菊花花枯病菌實時熒光pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法，以待測樣品DNA為模板，利用上游引物DL1、下游引物DL2和熒光探針Probe-DL進行PCR擴增，若發(fā)生特異性擴增，則表明待測樣品中帶有菊花花枯病菌D.ligulicola；所述上游引物DL1為：5，-CAACACTTAAACCCTTTGTAATTGA-3，所述下游引物DL2為：5，-GGACGTCGTCGTTTTGTTGT-3；所述熒光探針Probe-DL為：5，-FAM-ACAACTTTCAACAACGGATC-TAMRA-3。采用該方法檢測菊花花枯病菌，具有快速、靈敏、特異性高等特點。
【專利說明】菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學和核酸檢測【技術領域】，具體為:本發(fā)明涉及一種檢測鑒定菊花及其產品中是否攜帶菊花花枯病菌(Didymella ligulicola)的實時突光PCR方法。
【背景技術】
[0002]菊花花枯病Didymella ligulicola是菊花上的重要病害。1982年被列入EPPO檢疫性有害生物A2名單中，屬于我國的檢疫性病害。該病于1904年，美國的北卡羅那州首先發(fā)現(xiàn)并報道；隨著菊花切花和盆栽菊花的大量生產，危害日益嚴重，英、德、荷蘭、丹麥、加拿大、肯尼亞、坦桑尼亞、日本、澳大利亞、新西蘭等國均有發(fā)生，我國目前尚無報道發(fā)生。
[0003]該病主要侵染菊花花冠，流行快，幾天之內可使花冠完全腐爛；也可以使切花在運銷過程中大量落花，給商品菊花造成很大的損失。而且該病對環(huán)境適應能力很強，可以在各種惡劣自然條件下發(fā)生，尤其在溫室中，常年都可以發(fā)病，因此該病一旦定殖，將會對我國的菊花產業(yè)帶來毀滅性的打擊，即使花費大量的人力和財力，也很難得到根治。
[0004]目前我國菊花出口的勢頭較好，菊花是日本人祭祀祖先的專用花。由于日本國內生產鮮切菊花成本高，菊花種植面積逐年減少，日本每年從我國大量進口鮮切菊花。北京、上海、江蘇、浙江、廣東直至海南生產的鮮切菊花都開始出口，1996年至2006年，我國出口到日本的鮮切菊花總量有3000多萬枝，為我國花卉企業(yè)帶來了很好的收益。
[0005]鑒于該病危害性 嚴重、適應性強，且我國尚無分布，加強檢疫是防止該病害傳入我國的首要手段，但鑒于切花產品的特殊性，檢疫周期的長短直接影響著切花產品的品質，傳統(tǒng)的檢疫手段耗時長、難度大，并且無法從無癥狀植株上檢出該病，因此篩選一種適宜、準確、快速的檢疫鑒定方法，已成為我國菊花生產，及其他菊科作物的進出口上亟待解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種實現(xiàn)對菊花花枯病菌進行快速檢測的菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法。
[0007]為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法，以待測樣品DNA為模板，利用上游引物DL1、下游引物DL2和熒光探針Probe-DL進行PCR擴增，若發(fā)生特異性擴增，則表明待測樣品中帶有菊花花枯病菌D.ligulicola ；
[0008]所述上游引物DLl 為:5，-CAACACTTAAACCCTTTGTAATTGA-3,
[0009]所述下游引物DL2 為:5，-GGACGTCGTCGTTTTGTTGT-3，；
[0010]所述熒光探針Probe-DL 為:5, -FAM-ACAACTTTCAACAACGGATC-TAMRA-3，。
[0011]作為本發(fā)明的菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法的改進:
[0012]所述PCR擴增的反應體系(20 μ L)為:
[0013]
【權利要求】
1.菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法，其特征是: 以待測樣品DNA為模板，利用上游引物DL1、下游引物DL2和熒光探針Probe-DL進行PCR擴增，若發(fā)生特異性擴增，則表明待測樣品中帶有菊花花枯病菌D.1igulicola ； 所述上游引物 DLl 為:5，-CAACACTTAAACCCTTTGTAATTGA-3, 所述下游引物 DL2 為:5, -GGACGTCGTCGTTTTGTTGT-3,； 所述熒光探針 Probe-DL 為:5，-FAM-ACAACTTTCAACAACGGATC-TAMRA-3,。
2.根據(jù)權利要求1所述的菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法，其特征是: 所述PCR擴增的反應體系(20 μ L)為:
3.根據(jù)權利要求2所述的菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法，其特征是:PCR擴增擴增后讀取Ct值，當Ct值為小于或等于36時，判定為發(fā)生特異性擴增，即表明待測樣品中帶有菊花花枯病菌D.ligulicola。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法，其特征是:所述待測樣品為菊花及菊花產品。
5.根據(jù)權利要求4所述的菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法，其特征是:所述菊花產品為菊花切花、菊花切條、干制菊花茶。
【文檔編號】C12Q1/68GK103952492SQ201410210430
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月19日 優(yōu)先權日:2014年5月19日
【發(fā)明者】陳吳健, 張明哲, 林曉佳, 吳志毅, 陳曦 申請人:浙江省檢驗檢疫科學技術研究院