血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1的應用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血清外泌體(Exosomes)來源的長鏈非編碼RNA(long?no-coding?RNA，LncRNA)PRKAG2-AS1的應用方法，即血清Exosomes來源的LncRNA?PRKAG2-AS1用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑。通過研究證實在膠質瘤患者血清中分離Exosomes后提取RNA，逆轉錄并進行實時熒光定量分析發(fā)現LncRNA?PRKAG2-AS1表達水平下降。利用本發(fā)明的制劑對膠質瘤早期診斷的特異性可達85.7％，靈敏度達到88.2％。通過檢測膠質瘤患者血清Exosomes中LncRNA?PRKAG2-AS1的表達水平，從而對膠質瘤患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。
【專利說明】血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1的應用
方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及血清Exosomes來源的LncRNAPRKAG2-AS1在制備膠質瘤患者預后試劑中應用方法。
【背景技術】 [0002]膠質瘤約占顱內腫瘤的40.49%。腦腫瘤中膠質細胞瘤發(fā)病率最高，大腦半球發(fā)生的膠質瘤約占全部膠質瘤的51.4%。由于大多數膠質瘤呈浸潤性生長且與周圍腦組織邊界不清，即使是最現代的神經外科技術也難以做到病理學上的全切除，因而膠質瘤術后復發(fā)率非常高，且隨著手術和復發(fā)次數的增加，其惡性程度有增加的趨勢。目前而言膠質瘤的診斷和治療方法雖處于不斷改進階段，但是膠質瘤患者生存率并沒有明顯提高。膠質瘤診斷仍然處于以臨床、病理學和影像學信息為基礎的經驗性階段，而且一經診斷，絕大多數均為中晚期，遠遠不能適應對膠質瘤進行高危人群篩查和早期診斷的需求。因此，尋找無創(chuàng)傷性的膠質瘤早期診斷標志物對高危人群進行篩查，以便對膠質瘤患者進行早期診斷、早期治療，提高患者生存率，一直是神經科學領域研究的主要任務。
[0003]Exosomes來源于多囊泡體，是由活細胞分泌而來的大小介于30_100nm的含有RNA、脂質和蛋白質的微囊泡。Exosomes廣泛存在于血清，尿液，細胞培養(yǎng)上清，唾液等各種體液中，可在體液中來回穿梭，在細胞之間運送遺傳物質和蛋白質。研究發(fā)現，在順鉬誘導急性腎損傷的大鼠模型的尿液Exosome中發(fā)現Fetuin-A表達上調，由此尿液Exosome中Fetuin-A的檢測可作為診斷標志物；在膀胱癌患者尿液來源的Exosomes中還發(fā)現了PCA-3, TMPRSS2兩個生物標志物；在黑色素瘤患者血漿Exosomes中腫瘤相關標志物CAVl表達水平明顯增加，以此可診斷黑色素瘤；腫瘤細胞來源的Exosomes中miRNA的表達譜可作為卵巢癌的診斷標記物。因此Exosomes可用于腫瘤的早期診斷，也可作為靶向藥物的載體進行疾病治療。Exosomes具有在血清中穩(wěn)定存在的特性，含有特異性的物質且可保護RNA免受RNA酶的作用，克服了直接利用血液提取分子進行腫瘤診斷的血液中非檢測物質的影響，使檢驗結果更加真實，精確。利用Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1來診斷腦膠質瘤不僅減少了患者的痛苦和不便，而且提高了檢驗結果的靈敏性，特異性。以上顯示出血清Exosomes來源的LncRNA PRKA G2-AS1在膠質瘤早期診斷和篩查中的巨大潛力。
[0004]LncRNA PRKAG2-AS1(protein kinase, AMP-activated, gamma2non-catalyticsubu nit)定位于染色體7q36.1，GeneBank登錄號:NR_038926。有研究證實PRKAG2可在TP53的信號通路中發(fā)揮作用，并且PRKAG2與癌癥患者的存活率密切相關。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種血清Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1的應用方法，尤其是一種能夠用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑的應用方法。研究證實血清Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1可用于膠質瘤患者的診斷，Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1表達下調與膠質瘤組織驗證結果具有一致性，且檢驗結果的靈敏性高，特異性好。因此Exosomes可用于膠質瘤高危人群的篩查和早期診斷和預后。
[0006]血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA PRKAG2-ASI的應用方法，所述的血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑，該長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1的序列見SEQ NO:1。
[0007]所述的用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑具體包括實時熒光定量PCR檢測試劑。
[0008]所述的實時熒光定量PCR檢測試劑包括進行實時熒光定量PCR的特異性引物:
[0009]LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5，-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3，，
[0010]LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5，-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3，。
[0011]所述的實時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒，
[0012]該試劑盒包括:(I)從膠質瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNA PRKAG2-AS1逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及LncRNA PRKAG2-AS1所用隨機引物；(3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括LncRNAPRKAG2-AS1實時熒光定 量PCR特異性引物、U6snRNA內參特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水；
[0013]LncRNA PRKAG2-AS1實時熒光定量PCR特異性引物:
[0014]正向引物:5’-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3’，
[0015]反向引物:5’-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3’。
[0016]U6snRNA內參特異性PCR引物:
[0017]正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0018]反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
[0019] 申請人:通過癌癥基因圖集TCGA數據庫分析發(fā)現Lnc RNA PRKAG2-AS1在正常人與膠質母細胞瘤中的表達存在明顯差異(P = 0.0156)(圖1)。通過熒光定量分析發(fā)現Lnc RNA PRKAG2-AS1在52例膠質瘤組織與12例正常人的腦組織中存在差異性表達(P =
0.0005)(圖2),且在膠質瘤組織中表達下調,進一步在血清中分離Exosomes用于LncRNAPRKAG2-ASI的檢測，發(fā)現LncRNA PRKAG2-ASI的表達與正常人的表達存在明顯的差異(P = 0.0306)(圖3)，且與組織中的檢測結果相一致。此方法可以檢測各人群中LncRNAPRKAG2-AS1的表達水平，從而預測膠質瘤的患病風險，篩查易感人群，并對膠質瘤患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。本發(fā)明對膠質瘤早期診斷特異性好(圖4)，可達85.7%，靈敏度可達88.2%，只需在Exosomes提取RNA即可檢測LncRNA PRKAG2-AS1的表達水平，操作簡單，穩(wěn)定性好。不僅可用于膠質瘤的早期診斷而且可以用于膠質瘤患者的大規(guī)模篩查和患病風險的預測，為膠質瘤的早期診斷和預測提供了強有力的技術支持，具有深遠的臨床意義和推廣性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為癌癥基因圖集TCGA數據庫中LncRNA PRKAG2-AS1在膠質母細胞瘤與正常腦組織中的表達差異；
[0021 ] 圖2為實時熒光定量PCR分析LncRNA PRKAG2-AS1在膠質瘤組織與正常腦組織中的表達差異；
[0022]圖3為實時熒光定量PCR分析Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1在膠質瘤患者與正常人中的表達差異；
[0023]圖4為Roc分析Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1對膠質瘤早期診斷的特異性，靈敏性。
【具體實施方式】
[0024]以下結合實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0025]實施例1制備長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1用于膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者預后的試劑盒(50次反應)
[0026]1.RNA 穩(wěn)定溶液 50ml
[0027]2.異丙醇 100mL
[0028]3.三氯甲烷 100mL
[0029]4.Trizol 50ml [0030]5.無酶水 IOml
[0031]6.1 μ M隨機逆轉錄引物50ul
[0032]7.5 X逆轉錄緩沖液200ml
[0033]8.1OmM三磷酸堿基脫氧核苷酸IOOul
[0034]9.40U/ μ I RNA 酶抑制劑 500ul
[0035]10.200U/ μ I MMLV 逆轉錄酶 50ul
[0036]11.Premix Ex Taq 50ul
[0037]12.10 μ M LncRNA PRKAG2-AS1 實時熒光定量 PCR 特異性引物 30ul
[0038]LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5，-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3，，
[0039]LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5，-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3，；
[0040]13.10 μ M U6SnRNA 特異性引物 3Oul
[0041]正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'
[0042]反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
[0043]實施例2
[0044]LncRNA PRKAG2-AS1在膠質瘤組織與正常腦組織中的表達差異的驗證
[0045]1、收集待測膠質瘤組織放入盛有RNA穩(wěn)定溶液的凍存管中，放至_80°C冰箱備用。
[0046]2、組織中RNA的抽提:取適量標本于經180°C烘烤6_8h后的研缽中加入液氮研磨標本，研磨至粉末狀后于研缽中加入1ml Trizol研缽標本,研磨成液體狀后用移至tube管，加氯仿200μ 1/mlTrizol于Tube中，用手震蕩15_30s，冰上放置5min，4°C 12000g離心15min ;小心取上層水相入新tube中，加入預冷的異丙醇0.5ml/mlTrizol混勻,_20°C冰箱靜置20min，4°C 12000g離心10min ;棄上清，加入75% DEPC水稀釋的乙醇l_2ml混勻，40C 7500g離心5min，盡量棄上清，室溫干燥5_10min，加入DEPC水10-20 μ I溶解RNA。分光光度計測RNA的濃度及質量，0D260/280比值在1.8-2.0之間，_80°C保存。[0047]3、LncRNA PRKAG2-AS1逆轉錄:使用Thermo公司的逆轉錄試劑盒。20 μ L逆轉錄
反應的體系如下:
[0048]
【權利要求】
1.血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNAPRKAG2-AS1的應用方法，其特征在于，所述的血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑，該長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1的序列見SEQ NO:1。
2.根據權利要求1所述的長鏈非編碼RNAPRKAG2-AS1的應用方法，其特征在于，所述的用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑包括實時熒光定量PCR檢測試劑。
3.根據權利要求2所述的長鏈非編碼RNAPRKAG2-AS1的應用方法，其特征在于，所述的實時熒光定量PCR檢測試劑包括進行實時熒光定量PCR的特異性引物:
LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5’ -CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3’， LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5’-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3’。
4.根據權利要求3所述的長鏈非編碼RNAPRKAG2-AS1的應用方法，其特征在于，所述的實時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒， 該試劑盒包括:(I)從膠質瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNA PRKAG2-AS1逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及LncRNA PRKAG2-ASI所用隨機引物；(3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括LncRNAPRKAG2-ASl實時熒光定量PCR特異性引物、U6snRNA內參特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水； LncRNA PRKAG2-AS1實時熒光定量PCR特異性引物: LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5’-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3’， LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5’-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3’。 U6snRNA內參特異性PCR引物: 正向引物為 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'， 反向引物為 5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966337SQ201410225037
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權日:2014年5月26日
【發(fā)明者】武明花, 劉長紅, 余志斌, 徐剛, 李桂源 申請人:中南大學