靶向ifnar2基因的rna干擾表達(dá)載體構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了靶向IFNAR2基因的RNA干擾表達(dá)載體構(gòu)建及應(yīng)用。本發(fā)明的方法是將篩選得到的靶向IFNAR2基因的siRNA寡核苷酸片段插入到載體系統(tǒng)中，構(gòu)建成靶向IFNAR2基因的RNA干擾質(zhì)粒載體。實驗表明，本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體可以在ST細(xì)胞中高效表達(dá)特異的siRNA序列，且該序列能夠結(jié)合IFNAR2基因的mRNA，使IFNAR2基因的表達(dá)量顯著降低，達(dá)到抑制IFNAR2基因表達(dá)的目的。為進(jìn)一步研究IFNAR2基因的生物學(xué)功能提供更加可靠和便捷的研究手段，同時為研究IFNAR2受體在病毒感染中的作用奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】靶向IFNAR2基因的RNA干擾表達(dá)載體構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及靶向IFNAR2基因的RNA干擾表達(dá)載體構(gòu)建及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]干擾素的抗病毒作用是干擾素分子結(jié)合到干擾素受體之后，向細(xì)胞核傳播信號，2，5-腺苷酸合成酶和蛋白激酶被活化，最后阻斷病毒蛋白的翻譯和病毒RNA的合成。干擾素受體是干擾素連鎖反應(yīng)的初始蛋白。人的干擾素受體分I型干擾素受體(該受體與干擾素α、β結(jié)合)及II型干擾素受體(與干擾素Y結(jié)合產(chǎn)生特異的敏感性)。此外，已證實II型干擾素受體對干擾素α、β也有一定的敏感性，干擾素α亞型和β亞型均對干擾素受體敏感。
[0003]IFN生物效應(yīng)的發(fā)揮，需要跟相應(yīng)的信號受體結(jié)合。根據(jù)IFN的分類，干擾素受體分為:結(jié)合I型干擾素的I型干擾素受體和結(jié)合II型干擾素受體。人I型干擾素受體基因定位于第21號染色體上，分布于細(xì)胞表面，至少含有兩個亞單位，命名為a (IFNAR-1)和β (IFNAR-2)，它們屬于II類細(xì)胞因子受體家族。IFN-α/β通過吸附細(xì)胞表面受體IFNAR-1和IFNAR-2發(fā)揮作用，蛋白酪氨酸激酶中的Tyk2和Jakl分別與IFNAR-1和IFNAR-2 相關(guān)。
[0004]為了更好地解析IFNAR2基因的生物學(xué)功能和挖掘其在臨床上的應(yīng)用價值，進(jìn)一步闡明IFNAR2基因的生物學(xué)功能成為必要。目前，運用RNA干擾的方法研究基因功能成為了基因功能研究中最重要的手段之一，但是針對IFNAR2基因干擾的研究尚未見任何指導(dǎo)。
[0005]RNA干擾(RNA interference，縮寫為RNAi)是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。與其它基因沉默現(xiàn)象不同的是，在植物和線蟲中，RNAi具有傳遞性，可在細(xì)胞之間傳播，此現(xiàn)象被稱作系統(tǒng)性RNA干擾(systemic RNAi)。在秀麗隱桿線蟲上實驗時還可使子一代產(chǎn)生基因突變，甚到于可用喂食細(xì)菌給線蟲的方式讓線蟲得以產(chǎn)生RNA干擾現(xiàn)象。RNAi現(xiàn)象在生物中普遍存在。RNAi所誘導(dǎo)的特異性基因沉默現(xiàn)象，是真核生物中存在的一種抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機制，具有重大生物學(xué)意義。
[0006]RNA干擾作用是通過一類較穩(wěn)定的中間介質(zhì)實現(xiàn)的。對植物的研究證明，雙鏈RNA復(fù)合體先降解成為35nt左右的小RNA分子，然后他們通過序列互補與mRNA結(jié)合，從而導(dǎo)致mRNA降解。對果蠅的研究證明，長度為21~23nt的小RNA分子是引起RNA干擾現(xiàn)象的直接原因。這種小RNA分子被稱之為小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA) ?目前獲得siRNA產(chǎn)物的方法主要包括以下五種:1)化學(xué)合成；2)體外轉(zhuǎn)錄；3)RNase III降解dsRNA ；4) siRNA表達(dá)載體；5)PCR表達(dá)框。在以上方法中，化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄和RNase III降解dsRNA均是在體外制備得到siRNA，siRNA需要進(jìn)入細(xì)胞后才能對蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制，因此將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞是成功的關(guān)鍵。siRNA表達(dá)載體可以在克隆菌株中大量擴增，還可以使用常規(guī)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染方法，將siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)加工生成siRNA。而且siRNA表達(dá)載體是唯一可以進(jìn)行長期研究的方法，因該方法中克隆到的帶抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)時間久，并且可以做穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供靶向IFNAR2基因的siRNA。本發(fā)明通過大量篩選和實驗工作得到靶向IFNAR2基因的siRNA。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供表達(dá)siRNA的表達(dá)載體。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供上述表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
[0010]本發(fā)明的再一目的在于提供上述siRNA及表達(dá)載體在抑制IFNAR2基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):靶向IFNAR2基因的siRNA，其編碼所述siRNA的DNA序列選自如下核苷酸序列:
[0012]siEl:5/ -CTAACAGATGTGTGGATAA-3' (SEQ ID N0.7)；
[0013]siE2:5/ -CGAATAAAGGGAAACATCA-3' (SEQ ID N0.8)；
[0014]siE3:5/ -GATGAATCTTGCACTTTAA-3' (SEQ ID N0.9)；
[0015]進(jìn)而，根據(jù)上述siRNA的DNA序列設(shè)計合成shRNA，其是將上述siRNA的DNA序列與其互補序列用loop結(jié)構(gòu)連接作為正義鏈，其互補序列作為反義鏈，形成雙鏈結(jié)構(gòu)；為了便于插入表達(dá)載體，還可以在該序列兩端分別接上接頭序列，最終形成諸如SEQ ID N0.1和2，SEQ ID N0.3和4，或SEQ ID N0.5和6退火形成的雙鏈shRNA ；
[0016]進(jìn)一步，本發(fā)明提供含有上述siRNA或shRNA的siRNA表達(dá)載體；在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述表達(dá)載體源自pSilencer4.1-CMV neo ;構(gòu)建得到表達(dá)載體為pSiCMVEl、pSiCMVE2 和 pSiCMVE3。
[0017]本發(fā)明還提供構(gòu)建上述siRNA表達(dá)載體的方法，其包括如下步驟:
[0018](I)將上述siRNA的DNA序列和其互補序列用loop結(jié)構(gòu)序列連接形成正義鏈，在正義鏈的兩端引入接頭序列；
[0019](2)根據(jù)步驟(1)的正義鏈得到其反義鏈，并在其兩端引入接頭序列；
[0020](3)將步驟⑴和⑵得到的序列在溶液中退火，形成shRNA ；
[0021](4)將shRNA插入線性化的siRNA表達(dá)載體中，得到表達(dá)siRNA的表達(dá)載體。
[0022]在本發(fā)明實施方式中，步驟(1)中所述的5'引入的接頭序列為5' -GATCC-3'，3'引入的接頭序列為5' -TTA-3 / ;步驟(2)中所述的5'引入的接頭序列為5' -AGCTTAA-3'，3'引入的接頭序列為G ;所述loop結(jié)構(gòu)序列為5' -TTCAAGAGA-3'。
[0023]轉(zhuǎn)染上述載體進(jìn)入ST細(xì)胞，分別從RNA和蛋白水平檢測這些質(zhì)粒載體干擾IFNAR2基因表達(dá)的干擾效率，結(jié)果表明，上述構(gòu)建的表達(dá)載體可以在ST細(xì)胞中高效表達(dá)特異的siRNA序列，且該序列能夠結(jié)合IFNAR2基因的mRNA，使IFNAR2基因的表達(dá)量顯著降低，達(dá)到抑制IFNAR2基因表達(dá)的目的；從而可以將上述siRNA、shRNA或上述表達(dá)載體用于IFNAR2基因的表達(dá)。
[0024]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果:[0025]本發(fā)明中所得到的三種干擾IFNAR2基因表達(dá)的干擾質(zhì)粒載體(pSiCMVEl、pSiCMVE2和pSiCMVE3)，具有在ST細(xì)胞(豬睪丸細(xì)胞)中特異性和高效性地干擾IFNAR2基因表達(dá)的能力，為進(jìn)一步研究IFNAR2基因的生物學(xué)功能提供更加可靠和便捷的研究手段，同時為研究IFNAR2受體在病毒感染中的作用奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是用于構(gòu)建IFNAR2基因的RNAi干擾質(zhì)粒載體的質(zhì)粒系統(tǒng)pSilencer4.1-CMVneo示意圖(引自Ambion公司提供的技術(shù)手冊AM5779)。
[0027]圖2是siEl、siE2和siE3轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒提取檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，泳道M:DL5000DNA Marker ;泳道1:siEl轉(zhuǎn)化子的獨立克隆子的質(zhì)粒提?。挥镜?:siE2轉(zhuǎn)化子的獨立克隆子的質(zhì)粒提??；泳道3:siE3轉(zhuǎn)化子的獨立克隆子的質(zhì)粒提取。
[0028]圖3是將三種針對IFNAR2基因的干擾質(zhì)粒載體或陰性對照載體分別轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞后48h，從RNA水平檢測IFNAR2基因mRNA表達(dá)變化圖；PSiCMVNC:表示轉(zhuǎn)染陰性對照載體pSiCMVNC到ST細(xì)胞后，IFNAR2基因mRNA的相對表達(dá)量(設(shè)定為1，作為參考值)；pSiCMVEl:表示轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒載體pSiCMVEl到ST細(xì)胞后，IFNAR2基因mRNA的表達(dá)量；pSiCMVE2:表示轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒載體pSiCMVE2到ST細(xì)胞后，IFNAR2基因mRNA的表達(dá)量；pSiCMVE3:表示轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒載體pSiCMVE3到ST細(xì)胞后，IFNAR2基因mRNA的表達(dá)量。
[0029]圖4是將三種針對IFNAR2基因的干擾質(zhì)粒載體或陰性對照載體分別轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞后48h，Western blot分析方法檢測IFNAR2基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物的變化圖；PSiCMVNC:表示轉(zhuǎn)染陰性對照載體PSiCMVNC到ST細(xì)胞后，IFNAR2基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)情況；pSiCMVEl:表示轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒載體pSiCMVEl到ST細(xì)胞后，IFNAR2基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)情況；pSiCMVE2:表示轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒載體pSiCMVE2到ST細(xì)胞后，IFNAR2基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)情況；pSiCMVE3:表示轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒載體pSiCMVE3到ST細(xì)胞后，IFNAR2基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)情況；下行為在轉(zhuǎn)染了不同載體時作為內(nèi)參的β-actin的表達(dá)情況。
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0031]下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook 等編，《分子克隆:實驗室手冊》(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2002)中所述的實驗條件，或按照制造廠商所建議的實驗條件。
[0032]實施例1針對IFNAR2基因的RNA干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建
[0033]一、表達(dá)IFNAR2基因的siRNA的寡核苷酸序列的設(shè)計與合成
[0034]根據(jù)IFNAR2基因的核苷酸序列(GenBank No:HQ665551)，設(shè)計篩選得到若干針對IFNAR2基因mRNA序列的siRNA的DNA序列，將它們分開以形成“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的輔助序列(loop區(qū))連接，形成“發(fā)夾”狀siRNA的正義鏈，并在兩端分別加上針對pSilenCer4.1-CMVneo (購自Ambion公司，示意圖如圖1所示)的接頭序列，正義鏈的互補序列作為反義鏈,并在反義鏈的兩端分別加上針對pSilencer4.1-CMV neo的接頭序列,兩者退火形成帶有針對pSilencer4.1-CMV neo 的接頭的 shRNA。
[0035]進(jìn)一步篩選得到三對siRNA序列，本發(fā)明將它們分別命名為siEl、siE2和siE3。進(jìn)一步對它們進(jìn)行序列加工，使之成為可以生成“發(fā)夾”狀siRNA的寡核苷酸序列(分別見SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 中所示的核苷酸序列)；核苷酸序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2互補即可形成針對siEl的、具有干擾IFNAR2基因mRNA表達(dá)的siRNA寡核苷酸片段；核苷酸序列SEQ ID N0.3和SEQID N0.4互補即可形成針對siE2的、具有干擾IFNAR2基因mRNA表達(dá)的siRNA寡核苷酸片段；核苷酸序列SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6互補即可形成針對siE3的、具有干擾IFNAR2基因mRNA表達(dá)的siRNA寡核苷酸片段；
[0036]將這些設(shè)計好的寡核苷酸序列送交“上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司”合成。
[0037]二、重組干擾片段系列pSilencer載體的構(gòu)建
[0038]本發(fā)明中參考Ambion公司提供的pSilencer4.1-CMV neo使用技術(shù)手冊,按如下流程構(gòu)建重組片段的干擾pSilencer載體。
[0039]1.寡核苷酸片段工作液的制備
[0040]將上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的寡核苷酸片段干粉于12000g離心I分鐘，添加適量滅菌雙蒸水充分溶解后，用常規(guī)的TE緩沖液稀釋，并用紫外分光計定量，使每種寡核苷酸溶液的濃度達(dá)到IOOpmol/μ L，作為退火反應(yīng)的工作液。
[0041]2.正向/反向寡核苷酸片段的退火
[0042]按如下成分和比例配制正向/反向寡核苷酸片段的退火反應(yīng)體系，混勻后在90°C水浴加熱3分鐘，再在37°C水浴孵育I小時，反應(yīng)結(jié)束后可以直接用于后續(xù)的連接反應(yīng)，也可保存于_20°C備用。
[0043]反應(yīng)體系如下:
【權(quán)利要求】
1.靶向IFNAR2基因的siRNA，其特征在于:編碼所述siRNA的DNA序列選自如下核苷酸序列:
siEl:5/ -CTAACAGATGTGTGGATAA-3'；
siE2:5/ -CGAATAAAGGGAAACATCA-3'；
siE3:5/ -GATGAATCTTGCACTTTAA-3'。
2.針對IFNAR2基因的shRNA，其特征在于:編碼所述shRNA的DNA序列為:SEQID N0.1和2，SEQ ID N0.3和4 ，或SEQ ID N0.5和6退火形成的雙鏈。
3.含有權(quán)利要求1所述的siRNA或權(quán)利要求2所述shRNA的siRNA表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的siRNA表達(dá)載體,其特征在于:其源自pSilencer4.1-CMVneo0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的siRNA表達(dá)載體，其特征在于:其為pSiCMVEl、pSiCMVE2或pSiCMVE30
6.權(quán)利要求3~5任一項所述的siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于包括如下步驟: (1)將權(quán)利要求1所述的siRNA的DNA序列和其互補序列用loop結(jié)構(gòu)序列連接形成正義鏈，在正義鏈的兩端引入接頭序列； (2)根據(jù)步驟(1)的正義鏈得到其反義鏈，并在其兩端引入接頭序列； (3)將步驟⑴和(2)得到的序列在溶液中退火，形成shRNA； (4)將shRNA插入線性化的siRNA表達(dá)載體中，得到表達(dá)siRNA的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中所述的5'引入的接頭序列為5' -GATCC-3'，3'引入的接頭序列為5' -TTA-3'。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中所述的5'引入的接頭序列為5' -AGCTTAA-3'，3'引入的接頭序列為G。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的loop結(jié)構(gòu)序列為5' -TTCAAGAGA-3'。
10.權(quán)利要求1所述的SiRNA、權(quán)利要求2所述的ShRNA或權(quán)利要求3~5所述的siRNA表達(dá)載體在抑制IFNAR2基因表達(dá)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/64GK103952413SQ201410203742
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】張建峰, 沈海燕, 張春紅, 郭鵬舉, 陳琴苓, 盧宇 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所, 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院