一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法，該方法包括：用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)保藏號為ATCC-13273的灰色鏈霉菌，聚氨酯泡沫載體的預處理，細胞的培養(yǎng)與固定化，以及利用固定化灰色鏈霉菌ATCC-13273細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有非固定化細胞轉(zhuǎn)化法制備紫堇達明的轉(zhuǎn)化周期長、轉(zhuǎn)化底物投料濃度低、紫堇達明轉(zhuǎn)化得率低的問題。且細胞固定化方法簡單，成本低廉，固定化細胞能重復使用，可實現(xiàn)紫堇達明的連續(xù)轉(zhuǎn)化制備，具有良好的經(jīng)濟效益。
【專利說明】一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種以聚氨酯泡沫固定化灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus) ATCC-13273細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法。
【背景技術】
[0002]紫堇達明為具有良好鎮(zhèn)痛活性的天然微量活性成分，具有高效快速鎮(zhèn)痛的特點，但其自然來源十分有限，限制了其在醫(yī)藥領域的應用。我們先前報道了生物轉(zhuǎn)化制備左旋紫堇達明的方法(藥物生物技術，2003，10 (3):165-168)，并申請了紫堇達明的生物轉(zhuǎn)化制備方法及其在制備鎮(zhèn)痛藥中的應用(中國專利ZL02138363.4)和一種高效生產(chǎn)紫堇達明的生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵工藝(中國專利ZL201110125328.2)專利，公開了搖瓶和發(fā)酵罐非固定化細胞轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法。以上方法利用非固定化細胞進行生物堿四氫巴馬汀的轉(zhuǎn)化，由于生物堿四氫巴馬汀對灰色鏈霉菌細胞的生長具有一定的毒性作用，限制了轉(zhuǎn)化底物四氫巴馬汀的投料量，且轉(zhuǎn)化發(fā)酵周期較長為96h。為了提高生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)左旋紫堇達明的產(chǎn)率，縮短發(fā)酵周期，我們開發(fā)了一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效制備紫堇達明的方法，紫堇達明的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達59.27%，底物投料濃度及紫堇達明的得率增加I倍，轉(zhuǎn)化時間縮短至24-48h，一次制備的固定化灰色鏈霉菌細胞可重復使用15-16次，極大提高了轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的效率，減少了發(fā)酵廢液排放。固定化灰色鏈霉菌轉(zhuǎn)化制備紫堇達明工藝操作簡便，生產(chǎn)成本低廉，環(huán)境友好，更適宜于工業(yè)化轉(zhuǎn)化制備紫堇達明。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法，利用多孔的聚氨酯泡沫固定灰色鏈霉菌菌絲，菌絲纏繞生長于聚氨酯泡沫的空隙中，使其具有固定效果好，菌絲不易脫落，且操作簡單，固定化細胞可多次重復用于轉(zhuǎn)化制備紫堇達明且環(huán)境優(yōu)好。
[0004]技術方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:
[0005]一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法，包括以下工藝步驟:
[0006](I)灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus) ATCC-13273 種子液的培養(yǎng)
[0007]采用灰色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接種來自于斜面培養(yǎng)的灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)ATCC-13273,于 25-28 °C、180rpm 搖床培養(yǎng) 24-48 小時，作為種子液備用；其中，灰色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:3%玉米粉，0.76%豆柏，0.5%酵母粉，0.5% K2HPO4,0.12%葡萄糖，0.5% NaCl,0.01% MgS047H20，初始 pH 為 6.0-6.5 ；
[0008](2)聚氨酯泡沫載體的預處理
[0009]將聚氨酯泡沫裁剪成邊長為4-10mm的立方體，以5%鹽酸溶液浸泡24h,蒸懼水反復洗滌至中性，然后以5 %的氫氧化鈉溶液浸泡24h，蒸餾水反復洗滌至中性，取出后干燥備用;
[0010](3)灰色鏈霉菌細胞的培養(yǎng)與固定化[0011]取250mL三角瓶加入40mL灰色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基和0.2-0.6g/L預處理后的聚氨酯泡沫，接入由步驟(1)得到的灰色鏈霉菌種子液，置于180rpm、28°C搖床中培養(yǎng)24-48小時，培養(yǎng)過程中細胞吸附于聚氨酯泡沫空隙內(nèi)生長，培養(yǎng)及固定化結束后，取出用生理鹽水漂洗3次，得到固定化灰色鏈霉菌，4°C保藏備用；
[0012](4)利用固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化四氫巴馬汀制備紫堇達明
[0013] 利用固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化四氫巴馬汀制備紫堇達明的搖瓶轉(zhuǎn)化工藝為:取250mL三角瓶加入40mL固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基、0.2-0.8g/L固定化細胞以及轉(zhuǎn)化底物四氫巴馬汀，120-180印111、25-281:搖床中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化24-4811，轉(zhuǎn)化發(fā)酵液用于紫堇達明的分離制備，固定化細胞按上述相同條件重復用于轉(zhuǎn)化制備紫堇達明，固定化細胞重復使用15-16次；
[0014]利用固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化四氫巴馬汀制備紫堇達明的發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化工藝為:發(fā)酵罐中加入灰色鏈霉菌固定化細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，滅菌后加入0.2-0.8g/L固定化灰色鏈霉菌細胞以及轉(zhuǎn)化底物四氫巴馬汀，25-28°C、攪拌速度80-160rpm、通氣量l-1.5VVm轉(zhuǎn)化發(fā)酵24-48h，放出發(fā)酵液用于紫堇達明的分離制備，發(fā)酵罐中再加入滅菌后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化底物相同條件轉(zhuǎn)化制備紫堇達明，固定化細胞重復使用15-16次；
[0015]固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為:2.5%玉米粉，0.76%豆柏，0.5%酵母粉，0.5 % K2HPO4,0.12 %葡萄糖，0.5 % NaCl,0.01 % MgS047H20，0.01 % FeSO4,初始 pH 為
6.0-6.5。
[0016]有益效果:與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法，利用聚氨酯泡沫對灰色鏈霉菌細胞進行固定，固定方法簡單，成本低廉。與現(xiàn)有技術相比，轉(zhuǎn)化底物四氫巴馬汀的投料量及紫堇達明的得率增加I倍，轉(zhuǎn)化時間從96h縮短至24-48h，一次制備的固定化灰色鏈霉菌細胞可重復使用15-16次，極大提高了轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的效率，減少了發(fā)酵廢液排放。固定化灰色鏈霉菌轉(zhuǎn)化制備紫堇達明工藝操作簡便，生產(chǎn)成本低廉，環(huán)境友好，更適宜于工業(yè)化轉(zhuǎn)化制備紫堇達明。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0018]實施例1灰色鏈霉菌固定化細胞的制備
[0019](I)灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus) ATCC-13273 種子液的培養(yǎng)
[0020]采用灰色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接種來自于斜面培養(yǎng)的灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus) ATCC-13273,于 28°C、180rpm搖床培養(yǎng) 24 小時，作為種子液備用；其中，灰色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:3%玉米粉，0.76%豆柏，0.5%酵母粉，0.5% K2HPO4,
0.12%葡萄糖，0.5% NaCl,0.01% MgS047H20，初始 pH 為 6.3 ;
[0021](2)聚氨酯泡沫載體的預處理
[0022]將聚氨酯泡沫裁剪成邊長為5mm的立方體，以5%鹽酸溶液浸泡24h，蒸餾水反復洗滌至中性，然后以5%的氫氧化鈉溶液浸泡24h，蒸餾水反復洗滌至中性，取出后干燥備用；
[0023](3)灰色鏈霉菌細胞的培養(yǎng)與固定化
[0024]取250mL三角瓶加入40mL灰色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基和0.2g/L預處理后的聚氨酯泡沫，接入由步驟(1)得到的灰色鏈霉菌種子液lmL，置于180rpm、28°C搖床中培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)及固定化結束后，固定化細胞用生理鹽水漂洗3次，得到固定化灰色鏈霉菌，4°C保藏備用。
[0025]實施例2利用固定化灰色鏈霉菌細胞搖瓶中轉(zhuǎn)化四氫巴馬汀制備紫堇達明
[0026]取250mL三角瓶加入40mL固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基滅菌后再加入0.2g/L固定化細胞、0.8g/L轉(zhuǎn)化底物四氫巴馬汀，160rpm、28°C搖床中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化24h，轉(zhuǎn)化發(fā)酵液用于紫堇達明的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的檢測，取出固定化細胞按上述相同條件重復用于轉(zhuǎn)化制備紫堇達明，固定化細胞重復使用15次，高效液相色譜檢測顯示固定化灰色鏈霉菌用于搖瓶轉(zhuǎn)化重復使用過程中每一次紫堇達明的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率均大于59% ;其中，固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為:2.5%玉米粉，0.76%豆柏，0.5%酵母粉，0.5% K2HPO4,0.12%葡萄糖，0.5%NaCl,0.01% MgS047H20,0.01% FeSO4,初始 pH 為 6.3。
[0027]實施例3利用固定化灰色鏈霉菌細胞在發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化四氫巴馬汀制備紫堇達明
[0028]100L發(fā)酵罐中加入60L灰色鏈霉菌固定化細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，滅菌后加入0.3g/L固定化灰色鏈霉菌細胞、0.8g/L轉(zhuǎn)化底物四氫巴馬汀，28°C、攪拌速度150rpm、通氣量1.2vvm轉(zhuǎn)化發(fā)酵36h，放出發(fā)酵液用于紫堇達明的分離制備，發(fā)酵罐中再加入滅菌后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化底物按上述相同條件轉(zhuǎn)化制備紫堇達明，固定化細胞重復使用16次，高效液相色譜檢測顯示固定化灰色鏈霉菌用于發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化過程中每一次紫堇達明的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率均大于56% ;其中，固定化 灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為:2.5%玉米粉，0.76%豆柏，0.5%酵母粉，0.5% K2HPO4,0.12%葡萄糖，0.5% NaCl,0.01% MgS047H20，0.01% FeSO4,初始 pH 為6.2。
【權利要求】
1.一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法，其特征在于:用固定化灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)ATCC_13273細胞轉(zhuǎn)化四氫巴馬汀制備紫堇達明，制備過程包括以下工藝步驟: (1)灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus) ATCC-13273 種子液的培養(yǎng)； (2)聚氨酯泡沫載體的預處理； (3)灰色鏈霉菌細胞的培養(yǎng)與固定化； (4)用固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化四氫巴馬汀制備紫堇達明。
2.根據(jù)權利要求1所述一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法，其特征在于:所述的(I)步驟中的種子液培養(yǎng)方法為:采用灰色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接種來自于斜面培養(yǎng)的灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus) ATCC-13273,于 25_28°C、180rpm搖床培養(yǎng)24-48小時，作為種子液備用；其中，灰色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:3%玉米粉，0.76%豆柏，0.5%酵母粉，0.5% K2HPO4,0.12%葡萄糖，0.5% NaCl,0.01 % MgS047H20，初始pH 為 6.0-6.5。
3.根據(jù)權利要求1所述一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法，其特征在于:所述的(2)步驟中的聚氨酯泡沫載體的預處理方法為:將聚氨酯泡沫裁剪成邊長為4-10mm的立方體，以5%鹽酸溶液浸泡24h，蒸餾水反復洗滌至中性，然后以5%的氫氧化鈉溶液浸泡24h，蒸餾水反復洗滌至中性，取出后干燥備用。
4.根據(jù)權利要求1所述一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法，其特征在于:所述的(3)步驟中的灰色鏈霉菌細胞的培養(yǎng)與固定化工藝為:取250mL三角瓶加入40mL灰色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基和0.2-0.6g/L預處理后的聚氨酯泡沫，接入由步驟(1)得到的灰色鏈霉菌種子液，置于180rpm、28°C搖床中培養(yǎng)24-48小時，培養(yǎng)過程中細胞吸附于聚氨酯泡沫空隙內(nèi)生長，培養(yǎng)及固定化結束后，取出用生理鹽水漂洗3次，得到固定化灰色鏈霉囷，4 C保減備用。
5.根據(jù)權利要求1所述一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法，其特征在于:所述的(4)步驟中的用固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化四氫巴馬汀制備紫堇達明的搖瓶轉(zhuǎn)化工藝為:取250mL三角瓶加入40mL固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基、0.2-0.8g/L固定化細胞以及轉(zhuǎn)化底物四氫巴馬汀，120-180印111、25-281:搖床中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化24-4811，轉(zhuǎn)化發(fā)酵液用于紫堇達明的分離制備，固定化細胞按上述相同條件重復用于轉(zhuǎn)化制備紫堇達明。
6.根據(jù)權利要求1所述一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法，其特征在于:所述的(4)步驟中的用固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化四氫巴馬汀制備紫堇達明的發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化工藝為:發(fā)酵罐中加入灰色鏈霉菌固定化細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，滅菌后加入0.2-0.8g/L固定化灰色鏈霉菌細胞以及轉(zhuǎn)化底物四氫巴馬汀，25-28 °C、攪拌速度80-160rpm、通氣量1-1.5vvm轉(zhuǎn)化發(fā)酵24_48h,放出發(fā)酵液用于紫堇達明的分離制備,發(fā)酵罐中再加入滅菌后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化底物相同條件轉(zhuǎn)化制備紫堇達明。
7.根據(jù)權利要求5或6所述一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉(zhuǎn)化制備紫堇達明的方法，其特征在于:固定化灰色鏈霉菌細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為:2.5%玉米粉，0.76%豆柏，0.5%酵母粉，0.5% K2HPO4,0.12%葡萄糖，0.5% NaCl, 0.01% MgS047H20，0.01% FeSO4,初始 pH為 6.0-6.5。
【文檔編號】C12R1/545GK103952449SQ201410209741
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月19日 優(yōu)先權日:2014年5月19日
【發(fā)明者】劉吉華, 索成林, 余伯陽 申請人:中國藥科大學