一種利用snp開(kāi)發(fā)與snp緊密連鎖的snp-ssr分子標(biāo)記的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用SNP開(kāi)發(fā)與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標(biāo)記的方法，步驟如下：(1)根據(jù)待開(kāi)發(fā)樣品的已知SNP分子標(biāo)記在遺傳圖譜上的位置，查找獲得SNP標(biāo)記延伸序列；(2)將SNP標(biāo)記延伸序列在待開(kāi)發(fā)樣品的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取序列片段；(3)以重復(fù)序列長(zhǎng)度≥20bp，對(duì)完全型、不完全型、復(fù)合型三種SSR進(jìn)行查找，獲得SSR位點(diǎn)；(4)根據(jù)SSR位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)域設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，選取帶型穩(wěn)定清晰的，獲得待驗(yàn)證分子標(biāo)記；(5)利用待驗(yàn)證分子標(biāo)記的引物，制得SNP-SSR分子標(biāo)記。本發(fā)明所述方法能夠快速大量的篩選與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標(biāo)記。
【專利說(shuō)明】—種利用SNP開(kāi)發(fā)與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標(biāo)記的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用SNP開(kāi)發(fā)與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標(biāo)記的方法，屬于小麥分子生物技術(shù)與分子標(biāo)記應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，每個(gè)基因組上存在的分子標(biāo)記的多態(tài)也有較大差異。通過(guò)前人構(gòu)建的分子遺傳圖譜發(fā)現(xiàn)A、B基因組上分子標(biāo)記較多，而D基因組各個(gè)染色體上的標(biāo)記較少，尤其是4D和5D染色體，這也為存在這些染色體上控制重要性狀的基因的克隆帶來(lái)了較大的困難。因此，開(kāi)發(fā)4D和染色體上新的分子標(biāo)記不僅能夠加密飽和分子遺傳圖譜，而且對(duì)克隆控制重要性狀(如矮敗不育性狀、抽穗期等性狀)的基因奠定良好的基礎(chǔ)。
[0003]在各類分子標(biāo)記中，基于PCR的SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記及其豐富,且廣泛分布于基因組中。因具有超變異性及位點(diǎn)專一性、共顯性和多等位基因等優(yōu)越性得到廣泛應(yīng)用。但由于受小麥基因組測(cè)序困難的限制，以前的SSR標(biāo)記只能計(jì)算出遺傳位置，沒(méi)有確定的物理位置，不利于基因的精細(xì)定位及克隆。
[0004]但隨著A基因組和D基因組測(cè)序工作的完成，以及D基因組物理圖譜的構(gòu)建為開(kāi)發(fā)物理位置確定的SSR標(biāo)記提供了幫助，但目前仍然沒(méi)有一種有效的SSR標(biāo)記定位方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用SNP開(kāi)發(fā)與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標(biāo)記的方法。
[0006]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0007]一種利用SNP開(kāi)發(fā)與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標(biāo)記的方法，步驟如下:
[0008](I)根據(jù)待開(kāi)發(fā)樣品的已知SNP分子標(biāo)記在遺傳圖譜上的位置確定該標(biāo)記所在區(qū)段對(duì)應(yīng)的已知遺傳物理圖譜的近緣物種的位置，查找獲得SNP標(biāo)記延伸序列；
[0009](2)將步驟(1)的SNP標(biāo)記延伸序列在待開(kāi)發(fā)樣品的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)相似度≥ 99%的條件，選取長(zhǎng)度范圍為50kb到IOOkb的序列片段；
[0010](3)以重復(fù)序列長(zhǎng)度≥20bp，按照二堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于10次，三堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于7次，四堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于5次的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)完全型、不完全型、復(fù)合型三種SSR進(jìn)行查找，獲得SSR位點(diǎn)；
[0011](4)根據(jù)步驟(3)獲得的SSR位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)域設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，選取帶型穩(wěn)定清晰的，獲得待驗(yàn)證分子標(biāo)記；
[0012](5)利用步驟⑷的待驗(yàn)證分子標(biāo)記的引物，PCR擴(kuò)增不同品系的待開(kāi)發(fā)樣品，選取結(jié)果具有多樣性的分子標(biāo)記，制得SNP-SSR分子標(biāo)記。
[0013] 上述SNP標(biāo)記延伸序列英文名稱:SNP extended sequences。其在Ming-ChengLuoj Yong Q.Guj Frank M.You, Karin R.Deal,Yaqin Mu，Yuqin Huj Naxin Hu0.Yi Wang.A4-gigabase physical map unlocks the structure and evolution ofthe complex genome of Aegilops tauschii, the wheat D—genome progenitor.PNASj 2013，110(19):7940-7945.中有相關(guān)的報(bào)道。
[0014]上述近緣物種為遺傳學(xué)領(lǐng)域?qū)I(yè)術(shù)語(yǔ)，指包括袓先物種及與其有一定親緣關(guān)系的物種。
[0015]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的待開(kāi)發(fā)樣品為小麥，所述的已知遺傳物理圖譜的近緣物種為粗山羊草。
[0016]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的小麥的已知SNP分子標(biāo)記在遺傳圖譜上的位置確定該標(biāo)記所在區(qū)段對(duì)應(yīng)的粗山羊草的位置，為登陸數(shù)據(jù)庫(kù)查找SNP標(biāo)記延伸序列；數(shù)據(jù)庫(kù)為 http: //probes, pw.usda.gov/ffheatDMarker/?
[0017]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的待開(kāi)發(fā)樣品為小麥D基因組。
[0018]根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的，所述SNP標(biāo)記延伸序列在待開(kāi)發(fā)樣品的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，為登陸小麥D基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)；
[0019]所述數(shù)據(jù)庫(kù)選用Jizeng Jia, Shancen zhao, Xiuying Kong, Yingrui Li, GuangyaoZhao, Weiming He, Rudi Appels.Aegilops tauschii draft genome sequence reveals agene repertoire for wheat adaptation.Nature Letter, 2013, 496:91-95.或 http://wheat-urg1.Versailles, inra.fr/Seq-Repository/BLAST 的數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0020]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的 ，所述步驟(3)中的查找，為采用SSRHunter軟件進(jìn)行查找。
[0021]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中的設(shè)計(jì)引物，為采用Primerf.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
[0022]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(4)中設(shè)計(jì)引物的條件為:
[0023]SSR位點(diǎn)的開(kāi)始和結(jié)束位置分別距5'和3'端不少于20bp ;引物長(zhǎng)度18~25bp ;退火溫度Tm值50~65°C，且上游引物和下游引物的Tm值相差不大于5°C ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100~400bp ;軟件評(píng)分80分以上，引物不能產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0024]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(5)中的多樣性為PCR產(chǎn)物帶型清晰且在不同的材料中帶型有差異。
[0025]有益效果
[0026]1、本發(fā)明首次公開(kāi)了利用SNP開(kāi)發(fā)與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標(biāo)記的方法，該方法能夠快速大量的篩選與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標(biāo)記，對(duì)豐富染色體分子標(biāo)記的多態(tài)性、構(gòu)建高密度的遺傳圖譜及其克隆控制重要性狀如抽穗期的基因具有重要的意義。
[0027]2、通過(guò)本發(fā)明所述方法獲得的與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標(biāo)記可應(yīng)用于品種多態(tài)性的篩選、高密度遺傳圖譜的構(gòu)建及制重要產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的基因的精細(xì)定位和克隆，能夠極大縮短研究周期，加快速度，降低成本，具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉，周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，為控制小麥重要性狀基因的克隆提供了技術(shù)支持，提高了效率和質(zhì)量。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1、SNP-SSR引物Xtdc38和Xtdc44PCR在不同材料中的擴(kuò)增結(jié)果；[0029]圖中:1、山農(nóng)19，2、山農(nóng) 20，3、衡 6632，4、衡 6503，5、衡 4568，6、衡觀 76，7、科農(nóng)1006，8、科農(nóng) 2009，9、鄭麥 0856，10、鄭麥 7698，11、西農(nóng) 529，12、西農(nóng) 157，13、泛 7030，14、10 繁 27，15、花培 3 號(hào)，16、豫麥 57，17、SDAUl, 18、SDAU2,19、SDAU3，20、SDAU4，21、SDAU5,22、N5A，23、N5B，24、N5D ；
[0030]圖2、標(biāo)記Xtdcll、Xtdc31、Xtdc38和Xtdc44在在DH群體部分家系中的多態(tài)性；
[0031]圖中:箭頭所示為多態(tài)性位點(diǎn)，自左向右的泳道對(duì)應(yīng)DH群體家系編號(hào)從97到145，其中 140 缺失，M =Marker0
[0032]圖3、添加X(jué)tdcll、Xtdc31、Xtdc38、Xtdc44分子標(biāo)記后的小麥分子遺傳圖譜。【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
[0034]實(shí)驗(yàn)材料
[0035]普通小麥品種:
[0036]山農(nóng)19和山農(nóng)20購(gòu)自山東圣豐種業(yè)科技有限公司；
[0037]衡6632、衡6503、衡4568和衡觀76購(gòu)自河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所；
[0038]科農(nóng)1006和科農(nóng)2009購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心；
[0039]鄭麥0856購(gòu)自北京德農(nóng)種業(yè)公司；鄭麥7698購(gòu)自河南新木種業(yè)公司；
[0040]西農(nóng)529和西農(nóng)157購(gòu)自西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院；
[0041]泛7030和10繁27購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所；
[0042]花培3號(hào)和豫麥57購(gòu)自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；
[0043]人工合成六倍體材料和中國(guó)春缺體-四體系材料:
[0044]人工合成六倍體材料:采用四倍體材料TK98-506H83-1631-1和二倍體材料新疆節(jié)節(jié)麥(AE.SQUARR0SA)，將上述四倍體材料和二倍體材料通過(guò)常規(guī)雜交后經(jīng)秋水仙素處理使染色體加倍而獲得，命名為:SDAU1、SDAU2、SDAU3、SDAU4和SDAU5 ;上述四倍體材料TK98-506H83-1631-1和二倍體材料新疆節(jié)節(jié)麥(AE.SQUARR0SA)為本領(lǐng)域常用育種材料；
[0045]中國(guó)春缺體-四體系材料由來(lái)源于國(guó)家小麥改良分中心的中國(guó)春材料按照SearsE.R.(1958).1n:Proc.1st Int.Wheat Genet.Symp.，pp.221-228 中記載的內(nèi)容方法制備獲得，命名為 N5AT5D、N5BT5D 和 N5DT5B ；
[0046]DH群體購(gòu)自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)檢測(cè)中心品質(zhì)育種研究室；
[0047]所用Contig序列公開(kāi)于 http://probes.pw.usda.gov/ffheatDMarker/ 網(wǎng)站上，序列可以通過(guò)該網(wǎng)站下載。
[0048]PCR儀型號(hào)為德國(guó)Eppendorf5531梯度PCR儀；
[0049]實(shí)施例1
[0050]小麥OTL上與SNP緊密連鎖的新SNP-SSR分子標(biāo)記的獲取方法，包括以下步驟:[0051 ] (I)根據(jù)5DL上分子標(biāo)記Xbarc320-Xwmc215在遺傳圖譜上的位置確定此區(qū)段在粗山羊草物理圖譜http://probes, pw.usda.gov/ffheatDMarker/上的大體位置為ATro4910-AT5D5010，包含90個(gè)SNP標(biāo)記延伸序列；[0052](2)將步驟(1)中90個(gè)SNP標(biāo)記延伸序列對(duì)小麥D基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)(JizengJia, Shancen zhao, Xiuying Kong, Yingrui Li, Guangyao Zhao, Weiming He, Rudi Appels.Aegilops tauschii draft genome sequence reveals a gene repertoire for wheatadaptation.Nature Letter, 2013, 496:91-95.)講行本地 blast 或 http://wheat-urg1.Versailles, inra.fr/Seq-Repository/BLAST提供的小麥基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),根據(jù)相似度> 99%的條件，選取長(zhǎng)度范圍為50kb到IOOkb的序列片段；
[0053] 以Xtdc38為例，以羅明成等構(gòu)建的物理圖譜上(http: //probes, pw.usda.gov/ffheatDMarker/)的ATOT4993的contig序列對(duì)賈繼增等建立的D基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast,找到相匹配的序列是KD546761。
[0054](3)以重復(fù)序列長(zhǎng)度≥20bp，按照二堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于10次，三堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于7次，四堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于5次的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)完全型、不完全型、復(fù)合型三種SSR進(jìn)行查找，獲得SSR位點(diǎn)；
[0055]如，用SSRhunter軟件對(duì)KD546761進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，設(shè)定最小重復(fù)單元為20bp，按照二堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于10次，三堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于7次，四堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于5次的標(biāo)準(zhǔn)，找到重復(fù)序列:
[0056]GGATGACGATGCGCCACGTGGTGGTGAGGCTGAAGAAGATCAAAGCTGAGTTCACTGGGCGGACAGTGAAGACATCGTGTAGTGCAACAGAGTGATCGAGCTACCTAGTTTCTTGCCTCCTGTCCCATCTATAAATGTGCATTCATGTATTTGTTTCTCTTCTTATTCCAATGTATTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCATCACAGTAATCACGTCTACCTTAAGTAGAAAGCAAAGCCAGGGAAAATGTAGTCCTTCTAGCAAATGTATTTGCAGATTGTTCTCTGAGCAAGTGGAGTACGTCGGTCACTTATAATTGTGCTAGTCAAATGAAGATCAACCAATAACGTATTCTTTTGCGTTGGTGGAGCGACCAGTGAGCTGATo
[0057]對(duì)ATro4920-AT5D5010的約90條SNP序列對(duì)小麥的D基因組進(jìn)行blast，搜索SSR位點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)109個(gè)SSR位點(diǎn)。其中二、三、四核苷酸重復(fù)基元各有67個(gè)，34個(gè)，8個(gè)，各占61.47%,31.19%，7.34%。在109個(gè)SSR中二核苷酸基元TC/AG或CT/GA出現(xiàn)頻率最高，共 37 個(gè)，占 SSR 總數(shù)的 33.94%。AC/GT 或 CA/GT 共 17 個(gè)，占 15.60 %。AT/TA (占 11%)也有較高的出現(xiàn)頻率。三核苷酸基元TTC/AAG出現(xiàn)頻率最高，占SSR總數(shù)的11.93%。其次是CCT/GGA、CAT/GTA、CGG/GCC，出現(xiàn)頻率分別為3.67%, 3.67%, 2.75%，其他類型出現(xiàn)頻率較低。四核苷酸基元個(gè)類型出現(xiàn)的頻率均較低。
[0058]對(duì)于重復(fù)次數(shù)，二核苷酸基元的重復(fù)次數(shù)類型多、跨度大。其中GA/CT或AG/TC的重復(fù)次數(shù)類型最多，跨度最大，為16種，從重復(fù)10次到50次；其次是AC/TG或CA/GT，重復(fù)次數(shù)類型為12種，重復(fù)11次到38次；AT/TA或TA/AT也有較大的重復(fù)次數(shù)跨度，有9種重復(fù)類型，重復(fù)次數(shù)為10-30次。三核苷酸基元的重復(fù)次數(shù)類型和跨度小于二核苷酸。其中TTC/AAG或CTT/GAA有10種重復(fù)類型，重復(fù)次數(shù)8_38次，重復(fù)次數(shù)類型最多，跨度最大；其次是CCT/GGA，CAT/GTA。如表1所示。
[0059]表1主要重復(fù)基元類型及跨度分布
[0060]
[0061]
【權(quán)利要求】
1.一種利用SNP開(kāi)發(fā)與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標(biāo)記的方法，其特征在于，步驟如下: (1)根據(jù)待開(kāi)發(fā)樣品的已知SNP分子標(biāo)記在遺傳圖譜上的位置確定該標(biāo)記所在區(qū)段對(duì)應(yīng)的已知遺傳物理圖譜的近緣物種的位置，查找獲得SNP標(biāo)記延伸序列； (2)將步驟(1)的SNP標(biāo)記延伸序列在待開(kāi)發(fā)樣品的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)相似度> 99%的條件，選取長(zhǎng)度范圍為50kb到IOOkb的序列片段； (3)以重復(fù)序列長(zhǎng)度>20bp，按照二堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于10次，三堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于7次，四堿基重復(fù)型的重復(fù)次數(shù)不小于5次的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)完全型、不完全型、復(fù)合型三種SSR進(jìn)行查找，獲得SSR位點(diǎn)； (4)根據(jù)步驟⑶獲得的SSR位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)域設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，選取帶型穩(wěn)定清晰的，獲得待驗(yàn)證分子標(biāo)記； (5)利用步驟(4)的待驗(yàn)證分子標(biāo)記的引物，PCR擴(kuò)增不同品系的待開(kāi)發(fā)樣品，選取結(jié)果具有多樣性的分子標(biāo)記，制得SNP-SSR分子標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的待開(kāi)發(fā)樣品為小麥，所述的已知遺傳物理圖譜的近緣物種為粗山羊草。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的小麥的已知SNP分子標(biāo)記在遺傳圖譜上的位置確定該標(biāo)記所在區(qū)段對(duì)應(yīng)的粗山羊草的位置，為登陸數(shù)據(jù)庫(kù)查找SNP標(biāo)記延伸序列。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的待開(kāi)發(fā)樣品為小麥D基因組。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述SNP標(biāo)記延伸序列在待開(kāi)發(fā)樣品的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)是指登陸小麥D基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中的查找，為采用SSRHunter軟件進(jìn)行查找。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的設(shè)計(jì)引物，為采用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中設(shè)計(jì)引物的條件為: SSR位點(diǎn)的開(kāi)始和結(jié)束位置分別距5'和3'端不少于20bp;引物長(zhǎng)度18~25bp;退火溫度Tm值50~65°C，且上游引物和下游引物的Tm值相差不大于5°C ;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100~400bp ;軟件評(píng)分80分以上，引物不能產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中的多樣性為PCR產(chǎn)物帶型清晰且在不同的材料中帶型有差異。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103966335SQ201410220172
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】鄧志英, 田紀(jì)春, 陳芳, 李文靜, 陳建省 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)