-5g/L，檸檬酸鈉0.5-5g/L，海水晶5_30g/L，維生素BJO10mg/L，維生素B630-200mg/L,維生素 B125_50mg/L 和生物素 2_50mg/L。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK104031843SQ201410203041
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】崔球, 宋曉金, 譚延振, 馮銀剛 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所