血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA LINC00470的應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血清外泌體(Exosomes)來源的長鏈非編碼RNA(long?no-coding?RNA，LncRNA)LINC00470的應(yīng)用方法，即血清Exosomes來源的LncRNA?LINC00470用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑。通過研究證實在膠質(zhì)瘤患者血清中分離Exosomes后提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行實時熒光定量分析發(fā)現(xiàn)LncRNA?LINC00470表達(dá)水平下調(diào)。本發(fā)明利用血清Exosomes來源的LncRNA?LINC00470對膠質(zhì)瘤早期診斷的特異性可達(dá)85.7％，靈敏度達(dá)到94.1％。通過檢測膠質(zhì)瘤患者血清Exosomes中LncRNA?LINC00470的表達(dá)水平，從而對膠質(zhì)瘤患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。
【專利說明】血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA LI NC00470的應(yīng)用方
法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及血清Exosomes來源的LncRNALINC00470在膠質(zhì)瘤診斷中的應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠質(zhì)瘤約占所有原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的60%，可發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的任何部位和任何年齡，手術(shù)切除是首選的治療方法。由于膠質(zhì)瘤多呈浸潤性生長無明確的邊界，手術(shù)難以真正徹底切除，而且術(shù)后局部復(fù)發(fā)率高，雖然近年來影像學(xué)診斷技術(shù)不斷發(fā)展，顯微神經(jīng)外科技術(shù)得到應(yīng)用，但是膠質(zhì)瘤的診斷和治療總體上并沒有明顯的進(jìn)步，大多在確診后數(shù)年死亡。目前，對膠質(zhì)瘤的早期確診和規(guī)范治療還難以令人滿意，因此，尋找無創(chuàng)傷性的膠質(zhì)瘤早期診斷標(biāo)志物對高危人群進(jìn)行篩查，以便對膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行早期診斷、早期治療，提高患者生存率，一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的主要任務(wù)。[0003]Exosomes是一類直徑為30_150nm的囊泡，含有RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等成分。在血液，唾液，尿液，腦脊液和母乳等多種體液中均有存在，可在體液中來回穿梭，在細(xì)胞之間運送遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)。腫瘤在生長過程中會不斷地將Exosomes釋放到周圍環(huán)境中去，同時Exosomes可以在4°C條件下保存96小時或是_70°C下保存更長時間，而且通過在血清中分離Exosomes進(jìn)行膠質(zhì)瘤診斷克服了直接利用血液提取分子進(jìn)行腫瘤診斷的血液中非檢測物質(zhì)的影響，使檢驗結(jié)果更加真實，精確。這些特點使得Exosomes有助于腫瘤的早期診斷和預(yù)后判斷。通過研究在膀胱癌患者尿液來源的Exosomes中發(fā)現(xiàn)了 PCA-3，TMPRSS2兩個生物標(biāo)志物；在黑色素瘤患者血漿Exosomes中腫瘤相關(guān)標(biāo)志物CAVl表達(dá)水平明顯增加，以此可診斷黑色素瘤，在肺癌模型發(fā)現(xiàn)Exosomes中的miRNA可作為肺癌的標(biāo)志物。利用Exosomes來源的LncRNA LINC00470來診斷腦膠質(zhì)瘤不但能更好的對膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行診斷，提早治療，而且使得檢驗結(jié)果更加靈敏，特異。以上顯示出血清Exosomes來源的LncRNALINC00470在膠質(zhì)瘤早期診斷和篩查中的巨大潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種血清Exosomes來源的LncRNA LINC00470 (longintergenic non-protein coding RNA470)定位于染色體 18pll, GeneBank 登錄號:NR-023925的應(yīng)用方法，尤其是一種能夠用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑的應(yīng)用方法。研究證實血清Exosomes來源的LncRNA LINC00470可用于膠質(zhì)瘤患者的診斷，Exosomes來源的LncRNA LINC00470表達(dá)下調(diào)與膠質(zhì)瘤組織驗證結(jié)果具有一致性，且檢驗結(jié)果的靈敏性高，特異性好。因此Exosomes可用于膠質(zhì)瘤高危人群的篩查和早期診斷和預(yù)后。
[0005]血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA LINC00470的應(yīng)用方法，所述的血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA LINC00470用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑，該長鏈非編碼RNA LINC00470的序列見SEQ NO:1。
[0006]所述的用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑包括實時熒光定量PCR檢測試劑。
[0007]所述的實時熒光定量PCR檢測試劑包括進(jìn)行實時熒光定量PCR的特異性引物:
[0008]Lnc RNA LINC00470 正向引物:5' -AAACGGTCAAGAAGAAGTCA-3'，
[0009]Lnc RNA LINC00470 反向引物::5' -CTGTTGCTCAGCGTGTAGGA-3'。
[0010]所述的實時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒，
[0011]該試劑盒包括:(I)從膠質(zhì)瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNA LINC00470逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所 用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及LncRNA LINC00470所用隨機引物；(3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括LncRNALINC00470實時熒光定量PCR特異性引物、U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水；
[0012]LncRNA LINC00470實時熒光定量PCR特異性引物:
[0013]LINC00470 正向引物 5’ -AAACGGTCAAGAAGAAGTCA-3’
[0014]LINC00470 反向引物 5’ -CTGTTGCTCAGCGTGTAGGA-3’
[0015]U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物:
[0016]正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0017]正向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
[0018] 申請人:通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn)Lnc RNA LINC00470在52例膠質(zhì)瘤組織與12例正常人的腦組織中存在差異性表達(dá)(P = 0.0449)(圖1)，且在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步在血清中分離Exosomes用于LncRNA LINC00470的檢測，發(fā)現(xiàn)LncRNA LINC00470的表達(dá)與正常人的表達(dá)存在明顯的差異(P = 0.0455)(圖2)，且與組織中的檢測結(jié)果相一致。此方法可以檢測各人群中LncRNA LINC00470的表達(dá)水平，從而預(yù)測膠質(zhì)瘤患者的患病風(fēng)險，篩查高危人群，并對膠質(zhì)瘤患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。本發(fā)明對膠質(zhì)瘤早期診斷特異性好(圖4)，可達(dá)85.7 %，靈敏度可達(dá)94.1 %，只需在Exosomes提取RNA即可檢測LncRNALINC00470的表達(dá)水平，操作簡單，穩(wěn)定性好。不僅可用于膠質(zhì)瘤的早期診斷而且可以用于膠質(zhì)瘤患者的大規(guī)模篩查和患病風(fēng)險的預(yù)測，為膠質(zhì)瘤的早期診斷和預(yù)測提供了強有力的技術(shù)支持，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為實時熒光定量PCR分析LncRNA LINC00470在膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中的表達(dá)差異；
[0020]圖2為實時熒光定量PCR分析Exosomes來源的LncRNA LINC00470在膠質(zhì)瘤患者與正常人中的表達(dá)差異；
[0021]圖3為Roc分析Exosomes來源的LncRNA LINC00470對膠質(zhì)瘤早期診斷的特異性，
靈敏性。
【具體實施方式】[0022]以下結(jié)合實施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0023]實施例1制備長鏈非編碼RNA LINC00470用于膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的試劑盒(50次反應(yīng))
[0024]1.RNA 穩(wěn)定溶液 50ml
[0025]2.異丙醇 100mL
[0026]3.三氯甲烷 100mL
[0027]4.Trizol 試劑 50ml
[0028]5.無酶水 IOml
[0029]6.1 μ M隨機逆轉(zhuǎn)錄引物50ul [0030]7.5 X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液200ml
[0031]8.1OmM三磷酸堿基脫氧核苷酸IOOul
[0032]9.40U/ μ I RNA 酶抑制劑 500ul
[0033]10.200U/ μ I MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 50ul
[0034]11.Premix Ex Taq 50ul
[0035]12.10 μ M LncRNA LINC00470 實時熒光定量 PCR 特異性引物 30ul
[0036]LINC00470 正向引物 5’ -AAACGGTCAAGAAGAAGTCA-3’
[0037]LINC00470 反向引物 5’ -CTGTTGCTCAGCGTGTAGGA-3’
[0038]I3.10 μ M U6SnRNA 特異性引物 3Oul
[0039]正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0040]正向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
[0041]實施例2
[0042]LncRNA LINC00470在膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中的表達(dá)差異的驗證
[0043]1、收集待測膠質(zhì)瘤組織放入盛有RNA穩(wěn)定溶液的凍存管中，放至_80°C冰箱備用。
[0044]2、組織中RNA的抽提:取適量標(biāo)本于經(jīng)180°C烘烤6_8h后的研缽中加入液氮研磨標(biāo)本，研磨至粉末狀后于研缽中加入1ml Trizol研缽標(biāo)本,研磨成液體狀后用移至tube管，加氯仿200μ 1/mlTrizol于Tube中，用手震蕩15_30s，冰上放置5min，4°C 12000g離心15min ;小心取上層水相入新tube中，加入預(yù)冷的異丙醇0.5ml/mlTrizol混勻,_20°C冰箱靜置20min，4°C 12000g離心10min ;棄上清，加入75% DEPC水稀釋的乙醇l_2ml混勻，40C 7500g離心5min，盡量棄上清，室溫干燥5_10min，加入DEPC水10-20 μ I溶解RNA。分光光度計測RNA的濃度及質(zhì)量，0D260/280比值在1.8-2.0之間，_80°C保存。
[0045]3>LncRNA LINC00470逆轉(zhuǎn)錄:使用Thermo公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。20 μ L逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系如下:
[0046]


j劑量/管
隨機逆轉(zhuǎn)錄引物(?μΜ) TTl
RNA樣本2ug
無酶水Το12μ I[0047]逆轉(zhuǎn)錄第一步條件:65°C 5分鐘
[0048]
【權(quán)利要求】
1.血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNALINC00470的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA LINC00470用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑，該長鏈非編碼RNA LINC00470的序列見SEQ NO:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長鏈非編碼RNALINC00470的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑包括實時熒光定量PCR檢測試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長鏈非編碼RNALINC00470的應(yīng)用方法，其特征在于，其特征在于，所述的實時熒光定量PCR檢測試劑包括進(jìn)行實時熒光定量PCR的特異性引物: Lnc RNA LINC00470 正向引物:5' -AAACGGTCAAGAAGAAGTCA-3'， Lnc RNA LINC00470 反向引物::5' -CTGTTGCTCAGCGTGTAGGA-3'。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的長鏈非編碼RNALINC00470的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的實時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒， 該試劑盒包括:(I)從膠質(zhì)瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNA LINC00470逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及LncRNA LINC00470所用隨機引物；(3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括LncRNALINC00470實時熒光定量PCR特異性引物、U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水； LncRNA LINC00470實時熒光定量PCR特異性引物:
LINC00470 正向引物 5’ -AAACGGTCAAGAAGAAGTCA-3’
LINC00470 反向引物 5’ -CTGTTGCTCAGCGTGTAGGA-3’ U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物: 正向引物為 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'， 正向引物為 5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
【文檔編號】C12N15/11GK103981271SQ201410225278
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】武明花, 劉長紅, 余志斌, 徐剛, 李桂源 申請人:中南大學(xué)