用于生產異丁香酚單加氧酶的大腸埃希氏菌及構建和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于生產異丁香酚單加氧酶的大腸埃希氏菌及構建方法和應用，該大腸埃希氏菌命名為BL21(DE3)IEM-PP，保藏編號為CGMCC?No.8918。構建方法是利用PCR技術，以土壤的全基因組DNA為模板，在PCR引物作用下擴增得到長度為1438bp的片段，經切膠回收并純化處理后同T載體pET21(a)連接得到克隆載體重組質粒PET21(a)-IEM的重組菌BL21(DE3)IEM-PP，可以應用該重組菌生物轉化異丁香酚生產香草醛。
【專利說明】用于生產異丁香酚單加氧酶的大腸埃希氏菌及構建和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及異丁香酚單加氧酶的基因工程菌的構建及其生物催化【技術領域】，特別是涉及一種用于生產異丁香酚單加氧酶的大腸埃希氏菌及構建方法和應用。
【背景技術】 [0002]香草醛是工業(yè)中應用最廣泛的香料之一，大量用于食品工業(yè)，可作為香氣修飾和定香的主要原料用于食品、牙膏、香皂、煙草中；在醫(yī)藥化工中作為重要的原料或中間體，可用于制造治療高血壓、心臟病、皮膚病及消除口臭、利尿的常用藥物；在化學工業(yè)中可作為化學助劑，用于塑料制品的抗硬化劑以及Ni，Cr, Cd等金屬的電鍍光亮劑；在農業(yè)生產上，香草醛可作為作物增產劑和催熟劑，并用之制備除草劑和昆蟲引誘劑等，需求量很大。香草醛目前主要由化學方法制備，但用化學合成法制得的香草醛不是天然香料。天然香草醛可以從香子蘭的花莢中提取，但用植物組織提取的方法生產的天然香草醛量少而價高，不能滿足日益增長的需求。
[0003]隨著世界各國對食品安全越來越重視，對天然香草醛的需求越來越大。天然香料是指由動植物材料經物理(包括蒸餾、溶劑萃取)方法、酶法或微生物方法得到的，可通過傳統(tǒng)的食品加工方法(包括干燥、焙烤、發(fā)酵)加工后用于人類消費的物質。根據歐洲和美國立法，利用動植物資源通過物理方法、酶法或微生物法得到的物質才能稱為天然物質(MuheimAndrea.US6, 235，507.2001)。用生物法生產的香草醛，屬天然產品，可以生物降解，符合消費者追求天然產品的消費心理。因此，利用生物轉化技術生產生物香蘭素，是一種有效的、很有前途的替代方法。
[0004]在過去的十年里報道了許多用微生物法或酶法生產香草醛的方法，一般都是通過微生物或酶將合適的前體轉化為香草醛。目前，尚未有重組菌轉化異丁香酚生產香草醛的任何報道。

【發(fā)明內容】

[0005]為了彌補上述現有技術的不足，本發(fā)明提供一種用于生產異丁香酚單加氧酶的工程菌(大腸埃希氏菌)及其構建方法和應用，該工程菌可用于生產異丁香酚單加氧酶，進而用于轉化異丁香酚生產香草醛。
[0006]本發(fā)明的技術問題通過以下的技術方案予以解決:
[0007]—種用于生產異丁香酹單加氧酶的大腸埃希氏菌(Escherichia coli),該所述大腸埃希氏菌命名為BL21 (DE3) IEM-PP，保藏編號為CGMCC N0.8918。
[0008]本發(fā)明提供的工程菌屬于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，命名為BL21(DE3)IEM-PP,已于2014年3月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8918。大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3) IEM-PP CGMCC N0.8918簡稱大腸埃希氏菌BL21 (DE3)IEM-PP0該大腸埃希氏菌BL21 (DE3) IEM-PP可用于生產異丁香酚單加氧酶，并利用其轉化異丁香酚生產香草醛。
[0009]一種上述大腸埃希氏菌的構建方法，包括如下步驟:
[0010](I)提取土壤的全基因組DNA ；
[0011](2)根據異丁香酚單加氧酶的基因序列，設計PCR引物，所述PCR引物包括上游引物 SEQ ID N0.1 和下游引物 SEQ ID N0.2 ；
[0012](3)以所述全基因組DNA為模板，用步驟⑵中的PCR引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，切膠回收得到大小為1438bp的目標基因SEQ ID N0.3 ；
[0013](4)將目標基因SEQ ID N0.3插入T載體pET21 (a)的Ndel和XhoI酶切位點之間，得到重組質粒PET21 (a) -1EM ；
[0014](5)將重組質粒PET21(a)_IEM轉化得到所述大腸埃希氏菌。
[0015]一種所述的大腸埃希氏菌在生產異丁香酚單加氧酶中的應用。
[0016]優(yōu)選地，所述的應用包括如下步驟:
[0017](I)將所述的大腸埃希氏菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，得到菌濃度OD6tltol = 0.1-0.2(如
0.1-0.15或0.15-0.2)的 發(fā)酵初始體系；
[0018](2)將所述發(fā)酵初始體系進行如下發(fā)酵:先在35_37°C下振蕩培養(yǎng)3_5小時，然后加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至IPTG在所述述發(fā)酵初始體系中的終濃度為50-100 μ M，然后在25-30°C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12-48小時，得到氨基酸序列為SEQ ID N0.4異丁香酚單加氧酶。
[0019]優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基pH為7.0-7.2(如7.0-7.1或7.1_7.2)，包括10_15g/L(如 10-12g/L 或 12-15g/L)胰蛋白胨、15_23g/L(如 15_19g/L 或 19_23g/L)酵母提取物、5-10g/L(如 5-7g/L 或 7-10g/L)氯化鈉、10_15g/L(如 10_12g/L 或 12_15g/L)甘油、10-17mM(如 10-14mM 或 14_17mM)磷酸二氫鉀和 65_75mM(如 65_70mM 或 70_75mM)磷酸氫二鉀，余量為水。
[0020]優(yōu)選地，所述大腸埃希氏菌以種子液的形式用移液器接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基，所述種子液占所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積分數為0.5-2%，即接種量為0.5-2%，進一步優(yōu)選接種
量為1%。
[0021]優(yōu)選地，所述種子液是將所述大腸埃希氏菌接種至種子培養(yǎng)基，35_37°C振蕩培養(yǎng)至菌濃度OD6tltlnm = 3-6形成。
[0022]優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基pH為7.0-7.2 (如7.0-7.1或7.1-7.2)，包括10_15g/L (如 10-13g/L 或 13-15g/L)胰蛋白胨、5_8g/L (如 5_7g/L 或 7_8g/L)酵母提取物、5_10g/L(如5-7g/L或7-10g/L)氯化鈉，余量為水。
[0023]以上任一所述的振蕩培養(yǎng)是在100-220r/min (如 100_150r/min 或 150_220r/min)下進行。
[0024]一種香草醛的制備方法，包括如下步驟:按異丁香酚:異丁香酚單加氧酶:緩沖液=0.1~0.4g:0.2~1.2g:9~18mL加入反應容器中，在20~28°C下振搖轉化12~48h，得到香草醛；所述異丁香酚單加氧酶由上述任意一項所述的應用制備得到，所述緩沖液為pH8~10.4的甘氨酸/NaOH水溶液。
[0025]優(yōu)選地，甘氨酸/NaOH水溶液中甘氨酸的濃度可以為50~150mM。
[0026]優(yōu)選地，在所述反應容器中，還添加DMS0、離子液體和香草醛吸附劑中的至少一種；每0.1~0.4g異丁香酚中:所述DMSO的加入量≤lmL，所述離子液體的加入量(100 μ L，香草醛吸附劑的加入量≤0.6g。
[0027]加入的DMSO或離子液體可以與水互溶，可以促進異丁香酚在整個體系中的溶解度，而又不會使酶失活；加入的香草醛吸附劑可以吸附香草醛從而加快反應進程，增加產率。
[0028]優(yōu)選地，所述香草醛吸附劑為樹脂和殼聚糖膜中的至少一種。
[0029]本發(fā)明提供的工程菌和方法可用于生產異丁香酚單加氧酶，并用于轉化異丁香酚生產香草醛，具備潛在工業(yè)化價值(生物法制香精香料)，為后續(xù)的工業(yè)化研究奠定了基礎。
【具體實施方式】
[0030]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為是從常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0031]實施例一:工程菌的獲得和保藏
[0032]一、工程菌的構建
[0033]1、采取深圳大學文山湖周圍土樣，以FastDNA? Spin Kit for Soil ( 土壤基因組DNA提取試劑盒)提取土壤的全基因組DNA。
[0034]2、根據公知的異丁香酚單加氧酶的相關基因序列，設計PCR引物，包括上游引物SEQ ID N0.1 和下游引物 SEQ ID N0.2。
[0035]SEQ ID N0.1 的序列如下:5，-atgctacatatggcaacgtttgaccgcaat-3，
[0036]SEQ ID N0.2 的序列如下:5，_cttatctctcgaggttcttagactgccaac_3’
[0037]3、以全基因組DNA為模板，用步驟2設計的PCR引物進行PCR擴增(PCR擴增采用常規(guī)的方法:5*FastPfu緩沖液10 μ L、模板DNA0.5 μ L、弓丨物SEQ ID N0.1為I μ L、SEQ IDN0.2 為 I μ L、dNTPSl.25 μ L,Transtart FastPfu DNA 聚合酶 I μ L、ddH2035.3 μ L，共 50 μ L。PCR 程序:① 95°C 2min ;@95°C 20s ;@55°C 20s ;@72°C 40s ;?72°C 5min ;?4°C 1min ；⑦Cycle*30從②到④)，得到PCR擴增產物，切膠回收并純化處理得到大小為1438bp的目標基因 SEQ ID N0.3。
[0038]SEQ ID N0.3 的序列如下:5，-atggcaacgt ttgaccgcaa tgatccacagttgagcaggcacgatgttcc ccacccgaat agaggcgaat gtctttgacc ttgaaattga gggcgagatcccacgtgcaatcaacgggag cttcttccgc aacacccccg aacctcaggt caccacgcaa cctttccacacctteatcgatggggatggt ttggcgtctg cttttcattt cgaagatggc caggtcgact ttgtcagccgttgggtatgt actcctcgctttgaagctga gcggtcggct cgtaaatcac tcttcggtat gtaccgcaatccgttcactg atgatccatcggtagaaggt attgatcgta cagtcgccaa caccagtatc atcactcatcacgggaaagt actggccgcaaaggaagatg gactacctta tgagcttgac ccccaaaccc tggaaacccgaggtcgttat gattacaaggggcaggtaac cagccataca catacagcgc accctaagtt cgacccccagacaggtgaaa tgttactcttcggctccget gctaaaggcg aacgaacgct tgatatggcg tactatattgttgatcgcta cggcaaggtgacacatgaga cctggtttaa gcagccttac ggtgcattca tgcacgactttgctgtcacg cgcaactggt caatctttccgatcatgcct gcgacaaata gccttgagcg tcttaaagcaaagcagccca tttacatgtg ggagcctgagcgaggaagct atataggagt acttcctcgt cgtggtcagggcaaggacat tcgttggttc cgtgccccggcgttgtgggt tttccatgtc gtgaatgctt gggaggaagggaatagaatt ctgattgact tgatggaaag tgagattttgccgttcccat tcccgaactc gcagaaccttccatttgatc cctccaaggc tgttccgcgt ctaacccgttgggaaattga tctcaatagt ggtaacgatgagatgaaacg tacgcagcta cacgaatatt ttgcagaaatgcctatcatg gatttccgtt ttgcgctccaggatcatcgc tacgcctaca tgggggttga cgatcctcgt cgccccttagctcatcagca agctgaaaaaatctttgcct acaattcgtt aggggtttgg gacaaccatc gtaaagatta tgaactttggtttacgggaaaaatgtctgc agcgcaggaa ccggcgtttg ttcctagaag cccagatgcg cctgagggcgatggctacctactcagtgta gtagggcggc tcgatgaaga tcgtagcgat ctagttatcc ttgatacgcaatgtttggcagctgggcctg tggccactgt caagcttccc ttccgtctcc gagcagcgtt gcacggttgttggcagtctaagaactga-3，
[0039]4、將步驟3中的目標基因插入T載體pET21 (a)的Ndel和XhoI酶切位點之間，得到重組質粒PET21 (a) -1EM。
[0040]5、將重組質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到一株重組菌(工程菌)，該重組菌的生理生化性質與大腸桿菌一樣，命名為BL21 (DE3) IEM-PP。
[0041]二、工程菌的保藏 [0042]BL21 (DE3) IEM-PP 屬于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。BL21 (DE3) IEM-PP 于2014年3月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.8918。大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3) IEM-PP CGMCC N0.8918 簡稱大腸埃希氏菌 BL21(DE3)IEM-PP。
[0043]實施例二:應用工程菌生產異丁香酚單加氧酶
[0044]一、培養(yǎng)基的制備
[0045]種子培養(yǎng)基(pH7.0):取1g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化鈉，用水溶解并定容至 IL ;121°C滅菌 30min。
[0046]發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0):取1g胰蛋白胨、15g酵母提取物、5g氯化鈉、1g甘油、1mM磷酸二氫鉀和65mM磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至IL ;121°C滅菌30min。
[0047]二、應用工程菌生產異丁香酚單加氧酶
[0048]1、將大腸埃希氏菌BL21(DE3)IEM-PP接種至種子培養(yǎng)基，35°C振蕩培養(yǎng)(10r/min)至OD6citlnm = 3,即為種子液。
[0049]2、將步驟I的種子液用移液器按I % (v/v)的接種量接種至40mL發(fā)酵培養(yǎng)基(可以采用250mL搖瓶)，得到OD6tltlnm = 0.1的發(fā)酵初始體系；發(fā)酵過程如下(共43小時):先35°C振蕩培養(yǎng)(100r/min)3小時，然后加入IPTG至IPTG在所述述發(fā)酵初始體系中的終濃度為50 μ M繼續(xù)25°C振蕩培養(yǎng)(100r/min)40小時。
[0050]3、將完成步驟2的發(fā)酵體系離心(12000r/min，5min)收集菌體,該菌體為異丁香酚單加氧酶粗酶，以SDS凝膠電泳確定50kDa處的目的蛋白條帶，異丁香酚單加氧酶的氨基酸序列為SEQ ID N0.4,包含478個氛基酸，其序列如下:Met Ala Thr Phe Asp Arg Asn AspPro Gln Leu Ala Gly Thr Met Phe Pro Thr Arg IleGlu Ala Asn Val Phe Asp Leu Glu lie GluGly Glu lie Pro Arg Ala lie Asn Gly SerPhe Phe Arg Asn Thr Pro Glu Pro Gln Val Thr ThrGln Pro Phe His Thr Phe lie AspGly Asp Gly Leu Ala Ser Ala Phe His Phe Glu Asp Gly GlnVal Asp Phe Val Ser ArgTrp Val Cys Thr Pro Arg Phe Glu Ala Glu Arg Ser Ala Arg Lys SerLeu Phe Gly MetTyr Arg Asn Pro Phe Thr Asp Asp Pro Ser Val Glu Gly lie Asp Arg Thr ValAla AsnThr Ser lie lie Thr His His Gly Lys Val Leu Ala Ala Lys Glu Asp Gly Leu Pro TyrGluLeu Asp Pro Gln Thr Leu Glu Thr Arg Gly Arg Tyr Asp Tyr Lys Gly Gln Val Thr SerHisThr His Thr Ala His Pro Lys Phe Asp Pro Gln Thr Gly Glu Met Leu Leu Phe GlySer Ala AlaLys Gly Glu Arg Thr Leu Asp Met Ala Tyr Tyr lie Val Asp Arg Tyr GlyLys Val Thr His GluThr Trp Phe Lys Gln Pro Tyr Gly Ala Phe Met His Asp Phe AlaVal Thr Arg Asn Trp Ser liePhe Pro lie Met Pro Ala Thr Asn Ser Leu Glu Arg LeuLys Ala Lys Gln Pro lie Tyr Met TrpGlu Pro Glu Arg Gly Ser Tyr lie Gly Val Leu ProArg Arg Gly Gln Gly Lys Asp lie Arg TrpPhe Arg Ala Pro Ala Leu Trp Val Phe HisVal Val Asn Ala Trp Glu Glu Gly Asn Arg lie Leulie Asp Leu Met Glu Ser Glu IleLeu Pro Phe Pro Phe Pro Asn Ser Gln Asn Leu Pro Phe AspPro Ser Lys Ala Val ProArg Leu Thr Arg Trp Glu lie Asp Leu Asn Ser Gly Asn Asp Glu MetLys Arg Thr GlnLeu His Glu Tyr Phe Ala Glu Met Pro lie Met Asp Phe Arg Phe Ala Leu GlnAsp HisArg Tyr Ala Tyr Met Gly Val Asp Asp Pro Arg Arg Pro Leu Ala His Gln Gln AlaGluLys lie Phe Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Val Trp Asp Asn His Arg Lys Asp Tyr Glu LeuTrpPhe Thr Gly Lys Met Ser Ala Ala Gln Glu Pro Ala Phe Val Pro Arg Ser Pro AspAla Pro GluGly Asp Gly Tyr Leu Leu Ser Val Val Gly Arg Leu Asp Glu Asp Arg SerAsp Leu Val lie LeuAsp Thr Gln Cys Leu Ala Ala Gly Pro Val Ala Thr Val Lys LeuPro Phe Arg Leu Arg Ala AlaLeu His Gly Cys Trp Gln Ser Lys Asn
[0051]4、將步驟3獲得的菌體用含有6M尿素的PDG緩沖液(包含ImM 二硫蘇糖醇和10% (體積分數)甘油，pH7.0，50mM磷酸鹽緩沖液)震蕩懸浮，超聲破碎40min，離心(4?，15，000r/min離心40min)收集上清液，以針頭過濾器(孔徑0.45 μ m)過濾后，經HiTrap Chelating HP柱純化 ，收集UV280各峰組分，經SDS凝膠電泳確定50kDa處的目的蛋白，透析(甘氨酸-NaOH緩沖液)獲得異丁香酚單加氧酶純酶。
[0052]應用異丁香酚單加氧酶(可以是實施例二中制備得到的異丁香酚單加氧酶粗酶，也可以是異丁香酚單加氧酶純酶)轉化異丁香酚生產香草醛的實施例如下:
[0053]實施例三
[0054]在50mL的錐形瓶中，加入0.4g異丁香酚，異丁香酚單加氧酶lg，加入9mL的ρΗΙΟ.4的甘氨酸濃度為10mM的甘氨酸/NaOH緩沖液，DMSOlmL，以兩層紗布覆口，在28°C，200rpm下搖床振搖轉化48h,測定最終反應液中香草醒的濃度為2.4g/L。
[0055]香草醛的測定方法:
[0056]以高效液相色譜法(HPLC)測定香草醛和異丁香酚。
[0057]樣品處理:反應液加入與反應液同體積的乙醇，沉淀蛋白(異丁香酚單加氧酶)，并溶解底物(異丁香酚)和產物(香草醛)，10, 000r/min離心5min，再以乙醇稀釋10-20倍(本例中稀釋10倍)，濾膜過濾，待測。
[0058]色譜柱:Lichrospher100RP-18柱(250mmX 4mmX 5 μ m)；
[0059]流動相:體積比為13:7的甲醇和0.0I % (體積分數)冰醋酸水溶液；[0060]流速lmL/min,波長280nm處紫外檢測,進樣量10 μ L。其中香草醒和異丁香酹的出峰時間分別為3min和9min左右。
[0061]實施例四
[0062]在50mL的錐形瓶中，加入0.4g異丁香酚，異丁香酚單加氧酶lg，加入9mL的ρΗΙΟ.4的10mM甘氨酸/NaoH緩沖液，1-乙基-3-甲基咪唑硫酸甲酯鹽60 μ L，以兩層紗布覆口，28°C，200rpm搖床振搖轉化48h，測定最終反應液中香草醛的濃度為3.0g/L。
[0063]實施例五
[0064]在50mL的錐形瓶中，加入0.4g異丁香酚，異丁香酚單加氧酶lg，加入9mL的ρΗΙΟ.4的10mM甘氨酸/NaoH緩沖液，殼聚糖膜0.3g，以兩層紗布覆口，28 °C，200rpm搖床振搖轉化48h，反應結束將樣品瓶中的膜取出，以1mL的去離子水沖洗，再加入30mL的17.6% (體積分數)的鹽酸洗脫10h。測定洗脫液中香草醛的濃度為5g/L。
[0065]該實施例中的殼聚糖膜的制備如下: [0066]1.稱取3g的殼聚糖粉末溶于150mL2% (體積分數)的醋酸溶液中，室溫下磁力攪拌5-6h充分溶解，得到明黃色的粘稠狀膠體。
[0067]2.用注射器將步驟I獲得的膠體擠入并平鋪于圓形的塑料培養(yǎng)皿中(每盤約12mL膠體)，_80°C冰箱中預凍12h，于凍干機中凍干24h。
[0068]3.將凍干的殼聚糖膜剪成小塊(每塊0.1g);在3% (質量分數)的NaOH溶液中浸泡8h后以去離子水洗至中性，平攤于兩層紗布上，室溫風干，樣品袋中密封干燥保存，備用。
[0069]以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬【技術領域】的技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種用于生產異丁香酚單加氧酶的大腸埃希氏菌，其特征在于:所述大腸埃希氏菌命名為 BL21 (DE3) IEM-PP，保藏編號為 CGMCC N0.8918。
2.權利要求1所述的大腸埃希氏菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)提取土壤的全基因組DNA; (2)根據異丁香酚單加氧酶的基因序列，設計PCR引物，所述PCR引物包括上游引物SEQID N0.1 和下游引物 SEQ ID N0.2 ； (3)以所述全基因組DNA為模板，用步驟⑵中的PCR引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，切膠回收得到大小為1438bp的目標基因SEQ ID N0.3 ； (4)將目標基因SEQID N0.3插入T載體pET21 (a)的Ndel和XhoI酶切位點之間，得到重組質粒PET21(a)-1EM; (5)將重組質粒PET21(a) -1EM轉化得到所述大腸埃希氏菌。
3.—種權利要求1所述的大腸埃希氏菌在生產異丁香酚單加氧酶中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，包括如下步驟: (1)將權利要求1所述的大腸埃希氏菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，得到菌濃度OD6tltol=0.1-0.2的發(fā)酵初始體系 ； (2)將所述發(fā)酵初始體系進行如下發(fā)酵:先在35-37°C下振蕩培養(yǎng)3-5小時，然后加入IPTG至IPTG在所述述發(fā)酵初始體系中的終濃度為50-100 μ Μ，然后在25_30°C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12-48小時，得到氨基酸序列為SEQ ID N0.4的異丁香酚單加氧酶。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基pH為7.0-7.2，包括10-15g/L胰蛋白胨、15-23g/L酵母提取物、5-10g/L氯化鈉、10-15g/L甘油、10-17mM磷酸二氫鉀和65-75mM磷酸氫二鉀,余量為水。
6.如權利要求4或5所述的應用，其特征在于:所述大腸埃希氏菌以種子液的形式用移液器接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基，所述種子液占所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積分數為0.5-2%，所述種子液是將所述大腸埃希氏菌接種至種子培養(yǎng)基，35-37°C振蕩培養(yǎng)至菌濃度OD6tltlnm = 3-6形成。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基pH為7.0-7.2，包括10-15g/L胰蛋白胨、5-8g/L酵母提取物、5-10g/L氯化鈉余量為水。
8.一種香草醛的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:按異丁香酚:異丁香酚單加氧酶:緩沖液=0.1~0.4g:0.2~1.2g:9~18mL加入反應容器中，在20~28°C下振搖轉化12~48h，得到香草醛；所述異丁香酚單加氧酶由權利要求3-7任意一項所述的應用制備得到，所述緩沖液為PH8~10.4的甘氨酸/NaOH水溶液。
9.如權利要求8所述的制備方法，其特征在于:在所述反應容器中，還添加DMS0、離子液體和香草醛吸附劑中的至少一種；每0.1~0.4g異丁香酚中:所述DMSO的加入量≤ImL,所述離子液體的加入量≤100 μ L，香草醛吸附劑的加入量≤0.6g。
10.如權利要求9所述的制備方法，其特征在于:所述香草醛吸附劑為樹脂和殼聚糖膜中的至少一種。
【文檔編號】C12N9/02GK104031873SQ201410204528
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權日:2014年5月14日
【發(fā)明者】趙麗青, 馬田田, 吳序櫟, 李小曼, 宋江寧 申請人:深圳大學