血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA CASC2的應用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血清外泌體(Exosomes)來源的長鏈非編碼RNA(long?no-coding?RNA,LncRNA)CASC2的應用方法，即血清Exosomes來源的LncRNA?CASC2用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑。通過研究證實在膠質瘤患者血清中分離Exosomes后提取RNA，逆轉錄并進行實時熒光定量分析發(fā)現(xiàn)LncRNA?CASC2表達水平下調。本發(fā)明利用血清Exosomes來源的LncRNA?CASC2對膠質瘤早期診斷的特異性可達85.7％，靈敏度達到97.1％。通過檢測膠質瘤患者血清Exosomes中LncRNA?CASC2的表達水平，從而對膠質瘤患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。
【專利說明】血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA CASC2的應用方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學領域,具體涉及血清Exosomes來源的LncRNA CASC2在膠質瘤診斷中的應用方法。
【背景技術】
[0002]腦膠質瘤占顱內腫瘤的40.49%，可發(fā)生于中樞神經系統(tǒng)的任何部位。除少數(shù)星型細胞瘤、毛細胞型細胞瘤可視為良性，預后較好外，多數(shù)患者預后較差，平均存活3-5年。然而，傳統(tǒng)手術很難準確識別腫瘤邊界，對其進行完整的手術切除。目前膠質瘤診斷仍然處于以臨床、病理學和影像學信息為基礎的經驗性階段，膠質瘤的診斷和治療總體上并沒有明顯的進步。目前，對膠質瘤的早期確診和規(guī)范治療還難以令人滿意，因此，尋找特異性的膠質瘤早期診斷標志物對高危人群進行篩查，以便對膠質瘤患者進行早期診斷、早期治療，提高患者生存率，一直是神經科學領域研究的主要任務。
[0003]Exosomes是一類直徑為30_150nm的囊泡，含有RNA、脂質和蛋白質等成分。在血液，唾液，尿液，腦脊液和母乳等多種體液中均有存在，可在體液中來回穿梭，在細胞之間運送遺傳物質和蛋白質。腫瘤在生長過程中會不斷地將Exosomes釋放到周圍環(huán)境中去，同時Exoso mes可以在4°C條件下保存96小時或是_70°C下保存更長時間，而且通過在血清中分離Exosom es進行膠質瘤診斷克服了直接利用血液提取分子進行腫瘤診斷的血液中非檢測物質的影響，使檢驗結果更加真實，精確。這些特點使得Exosomes有助于腫瘤的早期診斷和預后判斷。通過研究在膀胱癌患者尿液來源的Exosomes中發(fā)現(xiàn)了 PCA-3，TMPRSS2兩個生物標志物；在黑色素瘤 患者血漿Exosomes中腫瘤相關標志物CAVl表達水平明顯增加，以此可診斷黑色素瘤，在肺癌模型發(fā)現(xiàn)Exosomes中的miRNA可作為肺癌的標志物。利用Exosomes來源的LncRNA CASC2來診斷腦膠質瘤不但能更好的對膠質瘤患者進行診斷,提早治療，而且使得檢驗結果更加靈敏，特異。以上顯示出血清Exosomes來源的LncRNA CASC2在膠質瘤早期診斷和篩查中的巨大潛力。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種血清Exosomes來源的LncRNA CASC2 (cancersusceptibility candidate2)定位于染色體 10q26.11, GeneBank 登錄號:NR_026939 的應用方法，尤其是一種能夠用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑的應用方法。研究證實血清Exosomes來源的LncRNA CASC2可用于膠質瘤患者的診斷，Exosomes來源的LncRNA CASC2表達下調與膠質瘤組織驗證結果具有一致性,且檢驗結果的靈敏性高，特異性好。因此Exosomes可用于膠質瘤高危人群的篩查和早期診斷和預后。
[0005]血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA CASC2的應用方法,所述的血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA CASC2用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑，該長鏈非編碼RNA CASC2的序列見SEQ NO:1。[0006]所述的用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑包括實時熒光定量PCR檢測試劑。
[0007]所述的實時熒光定量PCR檢測試劑包括進行實時熒光定量PCR的特異性引物:
[0008]CASC2 正向引物 5' -TTGACCCTTCCAGCTTCC-3'，
[0009]CASC2 反向引物 5' -CCATCCGCACATCACAAT-3'。
[0010]所述的實時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒，
[0011]該試劑盒包括:(I)從膠質瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNA CASC2逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及LncRNA CASC2所用隨機引物；(3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括LncRNA CASC2實時熒光定量PCR特異性引物、U6snRNA內參特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水；
[0012]LncRNA CASC2實時熒光定量PCR特異性引物:
[0013]正向引物5' -TTGACCCTTCCAGCTTCC-3'，
[0014]反向引物5' -CCATCCGCACATCACAAT-3'，
[0015]U6snRNA內參特異性PCR引物:
[0016]正向引物為 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0017]正向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
[0018] 申請人:通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn)Lnc RNA CASC2在52例膠質瘤組織與12例正常人的腦組織中存在差異性表達(P = 0.0240)(圖1)，且在膠質瘤組織中表達下調，進一步在血清中分離Exosomes用于LncRNA CASC2的檢測,發(fā)現(xiàn)LncRNA CASC2的表達與正常人的表達存在明顯的差異(P = 0.0418)(圖2)，且與組織中的檢測結果相一致。此方法可以檢測各人群中LncRNA CASC2的表達水平，從而預測膠質瘤患者的患病風險，篩查高危人群,并對膠質瘤患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。本發(fā)明對膠質瘤早期診斷特異性好(圖3)，可達85.7%，靈敏度可達97.1 %，只需在Exosomes提取RNA即可檢測LncRNA CASC2的表達水平，操作簡單，穩(wěn)定性好。不僅可用于膠質瘤的早期診斷而且可以用于膠質瘤患者的大規(guī)模篩查和患病風險的預測，為膠質瘤的早期診斷和預測提供了強有力的技術支持，具有深遠的臨床意義和推廣性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為實時熒光定量PCR分析LncRNA CASC2在膠質瘤組織與正常腦組織中的表達
差異;
[0020]圖2為實時熒光定量PCR分析Exosomes來源的LncRNA CASC2在膠質瘤患者與正常人中的表達差異；
[0021]圖3為Roc分析Exosomes來源的LncRNA CASC2對膠質瘤早期診斷的特異性,靈敏性。
【具體實施方式】
[0022]以下結合實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0023]實施例1制備長鏈非編碼RNA CASC2用于膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者預后的試劑盒(50次反應)
[0024]1.RNA 穩(wěn)定溶液 50ml
[0025]2.異丙醇 100mL
[0026]3.三氯甲烷 100mL
[0027]4.Trizol50ml
[0028]5.無酶水 IOml
[0029]6.1 μ M隨機逆轉錄引物50ul
[0030]7.5 X逆轉錄緩沖液200ml
[0031 ] 8.1OmM三磷酸堿基脫氧核苷酸IOOul
[0032]9.40U/ μ I RNA 酶抑制劑 500ul
[0033]10.200U/ μ I MMLV 逆轉錄酶 50ul
[0034]11.Premix Ex Taq50ul
[0035]12.10 μ M LncRNA PRKAG2實時熒光定量PCR特異性引物30ul
[0036]CASC2 正向引物 5' -TTGACCCTTCCAGCTTCC-3'，
[0037]CASC2 反向引物 5' -CCATCCGCACATCACAAT-3'，
[0038]13.10 μ M U6snRNA 特異性引物 30ul
[0039]正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0040]正向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
[0041]實施例2
[0042]LncRNA CASC2在膠質瘤組織與正常腦組織中的表達差異的驗證
[0043]1、收集待測膠質瘤組織放入盛有RNA穩(wěn)定溶液的凍存管中，放至_80°C冰箱備用。
[0044]2、組織中RNA的抽提:取適量標本于經180°C烘烤6_8h后的研缽中加入液氮研磨標本，研磨至粉末狀后于研缽中加入1ml Trizol研缽標本,研磨成液體狀后用移至tube管，加氯仿200μ 1/mlTrizol于Tube中，用手震蕩15_30s，冰上放置5min，4°C 12000g離心15min ;小心取上層水相入新tube中，加入預冷的異丙醇0.5ml/mlTrizol混勻,_20°C冰箱靜置20min，4°C 12000g離心10min ;棄上清，加入75% DEPC水稀釋的乙醇l_2ml混勻，40C 7500g離心5min，盡量棄上清，室溫干燥5_10min，加入DEPC水10-20 μ I溶解RNA。分光光度計測RNA的濃度及質量，0D260/280比值在1.8-2.0之間，_80°C保存。
[0045]3、LncRNA CASC2逆轉錄:使用Thermo公司的逆轉錄試劑盒。20 μ L逆轉錄反應的
體系如下:
[0046]
成分_量/管
隨機逆轉泌引_(I PM) Ipl
KNA樣木2ug
無,水To 12 P I
[0047]逆轉錄第一步條件:65°C 5分鐘
[0048]
【權利要求】
1.血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNACASC2的應用方法，其特征在于，所述的血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA CASC2用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑，該長鏈非編碼RNA CASC2的序列見SEQ NO:1。
2.根據權利要求1所述的長鏈非編碼RNACASC2的應用方法，其特征在于，所述的用于制備膠質瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質瘤患者的預后制劑包括實時熒光定量PCR檢測試劑。
3.根據權利要求2所述的長鏈非編碼RNACASC2的應用方法，其特征在于，其特征在于，所述的實時熒光定量PCR檢測試劑包括進行實時熒光定量PCR的特異性引物: LncRNA CASC2 正向引物 5' -TTGACCCTTCCAGCTTCC-3'， LncRNA CASC2 反向引物 5' -CCATCCGCACATCACAAT-3'。
4.根據權利要求3所述的長鏈非編碼RNACASC2的應用方法，其特征在于，所述的實時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒， 該試劑盒包括: (I)從膠質瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNACASC2逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及LncRNACASC2所用隨機引物；(3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括LncRNA CASC2實時熒光定量PCR特異性引物、U6snRNA內參特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水；LncRNA CASC2實時熒光定量PCR特異性引物: 正向引物 5' -TTGACCCTTCCAGCTTCC-3'， 反向引物 5' -CCATCCGCACATCACAAT-3'， U6snRNA內參特異性PCR引物: 正向引物為 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'， 正向引物為 5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
【文檔編號】C12Q1/68GK103993088SQ201410225076
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權日:2014年5月26日
【發(fā)明者】武明花, 劉長紅, 余志斌, 徐剛, 李桂源 申請人:中南大學