在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法，采用Real-time?PCR，在水稻葉片上采用剪葉法侵染白葉枯病菌，侵染46～50小時(shí)后，取距離剪口處1cm之內(nèi)的葉片組織進(jìn)行檢測(cè)。表達(dá)基因包括Os03g0853200、OsPR1b、OsNPR1等。采用本發(fā)明的方法能輕易的對(duì)白葉枯病菌侵染的水稻組織進(jìn)行選取，并能有效地檢測(cè)其誘導(dǎo)基因的表達(dá)。
【專利說(shuō)明】在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種在水稻中檢測(cè)受白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻白葉枯病是由革蘭氏陰性黃單孢菌水稻變種(Xanthomonas oryzaepv.0ryzae, Xo0.)所引起的一種世界性細(xì)菌病害，它與稻瘟病、紋枯病一起被稱為水稻的“三大病害”。水稻遭遇白葉枯病后，一般減產(chǎn)20~30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%，甚至絕收。利用水稻的抗病基因是防治白葉枯病最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法，也是水稻育種中提高雜交稻抗病性的有效途徑。水稻抗白葉枯病基因往往受白葉枯病菌的誘導(dǎo)表達(dá)，所以在白葉枯病菌侵染的水稻中檢測(cè)被誘導(dǎo)表達(dá)的基因，是發(fā)現(xiàn)抗性基因的有效方法，為水稻抗性基因的功能研究和育種利用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
[0003]目前，檢測(cè)基因表達(dá)的方法非常成熟，主要有半定量RT-PCR法、Real-time PCR法、Northern blotting法等。其中，Real-time PCR可以精確定量某個(gè)基因的表達(dá)水平,是比較公認(rèn)的檢測(cè)基因表達(dá)的方法。在檢測(cè)白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的基因時(shí)，一般是選取一段接種過(guò)白葉枯病菌的水稻葉片，提取總RNA后，用Real-time PCR分析基因表達(dá)水平。由于不同基因的表達(dá)方式可能有所不同，有些可能是在葉片接種病菌的局部受到誘導(dǎo)表達(dá)，有些則是在整張葉片上受到誘導(dǎo)表達(dá)，因此如何合理地選取葉片組織是檢測(cè)基因受白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。但是，選取哪一段接種過(guò)白葉枯病菌的水稻葉片，離接種處多少距離，才能有效地檢測(cè)出被誘導(dǎo)表達(dá)的抗性基因，目前還沒(méi)有一個(gè)明確的標(biāo)準(zhǔn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法；采用本發(fā)明的方法能輕易的對(duì)白葉枯病菌侵染的水稻組織進(jìn)行選取，并能有效地檢測(cè)其誘導(dǎo)基因的表達(dá)。
[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法，采用Real-time PCR，在水稻葉片上采用剪葉法侵染白葉枯病菌(白葉枯病菌PX086)，侵染(接種)46~50小時(shí)(較佳為48小時(shí))后，取距離剪口處Icm(包括Icm)之內(nèi)的葉片組織進(jìn)行檢測(cè)。
[0006]作為本發(fā)明的在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法的改進(jìn):在水稻分蘗期，在水稻葉片上采用剪葉法侵染白葉枯病菌。
[0007]作為本發(fā)明的在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法的進(jìn)一步改進(jìn):
[0008]表達(dá)基因?yàn)?s03g0853200、OsPRlb, OsNPRl 等；
[0009]當(dāng)表達(dá)基因?yàn)?s03g0853200時(shí)，引物為:
[0010]5， -GAGCAACGACCAACAAAAG-3，和 5， -GCAGAAAATGGGAAAGAAG-3，；[0011]當(dāng)表達(dá)基因?yàn)镺sPRlb時(shí)，引物為:
[0012]5’ -GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’ 和 5’ -CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3’ ；
[0013]當(dāng)表達(dá)基因?yàn)镺sNPRl時(shí)，引物為:
[0014]5’ -CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’ 和 5’ -GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3’。
[0015]本發(fā)明的方法提供了有效的取樣方法，采用本發(fā)明的方法能最有效地檢測(cè)到基因受白葉枯病菌的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0016]本發(fā)明的過(guò)程如下:
[0017]通過(guò)Real-time PCR技術(shù)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了水稻一個(gè)基因(GenBankaccession:0s03g0853200)受白葉枯病基因的誘導(dǎo)表達(dá)，在動(dòng)物中該基因的同源基因參與機(jī)體的免疫應(yīng)答。為了分析該基因(0s03g0853200)在接種白葉枯病菌的水稻葉片中的表達(dá)情況，發(fā)明人首先采用剪葉法(Kauffman et al.，1973)對(duì)水稻抗病品種IRBB7和感病品種IR24接種白葉枯病菌，用沾了菌液的剪刀在葉片頂端橫向剪去一段，在剪過(guò)的傷口處白葉枯病菌會(huì)沿著維管束向葉片基部方向侵染；然后，根據(jù)離剪口的距離，將接種的葉片分成I至V區(qū)域(圖1)，每個(gè)區(qū)域的葉片組織獨(dú)立提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用Real-timePCR分析該基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明該基因在感病品種IR24中沒(méi)有被誘導(dǎo)表達(dá)，而在抗病品種IRBB7中被顯著性地誘導(dǎo)表達(dá)。不過(guò)，在葉片I至V區(qū)域中該基因表達(dá)被誘導(dǎo)的程度不同，在I區(qū)的表達(dá)量最高，隨著距離剪口處越遠(yuǎn)，基因表達(dá)越低，在II區(qū)的表達(dá)量只有I區(qū)的一半，到IV區(qū)已趨 于本底表達(dá)，無(wú)誘導(dǎo)表達(dá)。以上結(jié)果表明，在I至III區(qū)域內(nèi)都能非常明顯地檢測(cè)到該基因受白葉枯病菌的誘導(dǎo)表達(dá)，但是在I區(qū)檢測(cè)到的表達(dá)量最高，即在距離剪口處Icrn以內(nèi)可最有效地檢測(cè)到基因受白葉枯病菌誘導(dǎo)的表達(dá)(圖2)。
[0018]本發(fā)明對(duì)在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)的基因時(shí)，如何科學(xué)地取樣做了明確的說(shuō)明，為抗白葉枯病基因的表達(dá)分析提供了一種有效的方法，也為其它植物抗病基因的研究提供了借鑒。
[0019]綜上所述，采用本發(fā)明的方法能有效的在白葉枯病菌侵染的水稻中檢測(cè)出被誘導(dǎo)表達(dá)的基因，是發(fā)現(xiàn)抗性基因的有效方法，為水稻抗性基因的功能研究和育種利用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0021]圖1接種白葉枯病菌的水稻葉片分區(qū)示意圖；
[0022]圖2葉片不同部位中0s03g0853200基因的Real time_PCR表達(dá)分析圖；
[0023]圖3水稻抗病相關(guān)基因OsPRlb的Real time-PCR表達(dá)分析圖。
[0024]圖4水稻抗病相關(guān)基因OsNPRl的Real time-PCR表達(dá)分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1、
[0026]1、接種體制備方法:
[0027]將白葉枯病菌PX086接種在PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯300g/L，葡萄糖30g/L，瓊脂15g/L)上,于28恒.溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4d,用蒸懼水從培養(yǎng)基上洗下菌落,并稀釋成濃度為9X 108cfu/mL的細(xì)菌懸浮液。在水稻分蘗期,采用剪葉法(Kauffman et al.，1973)對(duì)水稻抗病品種IRBB7和感病品種IR24的葉片侵染白葉枯病菌。在侵染48小時(shí)后，根據(jù)距離剪
口處的遠(yuǎn)近選取I至V區(qū)域(圖1)的葉片組織，迅速置于液氮中冷凍，-80保存。
[0028]備注說(shuō)明:
[0029]距離剪口處O至Icm為區(qū)域I,距離剪口處< I至2cm為區(qū)域II,距離剪口處< 2至3cm為區(qū)域III,距離剪口處< 3至5cm為區(qū)域IV,距離剪口處< 5至7cm為區(qū)域V。
[0030]備注說(shuō)明:上述每個(gè)區(qū)域取樣時(shí)是選取該區(qū)域中距離剪口最遠(yuǎn)之處，即，區(qū)域I選取距離剪口 Icm之處，區(qū)域II選取距離剪口 2cm之處，其余以此類推。
[0031]2、用RNeasy Plant mini Kit (QIAGEN公司)分別從每一葉片組織的區(qū)域I~區(qū)域V中每個(gè)區(qū)域提取總RNA(即為下文中所用的RNA)，參照該試劑盒說(shuō)明書方法操作。
[0032]將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA:取5ug總RNA、4uL Oligo (dT) 18引物(濃度為5uM),加 Rnase free water 至 20uL, 72 °C 溫育 5min,再冰浴 IOmin ；加入 10uL5XM_MLVBuffer、3uL dNTP (IOmM each) >IuL RNase Inhibitor (40U/uL)>2uL ReverseTranscriptase M-MLV (200U/uL)和 20uL RNase free water, 42 °C溫育 60min, 72°C 溫育15min，獲得所需的cDNA。
[0033]3、米用 ABI 公司 StepOne Real-Time PCR System,用 Fast SYBR GreenMaster Mix(T0Y0B0 公司 )試劑盒，反應(yīng)體系為:10uL2XFast SYBR GreenMaster Mix，0.4uL50 X Rox, 0.8uL 基因(0s03g0853200)特異性引物(序列為5’-GAGCAACGACCAACAAAAG-3’和 5’_GCAGAAAATGGGAAAGAAG_3’，濃度均為 5uM，各加 0.4uL)，IuL cDNA 模板(濃度為 10ng/uL)，加 ddH20 至 20uL。
[0034]PCR反應(yīng)程序?yàn)?95預(yù)變性5min ；95 ；C6E5s IQ 40個(gè)循環(huán)；從而獲得相應(yīng)的CT值。
[0035]備注說(shuō)明:經(jīng)常規(guī)方法驗(yàn)證，所得確為基因0s03g0853200。
[0036]以水稻管家基因β -actin作為內(nèi)參，即將上述反應(yīng)體系中的“基因(0s03g0853200)特異性引物”改成水稻管家基因β -actin的引物(序列為:5’ -CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’ 和 5’ -CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’)；其余等同。每個(gè)樣品重復(fù)3次，使用法處理數(shù)據(jù)，分析基因的表達(dá)水平和差異，具體公式為:
j-QQgyj^-[(樣品目的基因°1值-樣品管家基因°1值)]—[(對(duì)照目的基因^1值-對(duì)照管家基因^1值)]
[0038]備注說(shuō)明，上式中:
[0039]樣品目的基因CT值是指:水稻抗病品種IRBB7于目的基因(0s03g0853200)下所得的CT值；
[0040]樣品管家基因CT值是指:水稻抗病品種IRBB7于水稻管家基因β -actin下所得的CT值；
[0041]對(duì)照目的基因CT值是指:感病品種IR24于目的基因(0s03g0853200)下所得的CT值；
[0042]對(duì)照管家基因CT值是指:感病品種IR24于水稻管家基因β -actin下所得的CT值。
[0043]最終所得的結(jié)果如圖2所示。[0044]根據(jù)圖2可知:在接種了白葉枯病菌的IRBB7葉片中，在I至III區(qū)域內(nèi)都能非常明顯地檢測(cè)到該基因受白葉枯病菌的誘導(dǎo)表達(dá)，但是在I區(qū)檢測(cè)到的表達(dá)量最高，即在距離剪口處Icm以內(nèi)可最有效地檢測(cè)到基因受白葉枯病菌誘導(dǎo)的表達(dá)。
[0045]實(shí)施例2、將實(shí)施例1中的基因(0s03g0853200)改成OsPRlb (GenBankaccession:EF061247.1)，將相應(yīng)的引物序列改為 5’ -GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’ 和5，-CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3，，其余同實(shí)施例1。
[0046]備注說(shuō)明:經(jīng)常規(guī)方法驗(yàn)證，所得確為基因OsPRlb。
[0047]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所不，在感病品種IR24中，該基因沒(méi)有受:白葉枯病菌的誘導(dǎo)表達(dá)；而在接菌的抗病品種IRBB7葉片的I區(qū)域(即距離剪口處Icm以內(nèi))，最顯著地檢測(cè)到該基因受誘導(dǎo)表達(dá)。
[0048]備注說(shuō)明:受病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的水稻抗病相關(guān)基因OsPRlb是一個(gè)公認(rèn)的抗病標(biāo)記基因，用以表明植物抗病系統(tǒng)的激活。
[0049]實(shí)施例3、將實(shí)施例1中的基因(0s03g0853200)改成OsNPRl (GenBankaccession:DQ450948.1)，將相應(yīng)的引物序列改為 5’ -CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’ 和5，-GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3，，其余同實(shí)施例1。
[0050]備注說(shuō)明:經(jīng)常規(guī)方法驗(yàn)證，所得確為基因OsNPRl。
[0051]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所不，在感病品種IR24中，該基因沒(méi)有受:白葉枯病菌的誘導(dǎo)表達(dá)；而在接菌的抗病品種IRBB7葉片的I區(qū)域(即距離剪口處Icm以內(nèi))，最顯著地檢測(cè)到該基因受誘導(dǎo)表達(dá)。
[0052]備注說(shuō)明:受病 原菌誘導(dǎo)表達(dá)的水稻抗病相關(guān)基因OsNPRl也是一個(gè)公認(rèn)的抗病標(biāo)記基因，用以表明植物抗病系統(tǒng)的激活。
[0053]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法，采用Real-timePCR，其特征是: 在水稻葉片上采用剪葉法侵染白葉枯病菌，侵染46~50小時(shí)后，取距離剪口處Icm之內(nèi)的葉片組織進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法，其特征是:在水稻分蘗期，在水稻葉片上采用剪葉法侵染白葉枯病菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法，其特征是: 所述表達(dá)基因?yàn)?0s03g0853200、OsPRlb, OsNPRl 等。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法，其特征是: 表達(dá)基因?yàn)?s03g0853200，引物為:
5， -GAGCAACGACCAACAAAAG-3，和 5， -GCAGAAAATGGGAAAGAAG-3，。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法，其特征是: 表達(dá)基因?yàn)镺sPRlb，引物為:
5’ -GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’ 和 5’ -CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3 ’。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在水稻中檢測(cè)受白葉枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的有效方法，其特征是: 表達(dá)基因?yàn)镺sNPRl，引物為:
5’ -CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’ 和 5’ -GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3 ’。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103966331SQ201410209468
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月17日
【發(fā)明者】馬伯軍, 金彬, 孫青芝, 陳析豐 申請(qǐng)人:浙江師范大學(xué)