一株產(chǎn)原兒茶醛的五味子內(nèi)生真菌的制作方法
【專利摘要】一株產(chǎn)原兒茶醛的五味子內(nèi)生真菌，它涉及一株內(nèi)生真菌。本發(fā)明一株產(chǎn)原兒茶醛的五味子內(nèi)生真菌為原兒茶醛原料的生產(chǎn)提供了新方法。產(chǎn)原兒茶醛的五味子內(nèi)生真菌，它為煙曲霉(Aspergillus?fumigatus)HWT5，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC?No:M?2014131，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2014年4月16日。本發(fā)明中的煙曲霉HWT5，其次生代謝產(chǎn)物中含有原兒茶醛，可采用發(fā)酵法生產(chǎn)原兒茶醛，為原兒茶醛原料的生產(chǎn)提供新方法。
【專利說明】一株產(chǎn)原兒茶醛的五味子內(nèi)生真菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株內(nèi)生真菌。
【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)生真菌的研究日益成為天然產(chǎn)物化學(xué)研究者關(guān)注的熱點之一，內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的種類繁多，包括生物堿類、留體類、職類、苯并吡喃和苯并呋喃類、香豆素和異香豆素類、醌類、黃酮類、酚和酚酸類、內(nèi)酯類、脂肪族化合物、氨基酸、肽類等，其藥理活性廣泛，主要表現(xiàn)為抗腫瘤、抗菌、抗病毒、殺蟲、抗結(jié)核、抗氧化等作用。
[0003]五味子(Schisandra Chinensis (Turcz.) Baill.),木蘭科多年生落葉木藤本植物，主產(chǎn)于東北，為北方瀕危道地藥材，果實入藥。
[0004]煙曲霉是引起人類肺部感染非常重要的一種曲霉菌，有從泥土、海洋、植物中分離得到，其次生代謝產(chǎn)物多具有很強的生物活性，進行深入研究，對開展其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用具有較好前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供了一株產(chǎn)原兒茶醛的五味子內(nèi)生真菌，為原兒茶醛原料的生產(chǎn)提供了新方法。
[0006]本發(fā)明一株產(chǎn)原兒茶醒的五味子內(nèi)生真菌，它為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No:M2014131，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2014年4月16日。
[0007]本發(fā)明一株產(chǎn)原兒茶醒的五味子內(nèi)生真菌,它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),菌落初為白色，漸變?yōu)槟G色，易生綠色粉末孢子粉，基質(zhì)黃綠色，菌株頂部形成球狀頂囊，其上全面覆蓋一層一層小梗，分生孢子頭球狀。
[0008]本發(fā)明一株產(chǎn)原兒茶醒的五味子內(nèi)生真菌，它為煙曲霉(Aspergillusfumigatus) HWT5,屬于絲抱菌科(Hyphomycetaceae)曲霉屬(Aspergillus)。
[0009]本發(fā)明一株產(chǎn)原兒茶醒的五味子內(nèi)生真菌，它為煙曲霉(Aspergillusfumigatus) HWT5，依據(jù)《真菌分類學(xué)》、《真菌鑒定手冊》和《半知菌屬圖解》，可見HWT5菌株的菌落特征和孢子形態(tài)與曲霉菌特征極為相近。
[0010]本發(fā)明一株產(chǎn)原兒茶醒的五味子內(nèi)生真菌，它為煙曲霉(Aspergillusfumigatus) HWT5，其序列提交至NCBI網(wǎng)頁，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，HWT5菌株的序列與曲霉屬菌，菌株的同源性都達到了 99%以上，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果,鑒定HWT5菌株為煙曲霉(Aspergillus fumigatusHWT5)。
[0011]本發(fā)明一株產(chǎn)原兒茶醒的五味子內(nèi)生真菌，它為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No:M2014131，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2014年4月16日。[0012]本發(fā)明從野生北五味子的藤莖中分離得到五味子內(nèi)生真菌，它為煙曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5，采用HPLC法對五味子內(nèi)生真菌HWT5的發(fā)酵代謝產(chǎn)物進行測定，結(jié)果顯示，五味子內(nèi)生真菌HWT5次生代謝產(chǎn)物中含有原兒茶醛，該成分不僅具有廣譜抗菌作用，而且還具有降低冠脈阻力，增加冠脈血流量，抑制二磷酸腺苷所致的血小板凝集，抗氧化等作用，是一種重要的醫(yī)藥原料、醫(yī)藥中間體。
[0013]本發(fā)明中的煙曲霉HWT5，其次生代謝產(chǎn)物中含有原兒茶醛，因此可采用本發(fā)明的煙曲霉HWT5發(fā)酵法生產(chǎn)原兒茶醛，為原兒茶醛原料的生產(chǎn)提供新方法。
[0014]本發(fā)明中的煙曲 霉HWT5，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單孢菌、單增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、化膿鏈球菌、屎腸球菌、糞腸球菌和白色念珠菌具有抑制作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為【具體實施方式】一中煙曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5的菌落形態(tài)圖；
[0016]圖2為【具體實施方式】一中煙曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5的菌落形態(tài)圖；
[0017]圖3為【具體實施方式】一中煙曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5的18SrDNA的PCR產(chǎn)物的電泳圖；
[0018]圖4為【具體實施方式】一中煙曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5的系統(tǒng)進化樹圖；
[0019]圖5為【具體實施方式】一中原兒茶醛對照品的HPLC色譜圖，其中I表示原兒茶醛；
[0020]圖6為【具體實施方式】一中HWT5發(fā)酵液HPLC色譜圖，其中I表示原兒茶醛；
[0021]圖7為【具體實施方式】一中加原兒茶醛對照品后的HWT5發(fā)酵液的HPLC色譜圖，其中I表不原兒茶醒。
【具體實施方式】
[0022]【具體實施方式】一:本實施方式一株產(chǎn)原兒茶醒的五味子內(nèi)生真菌，它為煙曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNo:M2014131，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2014年4月16日。
[0023]本實施方式中煙曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5,它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落初為白色，漸變?yōu)槟G色，易生綠色粉末孢子粉，基質(zhì)黃綠色，菌株頂部形成球狀頂囊，其上全面覆蓋一層一層小梗，分生孢子頭球狀(如圖1和2所示)。
[0024]本實施方式中煙曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5,其生長溫度為28°C,生長pH值自然。
[0025]本實施方式中煙曲霉(Aspergillus fumigatus)HWT5,該菌株分離自健康的野生北五味子的藤莖，實驗材料分別于2011年及2012年5月、7月、8月、9月采自黑龍江省帽兒山地區(qū)，并經(jīng)黑龍江省中醫(yī)研究院付克治研究員鑒定為木蘭科植物五味子屬SchisandraChinensis (Turcz.)Baill.的植株,樣本現(xiàn)存于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥實驗室；它按以下過程進行分離培養(yǎng):
[0026]取健康的野生北五味子的藤莖，用水沖洗干凈，取韌皮部，用75 %的酒精浸泡3-5min, 10%雙氧水漂洗15min，無菌水沖洗4次，用無菌刀把藤莖韌皮部切成0.5cm的小塊，然后將其置于馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基，于28°C恒溫培養(yǎng)3-7天，待其切口邊緣長出菌落后，挑取菌絲轉(zhuǎn)入馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基多次劃線分離純化，將純化后的菌株于斜面固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4°C保存?zhèn)溆?；另外把最后一次沖洗北五味子藤莖韌皮部的無菌水用無菌的涂布棒涂布在馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基表面上，于28°C恒溫培養(yǎng)，以此作為對照組。
[0027]馬鈴薯液體培養(yǎng)基:
[0028]馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA):每L由200g的馬鈴薯、20g的蔗糖和余量的水組成，pH自然，121°C高壓滅菌30min ;其中馬鈴薯去皮，切成小塊煮沸30min，用6層紗布過濾。
[0029]馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基:
[0030]馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA):每L由200g的馬鈴薯、20g的蔗糖，16g的瓊脂粉和余量的水組成，pH自然，121°C高壓滅菌30min ;其中馬鈴薯去皮，切成小塊煮沸30min，用6層紗布過濾。
[0031]斜面固體培養(yǎng)基:取5mL馬鈴薯固體培養(yǎng)基裝于試管中，121°C高壓滅菌30min后，鋪成斜面冷卻，以備保存菌種。
[0032]試驗用主要儀器設(shè)備和試劑見表1 ;
[0033]表1
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一株產(chǎn)原兒茶醒的五味子內(nèi)生真菌，其特征在于它為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)HWT5,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No:M2014131，保藏地址為武漢市 武漢大學(xué)，保藏日期為2014年4月16日。
【文檔編號】C12R1/68GK103966109SQ201410222209
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】鄭春英, 矯佳陳琦, 陸欣媛, 張萍 申請人:黑龍江大學(xué)