一種金屬離子耐受性、熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性的唾液酸酶及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種金屬離子耐受性、熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性的唾液酸酶，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示或在SEQ?ID?NO.1基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)缺失、突變?nèi)员３滞僖核崦腹δ懿蛔兊陌被嵝蛄兴厩彝ㄟ^(guò)大腸桿菌表達(dá)后純化。本發(fā)明提供的唾液酸酶具有較強(qiáng)的二價(jià)金屬離子耐受性、熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性，對(duì)α2,3及α2,6連接形式的底物均能進(jìn)行水解，對(duì)豬腦中提取的總神經(jīng)節(jié)苷脂能進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，制備純度較高的GM1，同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)該酶能夠通過(guò)將癌細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂轉(zhuǎn)化為GM1而抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移，具有重要應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種金屬離子耐受性、熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性的唾液酸酶及 其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種唾液酸酶，特別是一種外切唾液酸酶及其在抑制腫瘤遷移中的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 唾液酸（sialic acid, SA)是一類(lèi)分布廣泛的帶負(fù)電荷的九碳糖，通過(guò)不同的連鍵 方式存在于糖蛋白、糖脂等糖綴合物的糖鏈末端。在真核生物中，糖綴合物的唾液酸化修飾 在穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育、信號(hào)識(shí)別等過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用，哺乳動(dòng)物細(xì)胞 糖鏈唾液酸化與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程呈相關(guān)性。
[0003] 細(xì)菌外切唾液酸酶可以水解糖綴合物末端的唾液酸，已有研究報(bào)道部分細(xì)菌唾液 酸酶在生物轉(zhuǎn)化神經(jīng)節(jié)苷脂制備藥物GM1，以及治療脊髓損傷等方面具有應(yīng)用價(jià)值。然而上 述報(bào)道中所用的菌株多為致病菌或篩選獲得的非常見(jiàn)菌株，遺傳信息不明確且不易獲得、 難以培養(yǎng)甚至還具有危害性，另外大多數(shù)報(bào)道中酶純化過(guò)程繁瑣、底物特異性不強(qiáng)，為該類(lèi) 酶的應(yīng)用推廣帶來(lái)極大的限制。因此，在遺傳背景明晰的非致病菌中開(kāi)發(fā)新的外切唾液酸 酶顯得尤為重要。
[0004] 本發(fā)明中的唾液酸酶來(lái)源于阿維鏈霉菌，是一種常見(jiàn)的工業(yè)菌種，進(jìn)一步研究該 酶制備藥物GM1的能力并發(fā)現(xiàn)該酶能通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂上唾液酸的水解，而抑 制癌細(xì)胞的遷移。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新型唾液酸酶，其氨基酸序列如1)或2)所 示且通過(guò)大腸桿菌表達(dá)后純化；
[0006] 1)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0007] 在1)的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)缺失、突變?nèi)员３稚飳W(xué)功能不變的氨基酸序列。
[0008] 本發(fā)明所使用的阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis)菌株編號(hào)為 ATCC31267。
[0009] 編碼所述唾液酸酶的核苷酸序列也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0010] 能表達(dá)權(quán)利要求1所述唾液酸酶的載體或用于表達(dá)所述唾液酸酶的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系均為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0011] 本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題為所述唾液酸酶在抑制癌細(xì)胞遷移中的應(yīng)用。
[0012] 使用所述唾液酸酶制備獲得的對(duì)應(yīng)性抗體也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0013] 本發(fā)明涉及內(nèi)容包括如下方面：
[0014] 1.阿維鏈霉菌外切唾液酸酶NeuA3原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；其中涉及構(gòu)建質(zhì)粒所設(shè) 計(jì)的neuA3基因的特異性引物、阿維鏈霉菌基因組的獲得、pET28a(+)載體的酶切及連接、 宿主菌E. coli BL21 (DE)的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化；
[0015] 2.阿維鏈霉菌外切唾液酸酶NeuA3在E. coli BL21 (DE)中的誘導(dǎo)表達(dá)；其中涉及 誘導(dǎo)表達(dá)的溫度、時(shí)間、IPTG濃度及搖床轉(zhuǎn)速；
[0016] 3.阿維鏈霉菌外切唾液酸酶NeuA3的分離純化；其中涉及宿主菌超生破碎的條 件、鎳柱純化的條件、酶液的透析條件；
[0017] 4.阿維鏈霉菌外切唾液酸酶NeuA3酶學(xué)性質(zhì)分析；其中涉及該酶反應(yīng)的最適溫 度、最適鹽離子濃度、最適反應(yīng)時(shí)間、最適pH、二價(jià)離子耐受性、熱穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性以及底 物特異性；
[0018] 5.阿維鏈霉菌外切唾液酸酶NeuA3轉(zhuǎn)化總神經(jīng)節(jié)苷脂制備藥物GM1的應(yīng)用；其中 涉及豬腦中總神經(jīng)節(jié)苷脂的提取、酶的生物轉(zhuǎn)化體系、轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物的脫鹽處理及高效薄層 色譜（HPTLC);
[0019] 6.阿維鏈霉菌外切唾液酸酶NeuA3抑制癌細(xì)胞遷移能力的研究；其中涉及膀胱癌 細(xì)胞YTS-1的培養(yǎng)、酶液對(duì)細(xì)胞的處理、劃痕實(shí)驗(yàn)及膠體金實(shí)驗(yàn)。
[0020] 本發(fā)明提供的唾液酸酶具有較強(qiáng)的二價(jià)金屬離子耐受性、熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性， 對(duì)α 2, 3及α 2, 6連接形式的底物均能進(jìn)行水解，對(duì)豬腦中提取的總神經(jīng)節(jié)苷脂能進(jìn)行生 物轉(zhuǎn)化，制備純度較高的GM1，同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)該酶能夠通過(guò)將癌細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂轉(zhuǎn)化為 GM1而抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為唾液酸酶誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化后的SDS-PAGE圖；
[0022] 圖2為NeuA3最適反應(yīng)條件；
[0023] 圖3為NeuA3離子耐受性、熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性；
[0024] 圖4為NeuA3生物轉(zhuǎn)化豬腦中提取的總神經(jīng)節(jié)苷脂制備GM1的HPTLC ;
[0025] 圖5為NeuA3處理膀胱癌細(xì)胞YTS-1后細(xì)胞遷移能力變化；
[0026] 圖6為NeuA3處理YTS-1后細(xì)胞表面GM1分布的免疫熒光照片。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0028] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029] 實(shí)施例1 :唾液酸酶的獲得
[0030] 1、克隆與表達(dá)
[0031] neuA3 基因的序列信息通過(guò)網(wǎng)站 http://avermitilis. Is. kitasato-u. ac. jp/ 獲 得，并通過(guò)SignalP4. lServer網(wǎng)站對(duì)該酶的信號(hào)肽情況進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該酶為不含有 信號(hào)肽的胞內(nèi)酶，大小約為38kDa的小唾液酸酶。在neuA3基因的編碼區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由 公司合成如下引物：neuA3-S:GGAATTCCATATGGCGATGACAGAAGCCAGTACAC (下劃線處為 EcoRI 的酶切位點(diǎn)）和 neuA3-AS:CCCAAGCTTCAGTAGAGGTCATGGGGTGA(下劃線處為 Hindlll 的酶切 位點(diǎn)），以上述提取的阿維鏈霉菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：95°C lOmin， 96°C lmin，65°C 45s，72°C lmin30s 重復(fù) 34 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖 凝膠電泳進(jìn)行分離，并采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，獲得neuA3基因片段。
[0032] neuA3基因片段與載體質(zhì)粒pET28a(+)分別經(jīng)過(guò)EcoRI和Hindlll酶切后16°C連 接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109,挑取卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證 和測(cè)序驗(yàn)證，獲得構(gòu)建正確的neuA3表達(dá)質(zhì)粒。
[0033] 利用E. co 1 i BL21 (DE3)和pET28a⑴表達(dá)系統(tǒng)，將含有構(gòu)建好表達(dá)質(zhì)粒的宿 主菌接種于少量含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。第二天以1 %接 種量接入含卡那霉素的大體積LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)。當(dāng)0D_達(dá)到0. 3-0. 6 時(shí)，取出部分菌液作為蛋白表達(dá)的負(fù)對(duì)照。在剩余菌液中加入〇.〇5mM的IPTG后在16°C 培養(yǎng) 8h，離心收集，重懸于 Lysis Buffer(NaH2P0450mM，NaC1300mM，ImidazolelOmM)中， 超聲波破碎后離心取上清備用，沉淀用Lysis Buffer懸浮。加適量5XSample Loading Buffer[pH6. 8Tris-HC1250mM，SDS10% (W/V)，BPBO. 5% (W/V)，甘油 50%，使用前加入 5% β -巰基乙醇]，沸水中煮5min，迅速插在冰上。SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。
[0034] 2、唾液酸酶的純化
[0035] (1)以合適條件擴(kuò)大培養(yǎng)菌體并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，離心收集菌體懸于Lysis Buffer 中，超聲破碎后離心得到上清。根據(jù)His標(biāo)簽與Ni+能相互吸附的原理，在上清中加入50% Ni-NTA(Roche)，在4°C緩慢搖晃60min，使表達(dá)產(chǎn)物與Ni-NTA充分結(jié)合；
[0036] ⑵將混合物轉(zhuǎn)移到層析柱上，收集流出的液體，標(biāo)記為FT ;
[0037] (3)用 Wash Buffer(NaH2P0450mM，NaC1300mM，Imidazole20-100mM)洗滌，收集流 出的液體，標(biāo)記為W1、W2、W3、W4......；
[0038] (4)用少量 Elution Buffer (NaH2P0450mM, NaC1300mM, Imidazole500mM)洗脫，收 集流出的液體，標(biāo)記為E1、E2、E3、E4……。
[0039] 以上收集起來(lái)的液體進(jìn)行SDS-PAGE電泳（圖1)。純化后的蛋白經(jīng)過(guò)透析以去除 其中的Imidazole和鹽離子，再通過(guò)冷凍干燥獲得酶粉。唾液酸酶的氨基酸序列如其氨基 酸序列如1)或2)所示，
[0040] 1)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0041] 在1)的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)缺失、突變?nèi)员３稚飳W(xué)功能不變的氨基酸序列。
[0042] 實(shí)施例2新型唾液酸酶的酶學(xué)性質(zhì)研究
[0043] 將酶液稀釋到0. lmg/mL，以Neu5Ac的衍生物4-MU-Neu5Ac為底物，在反應(yīng)體系中 加入10 μ L該濃度的酶液，10 μ LlmM的底物4-MU-Neu5Ac，及80 μ L反應(yīng)緩沖液，反應(yīng)一定 時(shí)間之后加入100 μ L終止緩沖液（甘氨酸0· 133Μ，NaClO. 06Μ，Na2C030 . 08 3Μ，ρΗ10· 7)終止 酶解反應(yīng)獲得游離的4-MU，由于游離的4-MU在365nm的激發(fā)波長(zhǎng)下可產(chǎn)生450nm的熒光， 而非游離的4-MU-Neu5Ac在這個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)只產(chǎn)生微弱的熒光信號(hào)，因此可通過(guò)熒光酶標(biāo)儀 收集游離4-MU的熒光信號(hào)，并根據(jù)熒光信號(hào)與4-MU濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算酶活。1 個(gè)酶活單位的定義為：1分鐘內(nèi)水解底物釋放出lnm 〇14-MU時(shí)所用的酶量。確定該酶在pH =5的含300mM NaAc的反應(yīng)緩沖液中40°C反應(yīng)具有最適的酶活（圖2)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該酶能耐 受大多數(shù)二價(jià)金屬離子并在銅離子存在的情況下表現(xiàn)出更高的酶活。該酶的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是 溫度和pH耐受性好，長(zhǎng)時(shí)間暴露在其反應(yīng)溫度和弱酸性的條件下酶活幾乎不會(huì)發(fā)生明顯 損失（圖3)。
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種金屬離子耐受性、熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性的唾液酸酶，其特征在于氨基酸序列如 1)或2)所示且通過(guò)大腸桿菌表達(dá)后純化； 1)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示； MTEASTPFRGGREGYASYRIPAVVATGVGTLLAFCEGRVDSAHDHGNIDIVLKRS⑶GGRTWGPLQAVAKNG DNLAGNPAPVVLDTGRVLLVHVRSAAGASEDAILRGKVKAADGRRVWVQHSDDDGLTWSGPREITGQVRKANWRWYA TTPGHALQLTTGRVVVPGNHTVPPTGTDNGTEAKYNSGHCLLSDDRGASWYLGYLDENTNGYINVNETTATELPDGR VYFNTRNDSPSPGNRADAYSKDGGKTLVKPFRPQAGLTTPVVQGSVLQLRDPDLLLYSGPADPAFRALMTVRASADG GTTWRTAHPLDGLPAAYSDLVRVDQDTVGLLYETCDFGAYETITFRRIPVTALT ; 在1)的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)缺失、突變?nèi)员３滞僖核崦腹δ懿蛔兊陌被嵝蛄小?br> 2. 權(quán)利要求1所述的唾液酸酶，其特征在于所述大腸桿菌為E. coli BL21 (DE)。
3. 編碼權(quán)利要求1所述唾液酸酶的核苷酸序列。
4. 能表達(dá)權(quán)利要求1所述唾液酸酶的載體。
5. 能表達(dá)權(quán)利要求1所述唾液酸酶的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6. 權(quán)利要求1所述唾液酸酶在抑制癌細(xì)胞遷移中的應(yīng)用。
7. 應(yīng)用權(quán)利要求1所述唾液酸酶制備獲得的對(duì)應(yīng)性抗體。
8. -種制備獲得SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列唾液酸酶的方法，其特征在于包括如下 步驟：通過(guò)特異性引物擴(kuò)增獲得唾液酸酶基因；將獲得的基因克隆到pET28a(+)載體；將獲 得的重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌E. coli BL21 (DE);對(duì)獲得的E. coli BL21 (DE)工程菌進(jìn)行發(fā)酵誘 導(dǎo)表達(dá)唾液酸酶。
9. 權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于引物序列如下：neuA3-S:GGAATTCCATATGGCGATG ACAGAAGCCAGTACAC ;neuA3-AS:CCCAAGCTTCAGTAGAGGTCATGGGGTGA。
10. 權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵誘導(dǎo)條件為：將構(gòu)建好的 E. coliBL21 (DE)工程菌接種于少量含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜振蕩培養(yǎng)； 第二天以1%接種量接入含卡那霉素的大體積LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)；當(dāng)0D600 達(dá)到0. 3-0. 6時(shí)，取出部分菌液作為蛋白表達(dá)的負(fù)對(duì)照；在剩余菌液中加入0. 05mM的IPTG 后在16°C培養(yǎng)8h，離心收集。
【文檔編號(hào)】C12N9/24GK104046603SQ201410217540
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】關(guān)鋒, 郭佳, 王宜成, 楊剛龍, 宋波 申請(qǐng)人:江南大學(xué)