一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽及其制備方法和用途，該抗氧化膠原肽的氨基酸序列為Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly（SEQIDNo:1），ESI-MS檢測給出分子量為631.70Da（[M+H]+632.49Da）。制備時以大黃魚魚鱗作為原料，按固液比1g:10~15mL加入2~3%鹽酸處理20~24h，過濾除去鹽酸后按照固液比1g:10~15mL加入0.08~0.10mol/LNaOH處理20~24h，過濾，蒸餾水洗至pH6.5~7.5，30~35℃干燥后用粉碎機粉碎；取魚鱗粉末，按照料液比1g:8~10mL加入甘氨酸-NaOH緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至9.0~10.0，最后將酶解液加熱到90~95℃滅活5~10min，再依次經(jīng)離心、超濾和層析，得到抗氧化膠原肽。本發(fā)明制備工藝科學合理，酶解過程易于監(jiān)控，制得的抗氧化膠原肽具有活性強、易于消化吸收和安全無毒副作用等優(yōu)點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等應用。
【專利說明】一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種魚類抗氧化物質(zhì)及其制備方法和用途，尤其涉及一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是細胞外基質(zhì)中最重要的組成部分，維持著皮膚和組織器官的形態(tài)和結構，是修復各損傷組織的重要原料物質(zhì)，也是使身體保持年輕、防止老化的物質(zhì)。魚鱗中含有大量的膠原蛋白，與其他膠原蛋白相比，魚鱗膠原蛋白易分解，容易被消化、吸收，有較高的利用價值。
[0003]魚鱗膠原蛋白在酸、堿、熱、酶的作用下水解，會產(chǎn)生魚鱗膠原肽，外用可阻止陽光對皮膚的直接傷害，內(nèi)服可預防游離基對皮膚的摧毀，具有良好的抗紫外損傷和抗氧化功效，已被應用于各種營養(yǎng)保健食品及化妝品中。
[0004]但是， 申請人:發(fā)現(xiàn)，以大黃魚魚鱗為原料,利用酶解技術制備大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的工藝研究處于空白階段，而以酶解產(chǎn)物為材料制備高活性魚鱗抗氧化膠原肽及其應用更是未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是針對上述的技術現(xiàn)狀提供一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽，該抗氧化膠原肽安全無毒副作用，抗氧化活性強和易于消化吸收，可清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用。
[0006]本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是提供一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的制備方法，該工藝科學合理、易操作。
[0007]本發(fā)明所要解決的第三個技術問題是提供一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的應用。
[0008]本發(fā)明為解決上述第一個技術問題所采取的技術方案為:一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽，其特征在于該抗氧化膠原肽的氨基酸序列為Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQID No:1), ES1-MS 檢測給出分子量為 m/z 631.70 Da ([M+H] + 632.49 Da)。
[0009]本發(fā)明為解決上述第二個技術問題所采取的技術方案為:一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
I)將大黃魚魚鱗用自來水洗凈，按照固液比I g:l(Tl5mL加入2~3%鹽酸處理2(T24h，過濾除去鹽酸后，按照固液比I g: 10~15 mL加入0.08~0.10 mol/L NaOH處理20~24 h ;過濾，蒸餾水洗至pH 6.5^7.5，30-35 1:干燥后用粉碎機粉碎。
[0010]2)取粉碎后魚鱗粉末，按照料液比I g:8~10 mL加入緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至9.0~10.0，于 45~50°C保溫 5-10 min;
3)按照魚鱗質(zhì)量的1.5~2.0%加入堿性蛋白酶，于45飛(TC溫度下酶解4飛h，將酶解液加熱到90~95°C滅活5~10 min, 4500~5000 r/min離心10~15 min,取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化膠原肽。[0011]作為優(yōu)選，步驟2)中的緩沖液為pH為10的甘氨酸-NaOH緩沖液。
[0012]作為優(yōu)選，步驟3)中的蛋白酶為堿性蛋白酶，酶活力> 1.8 X IO6 U/g。
[0013]作為改進，步驟3)的超濾和層析的具體過程為:
超濾:將上清液調(diào)至pH 6.5~7.5，于0.10~0.15 MPa的工作壓力和20~25 V的工作溫度下采用分子量I kDa的超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液；層析:將上述超濾酶解液用雙蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，經(jīng)過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液進行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解液；將上述離子交換層析酶解液用雙蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，經(jīng)過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成45飛5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，根據(jù)抗氧化活性得I個高活性抗氧化肽Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)。
[0014]優(yōu)選，陰離子交換樹脂為DEAE-52 cellulose，凝膠為葡聚糖凝膠G_15。
[0015]再優(yōu)選，反相高效液相色譜條件為:進樣量19~21 μ g ;色譜柱為Kromasil C18 ;柱溫為30 0C ;流動相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:(T35 min乙腈濃度從O至50% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。
[0016]本發(fā)明為解決上述第三個技術問題所采取的技術方案為:一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的應用，其特征在于 Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)對 DPPH自由基、羥基自由基、ABT S自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用；Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)具有抗氧化活性強、易于消化吸收和安全無毒副作用等優(yōu)點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑進行應用。
[0017]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明選用堿性蛋白酶作為酶解用酶，通過生物酶解法同時融合超濾分級和色譜精制，酶解過程易監(jiān)控，同時制得的膠原肽具有較高的抗氧化活性；與化學合成的抗氧化劑相比較，本發(fā)明制得的抗氧化膠原肽具有抗氧化活性強、易于消化吸收和安全無毒副作用等優(yōu)點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明的陰離子交換樹脂DEAE-52 cellulose層析圖；
圖2是本發(fā)明的陰離子交換樹脂DEAE-52 cellulose層析所分離各組分的羥基自由基清除活性圖；
圖3是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-15層析圖；
圖4是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-15層析所分離各組分的羥基自由基清除活性圖；
圖5是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-15制備酶解物(F23)的RP-HPLC圖；
圖6是本發(fā)明的Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)的反相高效液相色譜(RP-HPLC)；
圖 7 是本發(fā)明的 Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly(SEQ ID No:1)的高分辨質(zhì)譜(ES1-MS)圖和結構式?！揪唧w實施方式】
[0019]以下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0020]一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽肽的制備方法，制備工藝流程如下:大黃魚魚鱗〃脫鈣、去除非膠原蛋白"酶解"酶解物"超濾"離子交換層析"凝膠過濾層析"高效液相色譜制備"抗氧化膠原肽。
[0021]實施例1:1)將大黃魚魚鱗用自來水洗凈，按照固液比I g: 10 mL加入2.5%鹽酸處理24 h，過濾除去鹽酸后按照固液比I g: 15 mL加入0.10 mol/L NaOH處理24 h ;過濾,蒸懼水洗至pH 7.0,35 1:干燥后用粉碎機粉碎。
[0022]2)取粉碎后魚鱗粉末，按照料液比I g: 10 mL加入甘氨酸-NaOH緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至 9.5,于 45°C保溫 10 min;
3)按照魚鱗質(zhì)量1.5%加入堿性蛋白酶(酶活力≤1.8X106U/g)，于45 °C溫度下酶解5 h，將酶解液加熱到95 °C滅活10 min, 4500 r/min離心15 min,取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化膠原肽。
[0023]①超濾:將酶解上清液調(diào)至pH 7.0，于0.12 MPa的工作壓力和25 V的工作溫度下采用分子量I kDa的超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液；
②DEAE-52cellulose陰離子交換層析:將上述超濾酶解液用雙蒸水配成10 mg/mL的溶液，經(jīng)過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.50 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解液(F2)(圖1)
③凝膠層析:將上述離子交換層析酶解液(F2)用雙蒸水配成10mg/mL的溶液，經(jīng)過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物(F23)(圖2)
④高效液相色譜精制:將上述凝膠制備酶解物(F23)用雙蒸水配成50μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化(條件:進樣量20 μ g ;色譜柱為Kromasil C18(250 mm X 4.6 mm, 5 μ m);柱溫為室溫；流動相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:0-35 min乙腈濃度從O至50% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm,根據(jù)抗氧化活性得I個高活性抗氧化肽(見圖3)。
[0024]⑤結構檢測:收集羥基自由基清除活性最高的I個抗氧化肽經(jīng)檢測為單一峰(見圖4)，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Gly-PiO-Thr-Gly-Phe-PiO-Gly (SEQID No:1)，ES1-MS 檢測給出分子量為 m/z 631.70 Da ([M+H]+ 632.49 Da)(見圖 5)。
[0025]將上述制得的大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ IDNo:1)進行DPPH自由基清除實驗、羥基自由基清除實驗、ABTS自由基清除實驗、超氧陰離子自由基清除實驗和脂質(zhì)過氧化抑制實驗。實驗結果表明:Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly(SEQ ID No:1)對 DPPH 自由基(EC50 0.83 mg/mL)、羥基自由基(EC5tl 0.25 mg/mL)、ABTS(EC50 0.34 mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC50 0.15 mg/mL)具有良好的清除作用；同時，Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用。
[0026]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所 有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種大黃魚魚鱗蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽的氨基酸序列為Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)，分子量為 m/z 631.70 Da。
2.—種權利要求1所述的大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將大黃魚魚鱗用自來水洗凈，按照固液比Ig:l(Tl5mL加入2~3%鹽酸處理2(T24h，過濾除去鹽酸后按照固液比I g: 10~15 mL加入0.08~0.lmol/L NaOH處理20~24 h ;過濾，蒸餾水洗至pH 6.5^7.5，3(T35 °C干燥后用粉碎機粉碎； 2)取粉碎后魚鱗粉末，按照料液比Ig: 8~10 mL加入緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至9.0~10.0，于45~50 °C保溫5~10 min ； 3)按照魚鱗質(zhì)量1.5~2.0%加入蛋白酶，于45飛O °C溫度下酶解4飛h，將酶解液加熱到90~95°C滅活5~10 min, 4500~5000 r/min離心10~15 min,取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化膠原肽。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的緩沖液為pH為10的甘氨酸-NaOH緩沖液。
4.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的蛋白酶為堿性蛋白酶，酶活力≥1.8 X IO6U/g。
5.根據(jù)權利要 求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的超濾和層析的具體過程為: 超濾:將上清液調(diào)至pH 6.5~7.5，于0.10~0.15 MPa的工作壓力和20~25 1:的工作溫度下采用分子量I kDa的超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液； 層析:將上述超濾酶解液用雙蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，經(jīng)過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液進行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解液；將上述離子交換層析酶解液用雙蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，經(jīng)過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用羥基配成45飛5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，根據(jù)抗氧化活性得I個高活性抗氧化肽Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述陰離子交換樹脂為DEAE-52cellulose，所述凝膠為葡聚糖凝膠G-15 ;所述反相高效液相色譜條件為:進樣量19~21μ g ;色譜柱為Kromasil C18 ;柱溫為室溫；流動相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:0~35 min乙腈濃度從O至50% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。
7.一種權利要求1所述的大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的應用，其特征在于Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)對 DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS 自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ IDNo:1)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用；Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro_Gly(SEQ ID No:1)具有抗氧化活性強、易于消化吸收和安全無毒副作用等優(yōu)點，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑上應用。
【文檔編號】A23L1/305GK103992386SQ201410218199
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權日:2014年5月22日
【發(fā)明者】遲長鳳, 王斌, 陳蔭, 胡發(fā)遠 申請人:浙江海洋學院