C-bf保護(hù)小鼠及人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系潰瘍性結(jié)腸炎綜合模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種C-BF保護(hù)小鼠及人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系潰瘍性結(jié)腸炎綜合模型。金環(huán)蛇抗菌肽cathelicin-BF具有廣譜抗菌活性，特別是對(duì)革蘭氏陰性菌。炎癥性腸?。↖BDs），包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和節(jié)段性結(jié)腸炎（CD），其病理機(jī)制尚不清楚。本發(fā)明1）對(duì)于小鼠，建立3%葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型；小鼠直腸注射C-BF的PBS溶液，每天一次，C-BF的劑量是5mg／kg，注射持續(xù)1周，實(shí)驗(yàn)期每天稱重記錄體重?cái)?shù)據(jù)，并觀察小鼠直腸出血，糞便成型情況；2）對(duì)于Caco-2細(xì)胞，培養(yǎng)基中抗菌肽C-BF的濃度為25ug/ml，抗菌肽處理Caco-2細(xì)胞24h后用3%DSS處理24h。
【專利說(shuō)明】C-BF保護(hù)小鼠及人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系潰瘍性結(jié)腸炎綜合模型

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及C-BF抗菌肽對(duì)UC小鼠的保護(hù)作用。

【背景技術(shù)】
[0002]IBD是炎癥性腸疾病的簡(jiǎn)稱，包括潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性結(jié)腸炎，其病理機(jī)制尚不清楚。IBD被定義為慢性復(fù)發(fā)性胃腸道炎癥。最近有研究表明，各種免疫，遺傳和環(huán)境因素會(huì)影響結(jié)腸炎的萌生、進(jìn)展。在西方國(guó)家IBD的發(fā)病率更高，然而，由于西方生活方式的影響IBD在世界上其他地區(qū)的發(fā)病率也越來(lái)越高。潰瘍性結(jié)腸炎，是一種與結(jié)腸粘膜表面炎癥相關(guān)的慢性胃腸疾病，人感染潰瘍性結(jié)腸炎可能轉(zhuǎn)變成人類的第三大惡性腫瘤——大腸癌。
[0003]抗菌肽有兩大家族:Cathelicidin和β -防御素,前者已具備先天免疫反應(yīng)防止宿主感染微生物的抗菌功能。起源于Cathelicidin的抗菌肽具有抗菌、抗病毒和抗真菌作用。Cathelicidin中廣泛報(bào)道的抗菌肽LL-37來(lái)源于人，而mCRAMP是鼠源抗菌肽，代表鼠種。Cathlicidin-BF，來(lái)源于金環(huán)蛇，是一種新的抗菌肽，據(jù)報(bào)道C-BF具有廣譜抗菌活性，特別是對(duì)革蘭陰性細(xì)菌。Cathlicidin-BF可以成為尋常性痤瘡的有效治療藥物(plosone)。迄今為止，C -BF的非抗菌活性機(jī)制導(dǎo)致的其他潛在生物醫(yī)學(xué)功能研究尚處于空白階段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是通過(guò)活體小鼠模型和體外Caco-2細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞模型檢測(cè)Cathelicidin-BF調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的作用。研究結(jié)果顯示結(jié)腸給藥外源性Cathelicidin-BF顯著降低DSS引起的炎癥反應(yīng)和腸屏障功能的損害。體內(nèi)和體外結(jié)果結(jié)合，我們還發(fā)現(xiàn)Cathelicidin-BF可以通過(guò)抑制NF-K B通路的激活降低DSS引起的炎癥。目前，IBD的治療主要是僅限于暫時(shí)性緩解炎癥反應(yīng)，而且，結(jié)腸炎癥最終極有可能導(dǎo)致結(jié)腸癌，因此，我們迫切需要一個(gè)更安全和更有效的治療和預(yù)防IBD的藥物，抗菌肽作為一個(gè)潛在的抗生素替代品可能是理想的選擇。
[0005]一種抗菌肽C-BF保護(hù)小鼠及人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系潰瘍性結(jié)腸炎綜合模型，
[0006]I)對(duì)于小鼠，建立3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型；小鼠直腸注射C-BF的PBS溶液，每天一次，C-BF的劑量是5mg/kg，注射持續(xù)I周，實(shí)驗(yàn)期每天稱重記錄體重?cái)?shù)據(jù)，并觀察小鼠直腸出血，糞便成型情況；
[0007]2)對(duì)于Caco-2細(xì)胞，培養(yǎng)基中抗菌肽C-BF的濃度為25ug/ml，抗菌肽處理Caco_2細(xì)胞24h后用3% DSS處理24h ;進(jìn)一步，
[0008]3)對(duì)于小鼠，熒光標(biāo)記C-BF，濃度為2mg/ml，直腸注射，通過(guò)活體成像、HE染色、免疫熒光、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞儀、Tunnel、ELISA、利用細(xì)胞電阻儀對(duì)跨上皮電阻值進(jìn)行測(cè)定、western-blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)方法；
[0009]4)對(duì)于Caco-2細(xì)胞，利用細(xì)胞電阻儀對(duì)跨上皮電阻值進(jìn)行測(cè)定，Western_blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)方法；
[0010]5)綜合體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)C-BF在緩解炎癥、降低細(xì)胞凋亡水平以及改善腸道屏障功能的作用。
[0011]本發(fā)明的有益效果在于:
[0012]3% DSS給藥7天后，與其他組相比，DSS模型組結(jié)腸炎更嚴(yán)重，同時(shí)結(jié)腸黏膜中的mCRAMP表達(dá)升高。與DSS組相比，C-BF+DSS組結(jié)腸上皮形態(tài)在很大程度上得到緩解，血液中B、T、巨噬細(xì)胞的比例恢復(fù)到正常水平，血清中促炎性細(xì)胞因子(TNF-α，IL-6，IL_8)和抗炎因子IL-10的蛋白水平和這些細(xì)胞因子的mRNA水平顯著降低。通過(guò)免疫組化，我們發(fā)現(xiàn)，與DSS組相比，C-BF+DSS組細(xì)胞凋亡指標(biāo)和炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)指數(shù)在結(jié)腸上皮細(xì)胞明顯減弱，炎癥相關(guān)的C0X-2和INOS的酶活性明顯下降。同時(shí)，我們對(duì)經(jīng)典的下游信號(hào)因子(c-jun and NF-kB)磷酸化水平進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)DSS可以激活這兩個(gè)典型的轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化水平而C-BF能有效抑制NF-κ B的磷酸化(P65)但不能抑制c-jun的磷酸化。與DSS組相比，回腸中段SlgA的分泌量和血清中IgA，G，M的分泌水平明顯升高。另一方面，我們分析了 C-BF對(duì)腸粘膜屏障功能的影響，通過(guò)對(duì)血清中異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖的熒光強(qiáng)度以及結(jié)腸上皮的跨膜上皮電阻值的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)C-BF能有效降低腸道通透性增加和顯著上調(diào)由DSS引起的屏障功能相關(guān)基因表達(dá)水平，Caco-2細(xì)胞模型的建立進(jìn)一步驗(yàn)證體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果,綜合評(píng)價(jià)，C-BF可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道免疫功能，緩解腸上皮細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腸粘膜屏障功能減輕DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為利用活體成像技術(shù)確認(rèn)抗菌肽C-BF可以被腹膜吸收情況；
[0014]圖2為建立3% DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，分兩種處理，一種是自由飲用無(wú)菌水(對(duì)照組，C-BF組)或自由飲用溶有DSS的水(DSS組，C-BF+DSS組)I周，另一種處理是C-BF組和C-BF+DSS組直腸注射C-BF (溶于PBS)或?qū)φ战M和DSS組單獨(dú)注射PBS。
[0015]圖3-1為小鼠大腸段出血狀況；圖3-2為日增重；圖3-3為結(jié)腸長(zhǎng)度；圖3_4為結(jié)腸重量；圖3-5為結(jié)腸長(zhǎng)度/重量；圖3-6為疾病活動(dòng)指數(shù)；
[0016]圖4-1為結(jié)腸組織HE染色(100X);圖4-2為結(jié)腸組織HE染色(400 X)；
[0017]圖5-1為回腸組織HE染色(200 X);圖5-2為回腸組織HE染色(40 X);圖5-3為回腸組織HE染色(200 X)；
[0018]圖6-1為巨噬細(xì)胞的比例；圖6-2為T淋巴細(xì)胞的比例；圖6-3為B淋巴細(xì)胞的比例；圖6-4為NK細(xì)胞的比例；
[0019]圖7-1為結(jié)腸組織的免疫熒光染色(200 X);圖7-2為Western-blot分析mCRAMP的表達(dá)量，泳道I為DSS組，泳道2為對(duì)照組；圖7-3為回腸組織的免疫熒光染色(200X)；
[0020]圖8-1為小鼠血清中TNF-α的表達(dá)量；圖8_2為小鼠血清中IL_6的表達(dá)量；圖8-3為小鼠血清中IL-8的表達(dá)量；圖8-4為小鼠血清中IL-10的表達(dá)量；
[0021]圖8-5為TNF- a /GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；圖8-6為IL-6/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；圖8-7為IL-8/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；圖8-8為IL-10/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；
[0022]圖9-1為小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行TUNNEL免疫組化染色(400 X);圖9_2為小鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)；
[0023]圖10-1為小鼠結(jié)腸組織中INOS的濃度；圖10_2為小鼠結(jié)腸組織中C0X-2的濃度；圖10-3為Western-blot分析相關(guān)基因的表達(dá)量；
[0024]圖11-1為結(jié)腸組織的免疫熒光染色(⑶177400X);圖11_2為中性粒細(xì)胞入侵指數(shù)；圖11-3為結(jié)腸組織的免疫熒光染色(F4/80400X);圖11_4為巨噬細(xì)胞入侵指數(shù)；圖
11-5為MPO酶活性的測(cè)定；圖11-6為NAG酶活性的測(cè)定；圖11_7為EPO酶活性的測(cè)定；
[0025]圖12-1為血清中SlgA的濃度；圖12_2為血清中IgA的濃度；圖12_3為血清中IgG的濃；
[0026]圖12-4為血清中IgM的濃度；
[0027]圖13-1為血清中FITC-葡聚糖的濃度；圖13-2為TEER ;圖13-3為結(jié)腸組織的免疫熒光染色(Z01200X);圖13-4為小鼠血清中Z01/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；圖13_5為小鼠血清中Z02/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；圖13-6為小鼠血清中Claudin-1/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；圖13-7為小鼠血清中Mucinl/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；圖13_8為小鼠血清中Mucin2/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；
[0028]圖14-1為TEER ;圖14-2為TER ;圖14-3為小鼠血清中Z01/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；圖14-4為小鼠血清中Claudin-1/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；圖14_5為小鼠血清中Occludin/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量；圖14-6 為Western-blot分析相關(guān)基因的表達(dá)量。

【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述，實(shí)施例僅是描述而非限定本發(fā)明。
[0030]1:我們首先利用活體成像技術(shù)確認(rèn)抗菌肽C-BF可以被腹膜吸收，但在體內(nèi)存留24h后代謝完全。圖1為利用活體成像技術(shù)確認(rèn)抗菌肽C-BF被腸腔吸收情況；從圖1中我們可以確認(rèn)C-BF在大約10分內(nèi)由腸腔遍及全身，然而24h內(nèi)C-BF代謝或排出體內(nèi)，因此每次注射C-BF不應(yīng)超過(guò)24小時(shí)；
[0031]2:在此基礎(chǔ)上我們建立3% DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，實(shí)驗(yàn)分組與設(shè)計(jì)如圖2:
[0032]C-BF劑量:5mg/kg小鼠體重，C-BF終濃度為200 μ g/ml，DSS劑量:3% (m/v)潰瘍性結(jié)腸炎模型建立如上所述，四組分別為對(duì)照組、DSS組、C-BF組和C-BF+DSS組，分兩種處理，一種是自由飲用蒸餾水或溶有DSS的水，另一種處理是直腸注射C-BF或PBS作為對(duì)照，小鼠第8天處死。
[0033]3:實(shí)驗(yàn)期每天稱重記錄體重?cái)?shù)據(jù)，并觀察小鼠直腸出血，糞便成型情況，精神狀態(tài)。
[0034]各大大腸段出血狀況(圖3-1):
[0035]在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，第6天對(duì)照組、DSS組拍照驗(yàn)證模型建立成功，照片上肛門處我們可以發(fā)現(xiàn)DSS組有明顯的血跡，而對(duì)照組正常。隨后，處死這兩組小鼠，發(fā)現(xiàn)大腸(盲腸，結(jié)腸，直腸)嚴(yán)重出血，并從日增重和結(jié)腸長(zhǎng)度/重量比的數(shù)據(jù)確認(rèn)建模成功。
[0036]從圖3-2、圖3-3、圖3_4、圖3_5、圖3_6中我們發(fā)現(xiàn)DSS組結(jié)腸長(zhǎng)度/重量比顯著降低，而C-BF+DSS組癥狀改善，與對(duì)照組水平幾乎一致，DSS組疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI，糞便成型情況，結(jié)腸出血、體重的綜合評(píng)分)一天比一天惡化，而C-BF+DSS組在一定程度上衰減。
[0037]4:在此基礎(chǔ)上，我們采取結(jié)腸中段多聚甲醛固定后首先進(jìn)行HE染色觀察:
[0038]通過(guò)在100倍光鏡下(圖4-1)觀察結(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)現(xiàn)DSS處理后結(jié)腸粘膜層腸上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，且粘膜下層出現(xiàn)明顯的水腫現(xiàn)象，而加入抗菌肽C-BF后其腸上皮形態(tài)得到一定程度的恢復(fù)，且粘膜下層水腫情況明顯緩解。
[0039]進(jìn)一步我們放大到400倍光鏡下(圖4-2)，同樣發(fā)現(xiàn)DSS組粘膜層腸上皮組織形態(tài)破壞嚴(yán)重，而加入抗菌肽C-BF后其形態(tài)在一定程度上得到了改善。
[0040]5:同樣，我們采取了回腸中段進(jìn)行固定HE染色觀察:
[0041]首先我們?cè)?00倍光鏡下(圖5-1)發(fā)現(xiàn)DSS處理組回腸上皮組織分泌強(qiáng)度與對(duì)照組相比明顯增強(qiáng)，邊緣有很多分泌細(xì)胞聚集。說(shuō)明此處有炎癥發(fā)生。
[0042]同時(shí)，我們分別在40 (圖5-2)和200倍(圖5-3)對(duì)回腸組織進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，DSS組回腸上皮長(zhǎng)度嚴(yán)重變短，而加入抗菌肽后其長(zhǎng)度有了明顯的增加。
[0043]6:進(jìn)一步，我們對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶取血，全血除去紅細(xì)胞后進(jìn)行流式分析B，T，巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞的比例，我們發(fā)現(xiàn)DSS處理后顯著抑制了 B，T，巨噬細(xì)胞的比例，而加入抗菌肽后三種免疫細(xì)胞的比例明顯提升(圖6-1、圖6-2、圖6-3、圖6-4)。
[0044]7:同時(shí) ，我們對(duì)小鼠結(jié)腸中段的內(nèi)源性抗菌肽mCRAMP的表達(dá)豐度進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在200倍情況下(圖7-1、圖7-2、圖7-3)，DSS處理組mCRAMP的表達(dá)豐度明顯升高，而加入抗菌肽處理后其表達(dá)豐度顯著降低，而有研究報(bào)道，小鼠內(nèi)源抗菌肽的高表達(dá)與炎癥的發(fā)生成正相關(guān)。
[0045]8:通過(guò)ELISA對(duì)小鼠血清中促炎因子TNF-a，IL-6，IL-8，抑炎因子IL-10進(jìn)行檢測(cè)(圖8-1、圖8-2、圖8-3、圖8-4)，同時(shí)對(duì)結(jié)腸組織提取RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)(圖8_5、圖8-6、圖8-7、圖8-8)，結(jié)果表明，DSS處理組炎性細(xì)胞因子顯著提高，而加入抗菌肽C-BF后炎性因子的分泌水平顯著下降，基因表達(dá)水平與血清蛋白水平一致。
[0046]9:對(duì)小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行TUNNEL免疫組化染色(圖9_1)，檢測(cè)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明DSS處理顯著增加了細(xì)胞凋亡水平(棕色)，而加入抗菌肽C-BF后其凋亡指數(shù)顯著下降(圖9-2)。
[0047]10:對(duì)小鼠結(jié)腸組織的炎性相關(guān)酶活進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DSS組INOS和C0X-2的酶活顯著提高(圖10-1、圖10-2)，而加入抗菌肽后其酶活水平明顯下降，進(jìn)一步提取組織蛋白進(jìn)行Western-blot分析發(fā)現(xiàn)(圖10_3)，DSS通過(guò)對(duì)MAPK和NF_kB信號(hào)通路途徑的激活上調(diào)炎性相關(guān)酶活及細(xì)胞因子的表達(dá)，而C-BF可能是通過(guò)抑制NF-kB (p65)的磷酸化下調(diào)炎性相關(guān)酶活，同時(shí)可能與上述幾種細(xì)胞因子的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
[0048]11:進(jìn)一步通過(guò)⑶177嗜中性粒細(xì)胞(圖11-1)，F(xiàn)4/80巨噬細(xì)胞的特異性抗體對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行免疫組化(圖11-3)，分析嗜中性粒細(xì)胞入侵腸組織情況(圖11-2、圖11-4)，同時(shí)，提取結(jié)腸組織總蛋白用于標(biāo)志性酶活的檢測(cè)(圖11-4、(圖11-5、圖11-6、圖11-7)，結(jié)合免疫組化和酶活的數(shù)據(jù)表明，DSS處理嗜中性粒細(xì)胞入侵明顯增加，而加入抗菌肽后一定程度上緩解了這一現(xiàn)象，同時(shí)，測(cè)定MPO這一嗜中性粒細(xì)胞標(biāo)志性酶活結(jié)果與組化結(jié)果保持一致。檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞標(biāo)志性酶活EPO發(fā)現(xiàn)其表達(dá)規(guī)律與MPO —致，同時(shí)檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志性酶活，但發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與免疫組化的結(jié)果不一致，但與文獻(xiàn)報(bào)道一致。
[0049]12:同時(shí)提取近盲端回腸總蛋白，分離血清，測(cè)定結(jié)果表明，DSS處理組回腸SlgA的分泌水平顯著降低(圖12-1)，血清中IgA，G，M三抗體的水平明顯受到抑制，加入抗菌肽處理后其slgA分泌水平和三種免疫球蛋白水平均有一定程度升高(圖12-2、圖12-3、圖
12-4)。
[0050]13:同時(shí)，我們對(duì)抗菌肽在屏障方面的作用進(jìn)行檢測(cè)，主要分為4個(gè)分實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)一為取樣前2h直腸注射FITC標(biāo)記的葡聚糖，通過(guò)檢測(cè)血清中FITC濃度間接評(píng)價(jià)腸道通透性(圖13-1)，實(shí)驗(yàn)二為實(shí)驗(yàn)時(shí)，取結(jié)腸鮮活組織Icm2左右，利用USING Champer進(jìn)行腸道跨膜上皮電阻值變化趨勢(shì)測(cè)定(圖13-2)，實(shí)驗(yàn)三為取結(jié)腸組織，4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行屏障緊密連接蛋白ZO-1的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其表達(dá)豐度(圖13-3)。實(shí)驗(yàn)四為提取結(jié)腸組織RNA，進(jìn)行相關(guān)緊密連接蛋白的基因表達(dá)水平檢測(cè)(圖13-4、圖13-5、圖13-6、圖13-7、圖13-8)。實(shí)驗(yàn)一的結(jié)果表明，DSS處理后，其熒光強(qiáng)度顯著提高，證明腸道屏障受到破壞，而加入抗菌肽后其熒光強(qiáng)度顯著降低，說(shuō)明其屏障功能得到了一定改善，結(jié)合實(shí)驗(yàn)二的結(jié)果表明，DSS處理腸跨膜上皮電阻值顯著下降，對(duì)應(yīng)腸道通透性明顯上升，而抗菌肽處理組明顯提高了跨膜上皮電阻值，間接反映其腸道屏障功能得到改善。從實(shí)驗(yàn)三可以看出，DSS處理后緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)豐度明顯降低，抗菌肽處理組表達(dá)豐度有所提高，實(shí)驗(yàn)三結(jié)合實(shí)驗(yàn)四的結(jié)果表明，DSS處理顯著下調(diào)了緊密蛋白相關(guān)基因Claudin-1，ZO-1, Z0-2的基因表達(dá)，與腸上皮屏障功能密切相關(guān)的粘蛋白mucin-l，2的表達(dá)水平也受到抑制，而加入抗菌肽處理后，五種基因的表達(dá)水平都得到了顯著上調(diào)。
[0051]14:為進(jìn)一步對(duì)抗菌肽C-BF的作用機(jī)制進(jìn)行研究，接著建立細(xì)胞模型，屏障功能以Caco-2細(xì)胞為模型，首先，我們通過(guò)細(xì)胞增殖率實(shí)驗(yàn)對(duì)抗菌肽和DSS的作用濃度進(jìn)行了初步篩選，結(jié)果選擇抗菌肽C-BF的濃度為25ug/ml，DSS的濃度為3%，我們利用Transwell小室將Caco-2細(xì)胞種于小室中連續(xù)培養(yǎng)21d致形成穩(wěn)定的似單層上皮組織樣形態(tài)(即電阻值穩(wěn)定)，然后用抗菌肽處理細(xì)胞24h后用3% DSS處理24h，利用細(xì)胞電阻儀對(duì)跨上皮電阻值進(jìn)行測(cè)定，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，對(duì)屏障相關(guān)蛋白進(jìn)行基因與蛋白水平檢測(cè)，結(jié)果與小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致(圖14-1、圖14-2、圖14-3、圖14_4、圖14_5、圖14_6)。
[0052]最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上內(nèi)容僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)行的若干改進(jìn)與潤(rùn)飾，均視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0053]本發(fā)明探究抗菌肽C-BF對(duì)腸道炎癥UC模型的作用。
[0054]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案:
[0055]建立3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，通過(guò)活體成像、HE染色、免疫熒光、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞儀、Tunnel、ELISA、western-blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)方法，探究C-BF對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的作用。在體外，我們研究C-BF對(duì)Caco-2細(xì)胞細(xì)胞系的作用。
[0056]C-BF 和 DSS 的制備:
[0057]CatheIicidin-BF (C-BF)由中肽生化有限公司(中國(guó)杭州)合成和純化，其分子量以α-氰基-4-羥基肉桂酸作為基質(zhì)通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-TOF MS7Model Autoflex，布魯克道爾頓公司，美國(guó))測(cè)定。通過(guò)反相-高效液相色譜法分析肽的純度在95%以上。肽溶解于PBS緩沖液中，濃度為200μ μ g/ml，使用前_80°C儲(chǔ)存。葡聚糖硫酸鈉(簡(jiǎn)稱DSS)購(gòu)自MP (美國(guó))，分子量為36000-50000Da，以3%溶于無(wú)菌水，(3g DSS/100ml無(wú)菌水)。
[0058]潰瘍性結(jié)腸炎誘導(dǎo)后通過(guò)DAI評(píng)分系統(tǒng)測(cè)定C-BF的效果:
[0059]試驗(yàn)分組為對(duì)照組，DSS組C-BF組，C-BF+DSS組，預(yù)飼I周后，誘導(dǎo)I周，分兩種處理，一種是自由飲用無(wú)菌水(對(duì)照組，C-BF組)或自由飲用溶有DSS的水(DSS組，C-BF+DSS組)I周，另一種處理是C-BF組和C-BF+DSS組直腸注射C-BF(溶于PBS)或?qū)φ战M和DSS組單獨(dú)注射PBS，每天一次，注射持續(xù)I周，C-BF的劑量是5mg/kg，總注射量為500ul。實(shí)驗(yàn)期每天稱重記錄體重?cái)?shù)據(jù)，并觀察小鼠直腸出血，糞便成型情況。DAI代表這三個(gè)指數(shù)的平均值。
[0060]利用生物發(fā)光成像對(duì)C-BF吸收進(jìn)行評(píng)價(jià):
[0061]六只C57/BL6雄性小鼠分為三組，分別直腸注射10ul PBS, FITC，F(xiàn)ITC-C-BF,濃度為2mg/ml，直腸注射FITC-C-BF后的10分鐘、30分鐘、2小時(shí)、24小時(shí)分別腹腔注射鎮(zhèn)定劑戊巴比妥鈉，然后打開生物發(fā)光成像機(jī)和熒光光源的電源，點(diǎn)擊活體成像圖標(biāo)，IVIS系統(tǒng)初始化，機(jī)器初始化并且溫度狀態(tài)燈從紅色變成綠色后，把麻醉小鼠放置在觀察處，關(guān)上門，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488nm和525nm，選擇熒光模型和設(shè)置曝光時(shí)間和分級(jí)值，F(xiàn)/停止值被設(shè)置為2，然后獲得相應(yīng)的圖片，包括熒光圖像和激光數(shù)據(jù)。
[0062]組織病理學(xué)評(píng)估:
[0063]腸組織取自五只小鼠，每組一只，進(jìn)行組織學(xué)測(cè)量?；啬c中段和結(jié)腸全層段切下并縱向剖開，立即固定于4%多聚甲醛溶液，石蠟包埋，HE染色。上皮形態(tài)特征通過(guò)徠卡NEWDM4500BR顯微鏡放大不同倍數(shù)觀察。
[0064]流式細(xì)胞儀分析免疫細(xì)胞(B，T淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞):
[0065]眼眶取血置于含有肝素鈉(Sangong中國(guó)上海)的L 5ml管中，取血50ul與特定的表面抗體混合，該混合物在室溫避光孵育15分鐘，抗體⑶3 (PE-Cy5)，⑶45R(FITC)，CD49B (PE)，F(xiàn)4/80 (PE)購(gòu)自(聯(lián)科，中國(guó)上海)，用量分別為 0.25ug/5ul, 0.5ug/5ul，
0.5ug/5ul，0.25ug/5ul，然后加入I XFCM裂解液，室溫避光孵育10分鐘，300_400g離心5min,棄上清，2ml PBS重懸，300-400g離心5min，棄上清，500ul PBS重懸，流式細(xì)胞儀熒光分析。
[0066]結(jié)腸組織免疫熒光和免疫組化染色:
[0067]mCRAMP (Abeam美國(guó))和Z0-1 (Abeam美國(guó))免疫熒光分析，首先，用含有I % w/vBSA的PBS封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)30分鐘，然后以1: 1000比例將兔多克隆抗體加入到Cathelicidin抗體中，以1: 500比例將兔多克隆抗體加入到ZO-1抗體中，溶液為含1%w/vBSA的PBS，切片4°C孵育過(guò)夜，PBS洗5次，每次3分鐘，然后用吸水紙擦干標(biāo)本周圍的PBS,以1: 100比例加入TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(JIR美國(guó))，室溫避光孵育lh，再次洗滌二抗，然后用DAPI細(xì)胞核染色，最后，洗去未結(jié)合的DAPI，甘油封片，立即用熒光顯微鏡觀察染色切片。
[0068] ⑶177和F4/80免疫組化分析，首先，用含有I % w/v BSA的PBS封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)30分鐘，然后以1: 100比例將羊多克隆抗體加入到⑶177 (Santa美國(guó))抗體中，以I: 100比例將羊多克隆抗體加入到F4/80 (Santa美國(guó))抗體中，溶液為含I % w/v BSA的PBS，切片4°C孵育過(guò)夜，PBS洗5次，每次3分鐘，然后用吸水紙擦干標(biāo)本周圍的PBS，以I: 100比例加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgGCJIR美國(guó))，4°C孵育lh，PBS沖洗三次，然后加入50-100ul DAB(DAK0美國(guó))，顏色形成后，蘇木素抑制切片，用70-100%不同梯度的酒精脫水，每個(gè)梯度10分鐘，后用二甲苯使切片透明，中性樹膠封片。評(píng)價(jià)組織中細(xì)胞凋亡水平，石蠟切片脫蠟、水化和抗原修復(fù)，的TDT和TUNEL (試劑盒，羅氏美國(guó))以1: 9的比例混合，37°C孵育60min后，那盒子保持濕度。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉，切片干燥，轉(zhuǎn)化劑-POD(試劑盒，羅氏美國(guó))覆蓋組織，37°C孵育30分鐘，PBS洗三次，添加DAB，蒸餾水終止顯色，細(xì)胞核復(fù)染，切片脫水并封片。
[0069]血清中細(xì)胞因子FITC-葡聚糖，IgA，IgG, IgM,回腸末端SIgA分泌水平和結(jié)腸中MPO, EPO, NAG酶活性的測(cè)量:
[0070]血清中細(xì)胞因子TNF- a，IL-6, IL-8, IL-10的檢測(cè)用ELISA試劑盒(博士德，中國(guó)武漢)。測(cè)定過(guò)程如下:用10ul標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)樣品加入到相應(yīng)的抗體包被酶標(biāo)板，37°C反應(yīng)90分鐘，棄板中液體，加入10ul TNFa，IL-6，IL-8，IL-10抗體，37°C反應(yīng)60分鐘，PBS洗板三次，各孔加入ABC工作液，37 V反應(yīng)30分鐘，再次用PBS洗板，加入預(yù)混的TMB底物溶液，37°C反應(yīng)25分鐘，加入TMB終止液，在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定OD值。
[0071]間接定量測(cè)定腸道通透性，采血前4小時(shí)注射FITC-葡聚糖200ul至結(jié)腸，眼眶靜脈采血，避光將血清加入至96孔板中，然后用酶標(biāo)儀(spectramax M5Molecular devices,美國(guó))檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為488nm和525nm。
[0072]血清中細(xì)胞因子IgA，IgG, IgM,回腸末端SIgA分泌水平和結(jié)腸中MP0，EP0，NAG酶活性的測(cè)量使用ELISA試劑盒(R&D美國(guó))，簡(jiǎn)單的操作步驟如下:50ul標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入抗體包被酶標(biāo)板，各孔加入50ul酶標(biāo)試劑，37°C孵育lh，棄殘?jiān)?，洗滌液洗?次，各孔先后加入50uL顯色劑A和B，避光37°C孵育15分鐘。取出板，加入50ul終止液，測(cè)定然450nm 處 OD 值。
[0073]結(jié)腸中INOS和C0X-2酶活性測(cè)定
[0074]結(jié)腸中INOS和C0X-2酶活性測(cè)定，使用相應(yīng)的INOS和C0X-2的ELISA試劑盒(B1value英國(guó))。操作如下:組織的制備，用RIPA裂解液(博士德中國(guó)武漢)提取結(jié)腸組織總蛋白和BCA試劑盒(凱基中國(guó)南京)檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度、定量，50uL標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入到抗體包被酶標(biāo)板，各孔加入25ul酶標(biāo)試劑，銀紙包被和37°C孵育lh，清洗液洗板五次，依次加入50ul底物一、底物二，避光孵育15分鐘，然后加入50ul終止液終止反應(yīng)，30分鐘內(nèi)測(cè)定450nm處OD值。
[0075]電生理學(xué)測(cè)量
[0076]采用先前所描述的改進(jìn)的尤斯灌流室(VCC MC6，PI)測(cè)量跨膜電位。切下小鼠結(jié)腸組織，立即浸在含氧的Kreb緩沖液中，放入尤斯灌流室(世界精密儀器；毒品科學(xué)，密西沙加市，安大略，加拿大)。37°C下，流室組織表面0.6平方厘米浸在8U ml的循環(huán)氧中的Kreb緩沖區(qū)中。漿膜緩沖液中含有1ml葡萄糖作為能量來(lái)源，而黏膜緩沖液中含有1ml甘露醇來(lái)平衡滲透壓。灌流室含有瓊脂鹽橋監(jiān)測(cè)不同組織兩端的電位差，通過(guò)自動(dòng)電壓鉗指示，注入所需的Isc保持零電位差。組織電導(dǎo)，相當(dāng)于被動(dòng)滲透離子，由歐姆定律計(jì)算出。作為組織電阻的逆推措施，ISC的基線值指示凈離子分泌和電導(dǎo)，腸段平衡20分鐘后記錄。
[0077]caco-2細(xì)胞以5 X 15在transwell板中培養(yǎng)，37V，5%的二氧化碳，95%的濕度，每隔一天更換培養(yǎng)基。每天用電阻表測(cè)定電阻值直到電阻值趨于穩(wěn)定，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。上層和基底分別添加0.5ml和1.5ml新鮮培養(yǎng)基，上層添加終濃度25 μ g/ml C-BF,孵育24h，然后用D-Hanks洗去C-BF，換新鮮培養(yǎng)基并加入終濃度3% (m/v) DSS，放入孵化器中培養(yǎng)，每隔2小時(shí)測(cè)定各孔的電阻值。
[0078]分析Western blot
[0079]研磨結(jié)腸中段，用總蛋白提取試劑盒(凱基中國(guó)南京)的完全抑制蛋白酶混合物溶解。各組織蛋白質(zhì)含量進(jìn)行定量稀釋后確保7.5% /10%的SDS-PAGE凝膠每孔含有30yG蛋白。蛋白通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，TBS配置的5% (w/v)的脫脂奶粉封閉，一抗(NF-K B P65, p-p65, c-jun, P-c-jun, Santa Cruze 美國(guó))4?孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗孵育，顯色。
[0080]分離RNA和熒光定量PCR
[0081]Trizol 試劑((Invitrogen Corporat1n, Carlsbad, CA)分離提取總 RNA, M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Fermentas, EU, Glen Burnie, Maryland, USA)逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒(Applied B1systems,Foster City, CA,USA)通過(guò)實(shí)時(shí)突光定量PCR檢測(cè)單個(gè)基因的mRNA水平。在ABI第一步PLUSTM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied B1systems公司，福斯特市，CA，USA)。數(shù)據(jù)是根據(jù)循環(huán)閾值(CT)和內(nèi)參(GAPDH)比較分析。本發(fā)明所用引物在表1列出。
[0082]表1
[0083]

【權(quán)利要求】
1.一種抗菌肽C-BF保護(hù)小鼠及人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系潰瘍性結(jié)腸炎綜合模型，其特征在于， 1)對(duì)于小鼠，建立3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型；小鼠直腸注射C-BF的PBS溶液，每天一次，C-BF的劑量是5mg / kg,注射持續(xù)I周，實(shí)驗(yàn)期每天稱重記錄體重?cái)?shù)據(jù)，并觀察小鼠直腸出血，糞便成型情況； 2)對(duì)于Caco-2細(xì)胞，培養(yǎng)基中抗菌肽C-BF的濃度為25ug/ml，抗菌肽處理Caco_2細(xì)胞24h后用3%DSS處理24h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽C-BF保護(hù)小鼠及人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系潰瘍性結(jié)腸炎綜合模型，其特征在于，進(jìn)一步， 3)對(duì)于小鼠，熒光標(biāo)記C-BF，濃度為2mg/ml，直腸注射，通過(guò)活體成像、HE染色、免疫熒光、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞儀、Tunne1、ELISA、利用細(xì)胞電阻儀對(duì)跨上皮電阻值進(jìn)行測(cè)定、western-blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)方法； 4)對(duì)于Caco-2細(xì)胞，利用細(xì)胞電阻儀對(duì)跨上皮電阻值進(jìn)行測(cè)定，Western-blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)方法； 5)綜合體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)C-BF在緩解炎癥、降低細(xì)胞凋亡水平以及改善腸道屏障 功能的作用。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK104046592SQ201410208089
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】汪以真, 張海文, 戎亦驪 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)