建鯉管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種建鯉管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real?time?PCR方法，通過(guò)對(duì)建鯉血液基因組DNA提取，設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)入T載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，篩選藍(lán)白斑，質(zhì)粒測(cè)序，設(shè)計(jì)的引物序列正向序列如SEQIDNO.1所示，反向序列如SEQIDNO.2所示；克隆得到的建鯉18sRNA基因部分序列為SEQIDNO.3所示；然后設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR（real?time?PCR）特異引物，優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)條件，從而提高擴(kuò)增效率。本發(fā)明可為18sRNA作為管家基因，在利用real?time?PCR對(duì)建鯉功能基因的研究中提供有用的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】建鯉管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real
t i me PCR 方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種建鯉管家基因ISsRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]在實(shí)時(shí)定量PCR (real time PCR)中，目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量是通過(guò)管家基因表達(dá)量的均一化來(lái)確定。理想的管家基因應(yīng)該是它的表達(dá)量不受實(shí)驗(yàn)條件影響，而且在各個(gè)組織中表達(dá)量恒定。大量的研究表明，目前還沒(méi)有哪個(gè)管家基因符合這一條件，最好的管家基因就是其表達(dá)量在自己所研究的樣品中變化量最小。18S rRNA為核糖體rRNA，由45S rRNA加工而成，經(jīng)核孔入胞質(zhì)形成小亞基，參與蛋白質(zhì)的合成。該基因在所有組織中都高水平表達(dá)，在同種細(xì)胞或者組織中的表達(dá)量一般是恒定的，故被廣泛用作real time PCR中的管家基因。
[0005]在用Trizol提取的RNA樣品中，不可避免的會(huì)有少量的DNA殘留，通過(guò)DNAse酶處理去除DNA,反轉(zhuǎn)錄后,real time PCR擴(kuò)增的模板僅為cDNA。另外再設(shè)計(jì)特異的引物,優(yōu)化反應(yīng)條件，達(dá)到理想的擴(kuò)增效率，為后續(xù)的建鯉功能基因研究提供參考。
[0006]建鯉(Cyprinuscarpio var.jian)是本中心培育出的遺傳性狀穩(wěn)定的鯉魚(yú)新品種，具有生長(zhǎng)快、體型佳、肉質(zhì)好等優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)性狀，已遍及我國(guó)27個(gè)省。但是目前還沒(méi)有針對(duì)建鯉通過(guò)研究18sRNA作為管家基因，并利用real time PCR對(duì)建鯉功能基因進(jìn)行研究。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]發(fā)明目的:本發(fā)明目的之一在于克隆出建鯉ISsRNA基因的部分序列；本發(fā)明目的之二在于基于獲得的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異的real time PCR引物,建立基于SYBR Green I染料技術(shù)的建鯉18sRNAreal time PCR方法，從而為18sRNA作為管家基因，在利用real timePCR對(duì)建鯉功能基因的研究中提供有用的方法。
[0009]技術(shù)方案:
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的:
一種建鯉ISsRNA基因的部分序列的克隆方法，按照以下步驟進(jìn)行:建鯉血液基因組DNA提取，設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)入T載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，篩選藍(lán)白斑，質(zhì)粒測(cè)序，其中所設(shè)計(jì)的引物序列如下，其中正向序列如SEQ ID N0.1所示，反向序列如SEQ IDN0.2所示；克隆得到的建鯉18sRNA基因部分序列為SEQ ID N0.3所示。
[0010]所述的建鯉18sRNA基因的部分序列的克隆方法，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:95°C3min ；30循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的條件可以為94°C、15s，58°C、20s，72°C、30s，循環(huán)完以后72°C延長(zhǎng)6min ;4°C度保存。
[0011]—種real time PCR擴(kuò)增以上所述建鯉18sRNA基因部分序列的方法,按以下步驟實(shí)現(xiàn):抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄，然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行real time PCR，熒光染料為SYBRGreen I，其中real time PCR中的建鯉特異引物序列中正向序列如SEQ ID N0.4所示,反向序列如SEQ ID N0.5所示。
[0012]以上所述的real time PCR擴(kuò)增所述建鯉18sRNA基因部分序列的方法，其中所述real time PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件可以為:94°C 3min, 40個(gè)循環(huán)每個(gè)循環(huán)條件為94°C、5s,62°C、20s，最后 72°C 3min，4°C保存。
[0013]有益效果
本發(fā)明通過(guò)克隆建鯉18sRNA的部分序列,然后設(shè)計(jì)特異的real time PCR引物,優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)條件，提高了擴(kuò)增效率。這樣，可為18sRNA作為管家基因，在利用real time PCR對(duì)建鯉功能基因的研究中提供有用的方法。
[0014]
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為實(shí)施例1目的基因鑒定電泳圖，其中M為marker，I為目的條帶。
[0016]圖2為18sRNA溶解曲線圖；
圖3為18sRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0017]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1建鯉18SRNA基因的部分序列的擴(kuò)增
建鯉來(lái)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地，根據(jù)GenBank上公布的斑馬魚(yú)18sRNA基因的DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物序列見(jiàn)表1。
[0018]表1擴(kuò)增建鯉18sRNA的引物
【權(quán)利要求】
1.一種建鯉18SRNA基因的部分序列的克隆方法，按照以下步驟進(jìn)行:建鯉血液基因組DNA提取，設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)入T載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，篩選藍(lán)白斑，質(zhì)粒測(cè)序，其特征在于，所設(shè)計(jì)的引物序列如下，其中正向序列如SEQ ID N0.1所示，反向序列如SEQ ID N0.2所示；克隆得到的建鯉18sRNA基因部分序列為SEQ ID N0.3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建鯉ISsRNA基因的部分序列的克隆方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:95°C 3min ;30循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的條件為94°C、15s，58°C、20s，72°C、30s，循環(huán)完以后72°C延長(zhǎng)6min ;4°C度保存。
3.一種real time PCR擴(kuò)增權(quán)利要求1中所述建鯉18sRNA基因部分序列的方法，其特征在于，按以下步驟實(shí)現(xiàn):抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄，然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行real timePCR，熒光染料為SYBR Green I，其中real time PCR中的建鯉特異引物序列中正向序列如SEQ ID N0.4所示，反向序列如SEQ ID N0.5所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的realtime PCR擴(kuò)增權(quán)利要求1中所述建鯉18sRNA基因部分序列的方法，其特征在于，所述real time PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C 3min,40個(gè)循環(huán)每個(gè)循環(huán)條件為94°C、5s，62°C、20s，最后72°C 3min，4°C保存。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103993006SQ201410221021
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】唐永凱, 李紅霞, 李建林, 俞菊華 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心